专利名称：缺失型人白细胞介素11微小化变异体的制作方法
人体内的各种细胞因子均由特定组织细胞分泌，其中相当数量的细胞因子通过旁分泌起作用，血液中的含量甚微。作为药物应用的细胞因子必须达到一定的血药浓度才能满足局部生物靶细胞的需求。由于其自然来源十分有限，因此应用基因工程手段进行天然细胞因子的基因改造、重组表达和高效纯化，已是目前众多细胞因子在基础研究和临床应用上的重要手段。基因工程的改造主要包括基因的缺失、突变和融合，从而可以制备出多种形式的细胞因子衍生物。改造的目的除了要进行蛋白的结构与功能研究外，同时提高蛋白质的生物功效及减少体内毒副作用，使其更具有临床药物的开发价值。
人白细胞介素11(human interleukin-11，hIL-11)是具有多种生物功能的蛋白质。主要作用有刺激造血干细胞向巨核系细胞分化，促进巨核细胞增殖和成熟，增加外周血血小板数量，刺激B细胞的发育并提高其功能，保护胃肠粘膜细胞受损。天然成熟hIL-11由178个氨基酸组成，分子量为20Kd，是强碱性蛋白质(pI 11.7)，疏水性强。hIL-11 cDNA全长1100对碱基，其中5’端有72个碱基非编码区，3’端有431个碱基非编码区。阅读框架为597个碱基，翻译表达为199个氨基酸组成的hIL-11蛋白，其中N末端1～21个氨基酸是信号肽序列。
通过应用基因工程重组手段，对hIL-11的N末端进行了多种改造的尝试，分别得到了△1-8 IL-11、△1-9(Ala10)等人白细胞介素11变异体，与天然hIL-11相比其生物活性无改变。说明hIL-11的生物活性区不位于N末端。对hIL-11C末端缺失5个氨基酸的变异体改造，其生物活性丧失80％以上，证明人IL-11的生物活性区主要位于C末端。分析hIL-11的DNA全基因序列，其5个外显子的大小和间隔具有明显的特点。其中5’端第一个外显子只有9个核苷酸的编码区，编码3个氨基酸，紧接着由1338个核苷酸组成的第一个内含子。第二、第三、第四、第五个外显子分别编码57、29、54、53个氨基酸，其间的内含子分别由198、111、2121个核苷酸组成。除去N末端1～21个氨基酸的信号肽序列，△1-8 IL-11和△1-9(Ala10)变异体基因改造均处于第二个外显子的前端，提示该区编码的氨基酸序列存在与否对生物活性影响不大，即不影响蛋白质活性基团的形成和与受体结合位点的结构。本发明对hIL-11进一步缺失掉前二个外显子和第三个外显子编码的N末端1～68个氨基酸的改造，因其分子量较hIL-11减小38％，理论上的生物比活性将有增强。这是该专利改造设计的理论根据之一。另一方面，通过应用Goldkey软件对输入的hIL-11氨基酸序列进行二级结构预测分析，提示hIL-11由8个α-螺旋组成，占总氨基酸的40～50％，与文献值50％基本符合。N末端前三个α-螺旋分别由第12位～第20位、第25位～第33位、第40位～第51位氨基酸序列形成。第52位～第68位氨基酸序列为第三、四α-螺旋之间的β折叠区。由此可见，△1-8 IL-11和△1-9(Ala10)IL-11变异体所具有完全生物活性，并未影响hIL-11的二级结构α-螺旋。预示hIL-11可以进行缺失N端第一个、第二个和第三个α-螺旋的逐级缺失改造。第三个α-螺旋之后是β折叠和α-螺旋密集区，形成较复杂的蛋白质二级和三级结构。本发明中将hIL-11的基因组DNA序列外显子与hIL-11的二级结构作比较，第二个外显子正好编码第一和第二个α-螺旋区，第三个外显子正好编码第三个α-螺旋区和第一个β折叠区。第四个外显子编码第四、五、六个α螺旋区和第IIβ折叠区。第五个外显区编码第七、八个α螺旋区和第3至6的β折叠区。这是本专利改造设计的另一理论依据。
根据以上两种理论设计，首先改造了hIL-11 N末端缺失20个和39个氨基酸的变异体[△20 IL-11(以下称FK-20)和△39 IL-11(以下称FK-39)]，这两种变异体正好将hIL-11的第一个α-螺旋区和第二个α-螺旋区缺失掉，经体内外测定FK-20和FK-39具有完全的生物活性。在此基础上，改造了hIL-11N末端缺失68个氨基酸的变异体[△68 IL-11(以下称FK-68)]，此变异体正好将第二、三外显子编码的hIL-11前三个α-螺旋区缺失掉。
应用基因工程技术手段改造的缺失hIL-11N末端68个氨基酸变异体(以下称FK-68)，经重组融合表达、分离纯化而得。重组FK-68体内外试验证明除了具有天然hIL-11相同的生物功能外，尚具有升高外周血白细胞数量的功能。经动物实验证明重组FK-68在胃肠粘膜组织中有明显的分布，对损伤后的消化道粘膜具有愈合和保护作用。
