人类胱氨酸结多肽的制作方法

专利名称：人类胱氨酸结多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码新型多肽的多核苷酸、由该多核苷酸编码的蛋白质以及表达该蛋白质的重组细胞。
来源于脑垂体的促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)和促甲状腺素以及来源于胎盘的人绒毛膜促性腺激素(hCG)属于糖蛋白激素家族。这些激素具有异二聚体结构并且含有两个非共价连接的α和β亚基。所述α亚基的氨基酸序列相同，而β亚基的氨基酸序列不同而且赋予各促性腺激素以生物学特异性(Ulloa-Aquirre，1988，1995)。二聚体被证实具有生物学活性。α和β亚基都被糖基化并且含有N-连接的糖链。HCG在C-末端肽上含有四个附加的O-连接的糖。
FSH，LH和TSH存在于大多数脊椎动物体内并且通过脑垂体进行合成和分泌。目前只在包括人在内的灵长类和马中发现有CG存在并且CG是通过胎盘组织合成的。
在一个物种内，糖蛋白激素家族中的每个成员的α亚基基本相同；从种到种之间，α亚基也是高度保守的。每个成员，即CG，FSH，TSH和LH的β亚基不相同，但却显示出相当高的结构同源性。而且，从种到种之间，β亚基也是高度保守的。在人体中，成熟的α亚基由92个氨基酸残基组成，而每个成员的β亚基大小不同在hFSH中，由111个残基组成，在hLH中，由121个残基组成，在hTSH中，由118个残基组成以及在hCG中，由145个残基组成(Combarnous，Y.(1992)，内分泌综述(Endocrine Reviews)，13，670-691，Lustbader，J.W.等(1993)，内分泌综述(Endocrine Reviews)，14，291-311)。hCG的β亚基比其它β亚基大的多，其在C-末端具有被本文称作羧基末端蛋白(CTP)的34个附加氨基酸。
异二聚体的两个亚基具有多个保守的亚基内二硫键在α亚基内具有五个二硫键，而在β亚基内具有六个二硫键。促性腺激素家族的所有成员中，相应的半胱氨酸残基是完全保守的。在hCG的β亚基内，二硫键在9-57；23-72，26-110，34-88，38-90和93-100位点上的半胱氨酸之间形成。hCG的X-射线结构表明这些二硫键与被称作二硫结(knots)的典型三维模式相关联。所述激素具有三个或四个能被N-糖基化的天冬酰胺残基。另外，hCG的C-末端肽(CTP)可以在四个丝氨酸位点被O-糖基化。
所述糖蛋白激素在包括新陈代谢、体温调节和生殖过程在内的多种身体功能中起着重要的作用。例如脑垂体促性腺激素FSH在刺激卵泡发育和成熟的过程中起着关键的作用，而LH诱导排卵(Sharp，R.M.(1990)，临床内分泌学(Clin Endocrinol.)，33，787-807；Dorrington和Armstrong(1979)，激素研究的最新进展(Recent Prog.Horm.Res.)，35，301-342)。目前，FSH在临床上已单独或与LH活性联合用于刺激卵巢，即对卵巢进行过度刺激以进行体外受精(IVF)和在不育无排卵妇女中诱导体内排卵(Insler，V.(1988)，国际生育杂志(Int.J.Fertility)，33，85-97，Navot和Rosenwaks(1988)，体外受精胚胎转移杂志(J.Vitro Fert.Embryo Transfer)，5，3-13)，以及用于雄性性腺机能减退。受控制的超排卵的目的在于增加可收回的成熟卵母细胞的数目以用于IVF以及随后的胚胎转移(ET)。通常，每次转移多达三个胚胎被替换。由于通常必须进行多于一次的处理，所以在大多数不育症诊所中将多余的胚胎或受精的卵母细胞冷冻并在后来的循环中进行转移。
TSH可用于需要补充甲状腺素的患者，例如用于甲状腺部分或全部切除了的甲状腺癌病人。
已经制备出所有亚基的基因组和cDNA克隆并且已经解析出它们的初级结构。而且，已经用人促性腺激素亚基基因转染了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞并且已经证实了这些细胞能够分泌完整的二聚体(例如Keene等(1989)，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)，264，4769-4775；Van Wezenbeek等(1990)，从克隆到临床(From clone to Clinic)(eds Crommelin D.J.A.和Schellekens H.，245-251))。
原则上，受精的调控可在几个阶段受到影响，例如卵泡募集，卵泡形成，植入和维持妊娠。
由于选择性机制，离开原始库的卵泡中只有一个卵泡到达排卵前期，即优势卵泡，并提供一个健康的、可受精的卵母细胞。其它卵泡则闭锁和退化。控制优势卵泡选择的机制还不完全清楚，但是已经假设对FSH最敏感的卵泡就成为优势卵泡。已经知道，除了促性腺激素，最佳卵泡和卵母细胞的发育还需要其它因子。卵泡的生长受到生长因子如IGF-1和GDF-9的调控，在后期其生长受到促性腺激素FSH和LH的调控，以及受到雌激素的调控。调节因子还涉及卵泡停滞(arrest)，早期卵泡募集，卵泡生长，anthral形成和排卵过程的调控。并且这些调节因子影响胚胎在子宫中的植入并涉及雄性体内精子发生的调控。
需要识别涉及雌性和雄性生育不同阶段的因子。这种因子可用于体内或体外治疗方案。
本发明提供了这种因子。更具体地说，本发明提供了一种含有SEQID NO1编码序列的多核苷酸序列。
全长的基因序列可用于制备在合适宿主细胞中表达所述蛋白因子的载体分子。全长基因或其变异体可以从天然来源的cDNA或基因组DNA中提取或利用已知方法合成。
本发明还包括如SEQ ID NO1所示的全长mRNA序列。该mRNA含有一个对应于SEQ ID NO1的核苷酸序列101-490的可读框。该序列编码具有130个氨基酸的前体蛋白(SEQ ID NO2)。并且，为了适应密码子的可变性，本发明还包括编码与本文公开的序列相同的氨基酸序列的序列。编码功能性多肽的部分编码序列及其等位基因和种变异也属于本发明的一部分。有时，一个基因在特定组织中表达为剪接变异体，导致产生改变的5’或3’mRNA或者包含或除外一个或多个外显子序列。预测这些序列以及由这些序列编码的蛋白质都具有相同或相似的功能并且也构成本发明的一部分。
具体地，SEQ ID NO3代表一种特殊的剪接变异体，该剪接变异体与SEQ ID NO1的不同点在于插入了128个核苷酸。该剪接变异体进行翻译的结果产生了SEQ ID NO2所示蛋白质的截短型，如SEQ ID NO4所示。
目前已经发现这些序列特异性地在脑垂体和子宫内膜中表达。
本文提供的序列信息不应仅仅被解释为需要除外错误识别的碱基。本文公开的特定序列可方便地用于分离几个物种的全长基因。
因此，一方面，本发明提供了编码一种新型蛋白激素的分离的多核苷酸。
术语“分离的”表示所述多核苷酸已从其天然环境中取出并由此处于一种适用于遗传工程蛋白生产系统的形式。
本发明的DNA可以从cDNA获得。所述组织优选来源于人。优选从脑垂体、胎盘或子宫内膜分离核糖核酸。或者，所述编码序列可以是基因组DNA，或是利用DNA合成技术制备的。所述多核苷酸还可以是RNA的形式。如果多核苷酸是DNA，那么其可以是单链的或双链的形式。所述单链可以是编码链或非编码(反义)链。
本发明的多肽能够作为单体存在。然而，二聚体形式的肽也属于本发明的一部分。这种二聚体是由两个相同多肽组成的同源二聚体，或者作为一种选择，是异二聚体复合物。优选这种二聚体由本发明的多肽与促性腺激素家族的共同α亚基联合组成。作为一种选择，还可构想含有本发明多肽序列的功能性部分的嵌合蛋白。这种嵌合构建体可以通过连接编码异二聚体复合物的亚基的DNA而方便地制得，其中通过一个PCT申请WO96/05224中记载的接头连接。类似地，可以制备双功能的糖蛋白，其中本发明的亚基通过接头共价连接到糖蛋白激素家族的其它成员上。这种构建体的实例在PCT申请WO99/25849中描述。
本发明还涉及具有微小变异或具有多态位点的多核苷酸。具有微小变异的多核苷酸编码保留与天然成熟蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。多态位点用于诊断目的。
这种多核苷酸可以通过在优选高度严格条件下的杂交来进行鉴定。根据本发明，术语“严格”是指在65℃的温度下1×SSC，0.1％SDS的洗涤条件；高度严格条件指的是SSC降低至0.3×SSC，更优选至0.1×SSC。优选头两次冲洗相继进行两次，每次15-30分钟。如果需要在高度严格条件下洗涤，那么用0.1×SSC再进行一次洗涤15分钟。杂交可以在例如65℃下0.5M磷酸缓冲液pH7.5/7％SDS中进行过夜。
因此，本发明还包括序列发生了变异却仍保留了功能特征的含有SEQ ID NO1的多肽或其部分的功能等同物。
本发明的DNA对于体内或体外大量地且以基本纯的形式表达本发明的新型多肽非常有用。
一个序列中发生的变异可以表现为全长序列中的氨基酸差异或所述序列中氨基酸的缺失、替换、插入、倒置或增加。预计基本上不改变生物学和免疫学活性的氨基酸替换已经被记载。相关氨基酸间的氨基酸替换或在进化过程中经常发生的替换具体地是Ser/Ala，Ser/Gly，Asp/Gly，Asp/Asn，Ile/Val(参见Dayhof，M.D.，蛋白序列和结构图谱(Atlas of protein sequence and structure)，国家生物医学研究基金(Nat.Biomed.Res.Found.)，华盛顿D.C.，1978，第5卷，增刊3)。基于这些知识，Lipman和Pearson研究出了一种用于快速和灵敏地进行蛋白比较的方法(科学(Science)，1985，227，1435-1441)以确定同源多肽间的功能类似性。非常明显，编码这种变异体的多核苷酸也属于本发明的一部分。