由于基因工程技术的进步，应用原核表达体系、酵母表达体系、昆虫表达体系、哺乳动物细胞表达体系、转基因动物表达体系、转基因植物表达体系制备重组蛋白的方法越来越多。本发明中所述的人白细胞介素11缺失微小型变异体均可在这些体系中选择相应的表达载体和宿主进行重组表达。重组形式的缺失型人白细胞介素11变异体可以应用现有药物制剂技术制成各种剂型的药物，如针剂、片剂、胶囊、口服液以及脂质体或控、缓释剂型。
本专利所述IL-11N末端缺失68个氨基酸的微小化变异体，适应于治疗和预防骨髓抑制、胃肠粘膜损伤等相关性疾病，主要包括肿瘤病人放化疗后的支持治疗、骨髓移植、放射性骨髓和胃肠粘膜损伤、感染性和非感染性肠炎、继发性血小板减少症和继发性白细胞减少症等。
实例1 重组人△1-68 IL-11(FK-68)变异体融合表达系统的构建和测序选用含谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合表达质粒pGEX-4T-1(Pharmacia)作为构建的载体。根据人白细胞介素11的cDNA序列以及N末端缺失68个氨基酸的FK-68变异体要求，设计两对PCR引物。
Seq15’-GCGGA TCCGAC GAT GAC GATAAG CTC CCA GGT GTG CTGACA AGG CTG-3’。
Seq25’-GCGAA TTCTTA TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG CAG TAGCCC CCT CAC-3’。
在正链引物5’端引入BamH I酶切位点GGA TCC和肠激酶氨基酸识别位点DDDDK的碱基序列GAC GAT GAC GAT AAG，在反链引物5’端引入EcoRI酶切位点GAA TTC和两个终止密码子TAA TGA。以人的白细胞介素11全基因cDNA为模板，扩增出的FK-68基因片段经BamH I和EcoR I双酶切后与相同双酶切后的pGEX-4T-1大片段经T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α。筛选出含插入片段的重组子命名为pGEX-FK68，序列分析后可进行融合表达研究。
从pGEX-FK68中用BamH I和EcoR I双酶切下FK-68基因片段，与pBluescript经BamH I和EcoR I双酶切后的大片段相连，用蓝白斑法筛选出重组子，命名为pBSK-FK68。经全自动基因测序仪测序后得到插入的FK-68基因序列，结果与设计值完全一致。
实例2 重组人△1-68 IL-11(FK-68)变异体的重组表达和制备含FK-68基因的pGEX-FK68转化大肠杆菌BL21，在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(称LA培养基)中摇瓶过夜(37℃，200rpm)。再按1∶10接种LA培养基中，37℃培养3小时后，加入0.2mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，融合蛋白GST-FK68(38.5Kd)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的30％。
经发酵罐培养表达的发酵液，离心收集菌体，用50mM磷酸缓冲液(pH7.8)含1％Triton溶液混悬菌体，在室温下破菌20分钟，破菌液经超声波处理至无粘稠后离心去沉淀。上清经Glutathion-Sepharose(Pharmacia)进行亲和层析纯化，吸附在柱上的FK-68融合蛋白，用重组肠激酶(1∶500，w/w)室温下在位酶切4小时。酶切下的重组FK-68再经CM-Sepharose CL-4B和Q-Sepharose Fast Flow纯化，最终产物的纯度超过95％。
实例3 重组人△1-20 IL-11(FK-20)和△1-39 IL-11(FK-39)的重组表达构建和制备按照实例1和2中构建FK-68的重组表达和制备方法成功地构建了表达FK-20、FK-39的重组载体和工程菌，经发酵和亲和纯化、肠激酶酶切和离子交换层析后纯化而得重组的FK-20和FK-39。
实例4 重组人△1-68 IL-11(FK-68)变异体的理化性质本方法制备的重组人△1-68 IL-11变异体分子量为12 Kd，由110个氨基酸组成，其中无半胱氨酸。N末端测序证实是Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg AlaAsp Leu Leu Ser Tyr，与理论设计值完全一致。