因此，另一方面，本发明提供了含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽以及具有70％，优选90％，更优选95％，甚至更优选98％相似性的多肽。
使用NCBI-BLASTX 2.0.4[Feb-24-1998](Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zhang，ZhengZhang，Webb Miller，和Dayid J.Lipman(1997)，″缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白数据库检索程序(Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation of prote in database search programs)″，核酸研究(Nucleic Acids Res).253389-3402)用默认设置查寻序列对比。对于氨基酸对比用BLOSUM62矩阵作为默认而相似性表示为阳性数。低组成复杂度过滤(filtering of low compositionalcomplexity)没有被包括在内。
优选地，所述多肽在与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸位点36，50，60和64对应的位点上含有半胱氨酸残基。甚至更优选地，半胱氨酸残基存在于与SEQ ID NO2的氨基酸位点84，99，115，117，120和12 7对应的位点上。与某一位点对应表示当序列被最佳排列时，与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的对照序列成一线的第二个序列中的位点。因此，与糖蛋白激素家族的β亚基相比，所述多肽能够在相应的位点上形成除所谓的安全带二硫键(在βhCG的相应位点26-110上)之外的全部二硫键。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的蛋白是一种前体蛋白并且在分泌过程中受到蛋白酶剪切。所述成熟蛋白也属于本发明的一部分。SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的蛋白以及所述成熟蛋白可以进行翻译后的修饰，例如糖基化。这种经修饰的蛋白也属于本发明的一部分。
应当理解本发明还包括了仍然能够带来生物学效应的这种多肽的部分。特别是仍然与靶向物结合的部分也属于本发明的一部分。这种蛋白或其功能性部分本身可以是功能性的，例如以溶解的形式，或者通过已知的生物技术方法或通过化学合成可以将其与其它多肽连接(例如，CTP，WO90/09800)从而获得嵌合蛋白。这种蛋白还可通过阻止靶向物与体内天然蛋白相互作用而用作治疗剂。因此，这种经改变的蛋白可被用作其天然功能的兴奋剂或拮抗剂。出于这方面的考虑，抗本发明蛋白的抗体也属于本发明的一部分。这种抗体可以通过传统的杂交瘤技术或重组DNA技术来制备(抗体，实验室指南(Antibodies，Alaboratory manual)，1988，冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory))。
或者，可通过利用反义核酸形成三股螺旋(Cooney等，1988，科学(Science)，241，456-459)或通过与mRNA结合达到蛋白表达水平的下调。这本身还能产生对生育的调节即避孕或治疗不育。
本发明包括其编码序列中含有上文所示多肽的所有分离的多核苷酸。许多种类的宿主细胞和克隆载体组合可以被有效地用于克隆编码本发明多肽的核酸序列。
合适的表达载体是例如细菌质粒或酵母质粒、宽宿主范围的质粒和由质粒和噬菌体或病毒DNA组合得到的载体。还包括来源于染色体DNA的载体。而且本发明的载体中可含有一个复制起点和/或显性选择标记。本发明的载体适合于转化宿主细胞。
如果是二聚体蛋白，可以使用类似的克隆载体将第二个亚基插入到宿主细胞中。亚基可以由不同的载体编码也可以由单一载体编码。
用于表达本发明的蛋白或其部分的载体还含有可操作性连接至编码所述蛋白的核酸序列的控制序列。这种控制序列通常含有一个启动子序列和调节和/或增强表达水平的序列。当然控制序列和其它序列可以根据所选择的宿主细胞而不同。
含有本发明的DNA的重组表达载体以及用所述DNA或所述表达载体瞬时或稳定转染的细胞也属于本发明的一部分。
本发明的合适宿主细胞是细菌宿主细胞、酵母菌和其它真菌、植物或动物宿主如中国仓鼠卵巢细胞或猴细胞。因此，含有本发明的DNA或表达载体的宿主细胞也在本发明的范围内。基因工程宿主细胞可以在常规的营养培养基中培养，可以对该培养基进行改变以用作例如合适的选择、扩增或转录诱导。培养条件如温度、pH、营养成分等对于本技术领域的技术人员来说是熟知的。
用于制备本发明的DNA或载体以及用所述DNA或载体转化或转染宿主细胞的技术是本技术领域中标准的和熟知的技术，参见例如Sambrook等，分子克隆实验室指南(Molecular CloningAlaboratory Manual).第二版，冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)，纽约州，冷泉港(Cold Spring Harbor，NY)，1989。
按照已知方法培养含有编码所述多肽的载体的宿主细胞并且回收目的多肽能够生产出本发明的多肽。二聚体蛋白可以类似地从用编码第二种蛋白的附加载体转染的培养细胞中分离得到或通过培养用编码两种亚基的单一载体转染的细胞而分离得到。
本发明的多肽可以通过普通的生物化学纯化方法从重组细胞培养物中回收纯化，所述生物化学纯化方法在以下著作中记载蛋白质纯化指南(Guide to Protein purification)，Murray P.Deutscher编辑(1990)，酶学方法(Methods in Enzymology).第182卷，AcademicPress，inc.San Diego CA 92101.Harcourt Brace Jovanovich出版社，所述生物化学纯化方法包括硫酸铵沉淀、提取、层析如疏水作用层析、阳离子或阴离子交换层析或亲和层析和高效液相层析。如果需要，还可包括蛋白重折叠步骤。或者所述蛋白可作为一种含有可用于亲和纯化的(″标记物″)的融合蛋白被表达和纯化。
本发明的多肽可用于调控卵泡停滞和募集。募集的抑制可用以延迟(过早的)绝经或作为一种避孕方法。另外，这种多肽可用于例如来自冷冻卵巢组织的卵泡的体外成熟和生长过程。
本发明的多肽还可用于检测和纯化与蛋白结合的受体。例如，所述多肽可被偶联到固相支持体上从而用于受体或抗激素抗体的亲和层析制备过程中。在筛选治疗候选药物的试验中所述受体本身可用于对候选药物评价激素活性。这种候选药物可以作为本发明多肽的激动剂或拮抗剂并因此可能提高胚胎的植入效率或阻止植入。
本发明还提供了一种药物组合物的配制，其包括将本发明的蛋白与药学上可接受载体混合。
药学上可接受载体是本技术领域的技术人员所熟知的，包括例如无菌生理盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、糊精、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和水。
而且本发明的药物组合物可以含有一种或多种稳定剂如包括山梨醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖糊精和葡萄糖在内的碳水化合物，蛋白质如白蛋白或酪蛋白，和缓冲剂如碱性磷酸盐。制备制剂和静脉内混合物的方法在Remingtons药物科学(Remingtons’s PharmaceuticalSciences)，1463-1497页(第16版.1980，Mack Publ.Co of Easton，Pa，美国)中记载。治疗剂量通常在0.1-100μg/kg体重/天的范围内，优选0.5-20μg/kg/天。
因此，本发明的蛋白可用于制备一种药物。所述药物将用于与生育相关的疾病或者用于避孕。
图2SEQ ID NO2分别与来源于猴、猪和兔的部分序列的序列对比。破折号表示没有获得序列信息。
图3用H & E(苏木精-伊红)染色的人组织系列切片的概观。
图4原位杂交a.与反义探针杂交的子宫内膜(分泌期)切片b.与有义探针杂交的子宫内膜(分泌期)切片c.与反义探针杂交的脑垂体(分泌期)切片d.与有义探针杂交的脑垂体(分泌期)切片为了获得对应所述新型基因的DNA片段，利用引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6在人类基因组DNA上进行PCR。获得一个具有预期大小142个碱基对的片段，将其克隆到PCR2.1载体中并进行测序。所述序列与基因组克隆的部分相同并且对应于SEQ ID NO1中337至478位核苷酸。
为了克隆包括完整可读框(ORF)的全长cDNA，我们进行了5’和3’RACE(cDNA末端的快速扩增)PCR试验。我们采用来源于人脑垂体的马拉松备用cDNA(Marathon-ready cDNA)(Clontech目录号7424-1)作模板。为了进行5’RACE，在第一个PCR中，使用了试剂盒中的AP1引物(SEQ ID NO7)和基因-特异性引物SEQ ID NO6并且以5微升脑垂体cDNA作为模板。为了进行3’RACE，类似地用引物SEQ IDNO7和SEQ ID NO5进行第一个反应。PCR方案如下94℃5分钟；5个循环94℃5秒钟/72℃4分钟；5个循环94℃5秒钟/70℃4分钟；25个循环94℃5秒钟/68℃4分钟；72℃5分钟；4℃下贮存。
接下来，利用第一次PCR体积的1％作为模板进行嵌套式PCR反应。这里使用了所述试剂盒中的引物AP2(SEQ ID NO8)和引物SEQ ID NO9进行5’RACE。使用引物SEQ ID NO8和SEQ ID NO10进行3’RACE。所述嵌套式反应利用Advantage 2 cDNA聚合酶试剂盒(C1ontech)按照以下方案进行94℃5分钟；20个循环94℃5秒钟/68℃4分钟；68℃5分钟；4℃下贮存。