用依赖于人白细胞介素11的细胞株B911的MTT方法测定，参照品是重组人白细胞介素11(rhIL-11)。测得本方法制备的重组FK-68比活性为1.5～2.0×108unit/mg，比重组人白细胞介素11的比活性高出1倍。重组FK-20的比活性为0.8-1.1×108Unit/mg，重组FK-39的比活性为0.9-1.2×108Unit/mg。用依赖于人G-CSF的细胞株NSF-60的MTT法测定，参照品为重组人G-CSF。测得重组FK-69的比活性为5.0×107unit/mg，是重组hG-CSF的生物活性的50％，证明重组FK-68具有刺激粒细胞增殖的生物作用。相同方法测定重组FK-20和FK-40则不能刺激NSF-60细胞的增殖。
实例5 重组人白细胞介素11缺失型变异体对正常昆明种小鼠的外周血血小板和白细胞数量的影响按FK-20、FK-39、FK-68将昆明种小鼠分三个药物试验组，一个生理盐水对照组。每个药物试验组分别设50μKD(50ug/kg/day)和100μKD(100ug/kg/day)二个剂量组，皮下注射，1次/日，连续给药7天。
表1.FK-20、FK-39和FK-68变异体对昆明种小鼠外周血血小板数量的影响外周血血小板数量(109/L)时间(天)对照组50uKD组100uKD组给药前987.8±122.9 906.6±113.7 983.3±99.8FK-20给药3天 872.0±100.3 966.6±132.8 999.24±134.7给药7天 1014±120.8 1171.2±129.0* 1134.8±122.3*停药3天 933.7±102.9 1312.5±117.9**# 1362.7±142.2**#FK-39给药3天 872.0±100.3 982.3±107.8 965.2±125.5给药7天 1014±120.8 1108.3±112.3* 1243.9±144.3**#停药3天 933.7±102.9 1325.4±184.2**# 1366.6±198.2**#FK-68给药3天 872.0±100.3 1010.3±132.1 997.1±132.4给药7天 1014±120.8 1275.4±139.4*#1287.5±169.3**#停药3天 933.7±102.9 1415.3±153.4**# 1483.2±213.6**#注与生理盐水对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与给药前比较，#P＜0.01FK-20、FK-39、FK-68 50μKD和100μKD剂量组在给药7天到停药3天之间，昆明种小鼠外周血血小板数量均有明显增加，与对照组比较差异显著(P＜0.05)，其中100μKD剂量组较50μKD剂量组增加更明显。两个剂量组均在停药后3天外周血血小板数量达到高峰。同时FK-68的50μKD和100μKD剂量组均较FK-20、FK-40对应剂量组增加显著。
表2.FK-20、FK-39和FK-68变异体对对昆明种小鼠外周血白细胞总数影响外周血血小板数量(109/L)时间(天)生理盐水对照组 50uKD组 100uKD组给药前 11.2±3.7 10.2±1.510.8±1.3FK-20 给药3天11.7±2.8 10.9±2.011.0±1.8给药7天9.7±1.311.1±2.112.0±2.0停药3天10.7±3.1 11.7±1.912.2±2.2FK-39 给药3天11.7±2.8 11.7±2.111.3±1.3给药7天9.7±1.312.1±1.211.8±1.7停药3天10.7±3.1 11.2±2.411.7±1.3FK-68 给药3天11.7±2.8 11.4±1.811.1±1.3给药7天9.7±1.312.3±2.312.9±1.9*停药3天10.7±3.1 13.4±1.6**# 14.2±3.1**#注与生理盐水对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与给药前比较，#P＜0.01FK-20和FK-39注射后对正常小鼠的外周血白细胞数量无明显改善，而FK-68 50μKD和100μKD剂量组在给药7天到停药3天之间，昆明种小鼠外周血白细胞总数均有明显增加，与对照组比较差异显著，其中100μKD剂量组较50μKD剂量组增加更明显。