在1.2％琼脂糖凝胶上分析PCR产物并在20×SSC中将该凝胶过夜印迹到Hybond N+硝酸纤维素膜上。在80℃下烘干2小时进行DNA交联。将印迹与上述142碱基对基因-特异性PCR片段杂交(在65℃下，于0.5M磷酸缓冲液pH7.5/7％SDS中过夜)。在65℃下在0.3×SSC/0.1％SDS中洗涤滤膜，然后在65℃下在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤。从所述凝胶上切下由5’RACE反应得到的大约480个碱基对的杂交片段，并利用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照厂家提供的说明书进行纯化。类似地，从3’片段RACE反应中分离出大约650个碱基对的杂交带。将两个片段克隆到pCR2.1载体中并进行测序。产生的5’和3’RACE片段具有所期望的重叠序列。5’片段序列对应SEQ ID NO1中的1至449位核苷酸。3’片段序列对应SEQ ID NO1中的377至917位核苷酸，接着是一段A-残基。SEQ ID NO1中未包括AP2序列以及大多数的聚腺苷酸片段。
为了证实得到的序列，利用两个引物一个在ATG翻译起始密码子的上游(SEQ ID NO11)而另一个在终止密码子的下游(SEQ ID NO12)进行PCR来扩增含有ORF的区域。以脑垂体cDNA为模板获得了作为主带的大约530个碱基对的预期片段(参见

图1)。该片段的序列对应SEQ ID NO1的第23至548位核苷酸并且与组合的RACE片段(的部分)的序列相同。
SEQ ID NO1含有一个编码130个氨基酸的可读框(第101至490位核苷酸)。ATG翻译起始密码子的上游存在一个框内终止密码子(第44至46位核苷酸)。一个多腺苷酸化信号(ATTAAA，第894至899位核苷酸)下游接着一个聚腺苷酸片段，其只是部分包含在SEQ ID NO1中。所述可读框含有10个半胱氨酸残基，其间隔与在βFSH、βLH、βhCG和βTSH中的间隔极其类似。所述读框中的氨基末端可能对应一个信号序列。能够注意到一些特征例如存在一段疏水残基以及在氨基末端的甲硫氨酸后面存在一个碱性氨基酸。
对SEQ ID NO1的完整序列与人基因组DNA序列的比较显示所述新型基因由三个外显子组成。外显子1对应于第1至99位核苷酸，外显子2对应于第100至304位核苷酸，外显子对应于第305至911位核苷酸。
图1显示除了预计的约530个碱基对的片段外，还得到了一个更长的第二个片段(约660个碱基对)。将该片段进行克隆并测序，结果证实该片段对应一个含有内含子的序列的剪接变体(对应于SEQ IDNO3)。其编码的蛋白如SEQ ID NO4所示。
为了证实所述新型基因在进化中是否保守，利用来源于猪、猴和兔的基因组DNA以及利用引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6进行PCR反应。获得了预期大小的片段并通过将纯化片段克隆到pCR2.1中并进行核苷酸测序来进行分析。所有三种序列与人类序列极度同源。当忽略用于PCR的引物序列时，所推测的氨基酸序列的对比显示出高度的序列保守性(参见图2)。
由500ng的模板起始，在DIG标记混合物(DIG-UTP，未标记的核苷酸，封闭试剂)、转录缓冲液、10mM DTT，1U/μl核糖核酸酶抑制剂和2-4U/μl合适的RNA聚合酶的存在下制备RNA探针(按照厂家提供的方案，Boehringer-Roche)。在37℃下温育2小时后加入约25mMEDTA(pH8.0)、400mM LiCl和过量的100％乙醇终止反应。将被标记的产物沉淀过夜，离心，用70％乙醇洗，然后重悬在含有核糖核酸酶抑制剂的H2O中。体外转录后，取少量探针在1.5％的琼脂糖凝胶上分析以确定体外转录成功。按照Boehringer-Roche方案并利用所推荐的试剂估算探针浓度。将一系列稀释度的被标记探针和已知浓度(10-0.01ng/ul)的对照DIG-RNA点在Hybond N+(Amersham)膜上。将该膜微波辐射2分钟。非特异结合被封闭后，将所述膜与抗-DIG碱性磷酸酶Fab’片段(anti-DIG-AP)一起温育30分钟。通过加入NBT/BCIP底物来启动染色并且染色持续至最低浓度的对照系被充分染色为止。通过比较探针与对照系的斑点强度来估测新标记的探针的浓度。原位杂交将组织切片在60℃下烘干2小时，在二甲苯中脱蜡并在递减浓度的乙醇中再水化。然后，将所述切片用0.2M HCl处理20分钟，用DEPC处理的Milli Q冲洗并在消化缓冲液(100mM Tris，50mM EDTA pH8)中于37℃下用蛋白酶K(1μg/ml)消化30分钟。在室温下(RT)将切片置于预冷的含0.2％甘氨酸的PBS中10分钟以终止消化反应。在0.1M三乙醇胺缓冲液中用0.25％的乙酸酐将所述切片乙酰化5分钟，然后用DEPC处理的Milli Q冲洗两次。在湿盒中于杂交温度下将切片与含有52％的甲酰胺、21mM Tris、1mM EDTA、0.33M NaCl、10％的葡聚糖硫酸脂、1×Denhardt溶液、100μg/ml鲑精DNA、100μg/ml tRNA和250μg/ml酵母总RNA的预杂交混合物进行预杂交。用一个玻璃盖玻片将所述切片盖住。两小时后，用含有预杂交混合物及下列添加物的探针杂交混合物替代预杂交混合物0.1mM DTT，0.1％的硫代硫酸钠，0.1％SDS和不同量的DIG-标记的探针。所述杂交在湿盒中于50℃下进行过夜(16小时)。
然后用2×SSC将所述切片冲洗15分钟，接着在杂交温度下用2×SSC，l×SSC和0.1×SSC各洗15分钟。在核糖核酸酶缓冲液(0.6MNaCl，20mM Tris，10mM EDTA)中于37℃下用核糖核酸酶A(20μg/ml)处理切片1小时。用预冷的PBS洗两次(5分钟，室温)和用缓冲液1(100mM马来酸，150mM NaCl)洗一次后，将所述切片与封闭液(含有1g/ml封闭剂的缓冲液1)一起温育30分钟。然后将所述切片与用封闭液按1∶500稀释的抗-DIG-AP(Boehringer/Roche)一起在室温下温育1小时。用缓冲液1洗两次(15分钟，室温)后，将所述切片的组织周围小心拭干，并用DAKO-pen(DAKO)将所述切片圈住。用NBT/BCIP显色剂(Boehringer/Roche)覆盖所述切片并在湿盒内于室温下温育。两小时后，用水漂洗所述切片，然后任选地用0.1％甲基绿复染30秒钟。用Kaiser甘油-明胶封固切片。
在所有试验中，使用了不同浓度(200和1000ng/ml)的反义和有义探针。所采用的杂交温度为50℃。显微镜评价原位杂交分析结果表明，与有义探针相比，用反义探针两种组织显示出显著染色。这两种组织是子宫内膜(参见图4a和4b)和脑垂体(参见图4c和4d)。所有其它组织都呈阴性。
序 列 表序列表<110>Akzo Nobel N.V.<120>新垂体激素<130>2000527<140><141><160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>917<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gacatttacc cagggcaaac ttctaccatt cattgtgact tcctgaaatc ttagtgcaag 60tttcagctct aaaagaagag tgggctcctg caagattagc atgaagctgg cattcctctt 120ccttggcccc atggccctcc tccttctggc tggctatggc tgtgtcctcg gtgcctccag 180tgggaacctg cgcacctttg tgggctgtgc cgtgagggag tttactttcc tggccaagaa 240gccaggctgc aggggccttc ggatcaccac ggatgcctgc tggggtcgct gtgagacctg 300ggagaaaccc attctggaac ccccctatat tgaagcccat catcgagtct gtacctacaa 360cgagaccaaa caggtgactg tcaagctgcc caactgtgcc ccgggagtcg accccttcta 420cacctatccc gtggccatcc gctgtgactg cggagcctgc tccactgcca ccacggagtg 480tgagaccatc tgaggccgct agctgctctc tgcagacccg cctgtgtgag cagcacatgc 540agttatactt cctggatgca agactgttta atttcgacca cacccatgga ggaggttacc 600tgtcgcccct taggtccagc tcaggcaaaa ggcccaaatg cagcctactt atgctaaaag 660ttcaaaacaa tattcgtgcc ttcaccaaaa taatttctcc agctcacata cctgcaaatt 720aatttttctt tgccttgagt cttggaacat aatttgtgta tcacaatcct cccccaattt 780ggacttataa tatgctaatg atttaaacac atgggatgta attaggatat ggggctggaa 840agtctttaaa ttctcatgtt ctatttaacc tctgatctcc aaccggattt atgattaaag 900ggctagaaat gaaaaaa 917<210>2<211>130<212>PRT<213>智人<400>2Met Lys Leu Ala Phe Leu Phe Leu Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Gly Tyr Gly Cys Val Leu Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu Arg Thr20 25 30Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu Phe Thr Phe Leu Ala Lys Lys Pro