实例6 重组人△1-68 IL-11(FK-68)变异体对肠型放射病小鼠胃肠道病理组织变化的影响(表7.)取4-6周Balb/c小鼠24只，随机分为4组空白对照组，模型对照组，给药高、低剂量组。给药组动物造模前1小时皮下注射给药0.1ml，剂量为100、250μg/kg，溶剂为生理盐水，对照组动物给予等体积生理盐水。给药组和模型对照组动物以Co60r射线全身一次性照射，照射剂率为2.5688Gy/min，剂量为25Gy。于造模后48小时取小肠不同部位(十二指肠、空肠、回肠)病检。
结果模型显示对照组小鼠出现体重下降，肠道充血、小肠缩短、肠腔扩张和肠粘膜坏死脱落等病理变化，而FK-68给药组动物病理变化的程度和范围较对照组明显减轻，其中尤以250μg/kg组的保护效果显著，有关结果见下表3表3.FK-68对给药后小鼠小肠的长度、宽度、粘膜完好率的变化组别长度(mm)宽度(mm) 粘膜完好率(％)空白对照51-53 4-6 100模型对照35-40 6-7 40-50低剂量组42-46 5-7 65-70高剂量组45-48 4-6 80-90实例7重组人△1-68IL-11(FK-68)变异体对Balb/c小鼠5-FU化疗模型外周血血小板和白细胞的影响取4-6周Balb/c小鼠，随机分成6组空白对照组、模型对照组、重组人G-CSF组、重组人IL-11组、重组FK-68两个剂量组。每只小鼠腹腔注射5-FU(5氟尿嘧啶)按100mg/kg，于注射的0天到7天给药。不同给药时间和停药后3天取外周血测定。实验结果见附图2，其中重组人G-CSF可显著增加外周血白细胞的数量，重组人IL-11可明显增加外周血血小板数量，重组FK-68可明显增加外周血血小板和白细胞的数量。
附图1人白细胞介素11的基因组序列与编码的蛋白质二级结构比较人IL-11基因含有5个外显子，分别编码3个、57、29、54和53个氨基酸。人IL-11蛋白二级结构中含有8个α螺旋和6个折叠区，其中第一、二个α螺旋是由12-20位和25-33氨基酸组成，由第二个外显子编码。第三个α螺旋由40-51位氨基酸组成，第三个和第四个α螺旋区由52-69位氨基酸组成，由第三个外显子编码。图中 表示外显子非编码区， 表示外显子编码区。
附图2FK-68对小鼠5-FU化疗模型的外周血小板和白细胞计数的影响A给药7天和停药后3天的小鼠外周血血小板数量的变化。
B给药7天和停药后3天的小鼠的外周血白细胞数量的变化。
其中rhIL-11给药剂量为100ug/kg。rhG-CSF的给药剂量为50ug/kg，FK-69的给药剂量为50ug/kg和100ug/kg，对照组为生理盐水。
权利要求
1.本发明所述缺失型人白细胞介素11变异体由天然人白细胞介素11N末端缺失1到68个氨基酸形成。
2.权利要求1中的缺失1到68个氨基酸主要指N末端第20位到第68位氨基酸之间的任何缺失形式。
3.权利要求1和权利要求2中的缺失改造指基因工程重组技术。
4.权利要求2、3中的重组缺失型人白细胞介素11变异体适用于原核和真核表达体系，通过重组表达、发酵以及纯化而得。
5.缺失型人白细胞介素11变异体具有天然人白细胞介素11相应的生物学功效，主要指增加外周血血小板的数量和胃肠粘膜保护等。
6.本发明中N末端缺失68个氨基酸的人白细胞介素11微小化变异体具有人白细胞介素11不具有的增加外周血白细胞数量的功效。
7.权利要求6中缺失型人白细胞介素11微小化变异体适应用大肠杆菌融合表达。
8.权利要求6中缺失型人白细胞介素11微小化变异体可用酵母表达而获得。
9.权利要求6中重组形式的缺失型人白细胞介素11微小化变异体在加入相应的制剂辅料后可制成注射液、粉针剂、口服剂和脂质体以及控、缓释剂型等。
10.权利要求9中人白细胞介素11缺失型微小化变异体适应于治疗和预防骨髓抑制和胃肠粘膜损伤等相关性疾病。
全文摘要
通过对天然人白细胞介素11(interleukin 11，IL－11)的基因序列和蛋白质二，三级结构分析，以及全基因内含子、外显子的特点和对应蛋白质N末端α螺旋的组成顺序，结合IL－11生物活性决定区靠近C末端的分析。本发明设计并改造出N末端缺失第一个、第二个和第三个α螺旋区即分别缺失20、39、68个氨基酸的人白细胞介素11缺失型变异体(Variants)。经体内外试验证明，大肠杆菌重组表达的N末端缺失68个氨基酸的人IL－11微小化变异体Δ1－68 IL－11，具有显著提高外周血血小板数量和胃肠粘膜保护的生物功能，同时具备天然人IL－11不具有的增加外周血白细胞数量的生物作用。本发明的缺失型微小化人IL－11变异体，因其独特的生物作用具有临床应用价值。
文档编号A61P1/00GK1517364SQ0310115
公开日2004年8月4日 申请日期2003年1月13日 优先权日2003年1月13日
发明者范开, 张宪, 黄振伟, 范 开 申请人:重庆富进生物医药有限公司