35 40 45Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys50 55 60Glu Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala His65 70 75 80His Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu Thr Lys Gln Val Thr Val Lys Leu85 90 95Pro Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Val Ala100 105 110Ile Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu115 120 125Thr Ile130<210>3<211>1045<212>DNA<213>智人<400>3gacatttacc cagggcaaac ttctaccatt cattgtgact tcctgaaatc ttagtgcaag 60tttcagctct aaaagaagag tgggctcctg caagattagc atgaagctgg cattcctctt 120ccttggcccc atggccctcc tccttctggc tggctatggc tgtgtcctcg gtgcctccag 180tgggaacctg cgcacctttg tgggctgtgc cgtgagggag tttactttcc tggccaagaa 240gccaggctgc aggggccttc ggatcaccac ggatgcctgc tggggtcgct gtgagacctg 300ggagcttttg tcaagatgtc gtgtatgaac aaggcattca atacacattt gttggttgac 360tgggatggac ctccccctgg agctgtagat cctccagcct aatggaaggc catttagaat 420cacacttgca ctaaacccat tctggaaccc ccctatattg aagcccatca tcgagtctgt 480acctacaacg agaccaaaca ggtgactgtc aagctgccca actgtgcccc gggagtcgac 540cccttctaca cctatcccgt ggccatccgc tgtgactgcg gagcctgctc cactgccacc 600acggagtgtg agaccatctg aggccgctag ctgctctctg cagacccgcc tgtgtgagca 660gcacatgcag ttatacttcc tggatgcaag actgtttaat ttcgaccaca cccatggagg 720aggttacctg tcgcccctta ggtccagctc aggcaaaagg cccaaatgca gcctacttat 780gctaaaagtt caaaacaata ttcgtgcctt caccaaaata atttctccag ctcacatacc 840tgcaaattaa tttttctttg ccttgagtct tggaacataa tttgtgtatc acaatcctcc 900cccaatttgg acttataata tgctaatgat ttaaacacat gggatgtaat taggatatgg 960ggctggaaag tctttaaatt ctcatgttct atttaacctc tgatctccaa ccggatttat 1020gattaaaggg ctagaaatga aaaaa1045<210>4<211>75<212>PRT<213>智人<400>4Met Lys Leu Ala Phe Leu Phe Leu Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Gly Tyr Gly Cys Val Leu Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu Arg Thr20 25 30Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu Phe Thr Phe Leu Ala Lys Lys Pro35 40 45Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys50 55 60Glu Thr Trp Glu Leu Leu Ser Arg Cys Arg Val65 70 75<210>5<211>26<212>DNA<213>智人<400>5ccatcatcga gtctgtacct acaacg 26<210>6<211>23<212>DNA<213>智人<400>6ctccgtggtg gcagtggagc agg 23<210>7<211>27<212>DNA<213>智人<400>7ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>8<211>23<212>DNA<213>智人<400>8actcactata gggctcgagc ggc 23<210>9<211>25<212>DNA<213>智人<400>9agtcacagcg gatggccacg ggata25<210>10<211>25<212>DNA<213>智人<400>10actgtcaagc tgcccaactg tgccc25<210>11<211>23<212>DNA<213>智人<400>11ctaccattca ttgtgacttc ctg 23<210>12<211>23<212>DNA<213>智人<400>12gtataactgc atgtgctgct cac 23<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>13cgatttaggt gacactatag gcatgaagct ggcattcctc40<210>14<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>14cgtaatacga ctcactatag gggtctgcag agagcagcta gc 4权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其编码与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4具有至少70％相似性的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其编码与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的成熟多肽部分具有至少70％相似性的成熟多肽。
3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其与SEQ ID NO2或SEQ IDNO4具有至少90％，优选95％的相似性。
4.如权利要求1至3所述的多核苷酸，其中所述多肽在对应SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的36，50，60和64氨基酸位点的位置上含有氨基酸Cys。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其中所述多肽在对应SEQ IDNO2的84，99，115，117，120和127氨基酸位点的位置上含有氨基酸Cys。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，所述多核苷酸含有序列SEQ IDNO1或从SEQ ID NO1的101位核苷酸延伸到490位核苷酸的序列。
7.如权利要求4所述的多核苷酸，所述多核苷酸含有序列SEQ IDNO3或从SEQ ID NO3的101位核苷酸延伸到325位核苷酸的序列。
8.一种重组表达载体，其含有权利要求1至7所述的DNA。
9.由权利要求1至7所述的多核苷酸或权利要求8所述的表达载体编码的多肽。
10.一种用权利要求1至7所述的DNA或权利要求8所述的表达载体转染的细胞。
11.如权利要求10所述的细胞，其为表达权利要求9所述蛋白的转染细胞。
12.一种生产如权利要求9所述的多肽的方法，该方法包括在产生所述蛋白的条件下培养权利要求11所述的细胞，并且从培养物中回收所述蛋白。
13.一种药物组合物，该组合物含有与药学上可接受的载体相混合的权利要求9所述的多肽。
全文摘要
本发明涉及新鉴定的编码一种新型胱氨酸结多肽的DNA序列以及其编码的蛋白。本发明可用于生育领域。
文档编号A61P15/12GK1395580SQ01803827
公开日2003年2月5日 申请日期2001年1月17日 优先权日2000年1月18日
发明者S·莫塞尔曼, P·J·斯派克范德尔 申请人:阿克佐诺贝尔公司