专利名称：维生素－定向的显象剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于将显象剂引导到动物细胞上的化合物和方法。更具体地讲，通过利用维生素或维生素受体结合衍生物或其类似物作为显象剂的定向配体，将放射性核素型显象剂引导到具有维生素受体的细胞上。
背景技术：
和概述跨膜转运是一种重要的细胞功能。由于对于包括药物治疗和基因转移在内的很多医学和生物科学领域来说，实践者业已认识到了跨膜转运的重要性，为了理解和应用所述方法，业已进行了大量的研究努力。因此，举例来说，业已通过利用蛋白载体，抗体载体，脂质体输送系统，电穿孔，直接注射，细胞融合，病毒载体，渗透压冲击，和磷酸钙介导的转化尝试了核酸的跨膜输送。不过，很多这样的技术同时局限于进行跨膜转运的细胞的类型，以及使外源分子进行成功的跨膜转运所需要的条件。另外，很多这样的技术局限于外源分子的类型和大小，所述外源分子能够通过细胞膜转运而又不丧失生物活性。
具有广泛用途的外源分子的跨膜转运的一种机制是受体介导的细胞内吞作用。优选的是，受体介导的细胞内吞作用同时在体内和体外进行。受体介导的细胞内吞作用涉及与膜受体结合的配体通过膜的内陷转移到由所述膜所包围的部位的内部。所述过程是通过受体专一性配体与所述受体的结合启动的或激活的。业已表征了多种受体介导的细胞内吞系统，包括能导致以下分子内在化的系统半乳糖，甘露糖，甘露糖6磷酸，转铁蛋白，去唾液酸糖蛋白，叶酸，运钴胺素蛋白(维生素B12)，α-2巨球蛋白，胰岛素，和其他肽生长因子，如表皮生长因子(EGF)。
业已将受体介导的细胞内吞作用用于将诸如蛋白和核酸的外源分子输送到细胞中。一般，特定的配体是通过共价键，离子，或氢键结合与感兴趣的外源分子化学缀合的，形成在缀合物中仍然能够被靶受体识别的部分(配体部分)的缀合分子。通过这种技术，业已将光毒性蛋白补骨脂素缀合在胰岛素上，并且通过胰岛素受体细胞内吞途径内在化(Gasparro，Biochem.Biophys.Res.Comm.141(2)，pp.502-509，Dec.15，1986)；业已将半乳糖末端去唾液酸糖蛋白的肝细胞的专一性受体用于与质粒非共价络合的缺乏唾液酸基的血清类黏蛋白-聚-L-赖氨酸的肝细胞专一性跨膜输送(Wu，G.Y.，J.Biol.Chem.，262(10)，pp.4429-4432，1987)；业已将EGF的细胞受体用于将与EGF共价连接的多核苷酸输送到细胞内部(Myers，欧洲专利申请86810614.7，
公开日为1988年6月6日)；业已将位于肠道中的有机金属维生素B12-内在因子络合物的细胞受体用于介导与维生素B12络合的药物，激素，生物活性肽和免疫原的输送，在口服之后输送到循环系统中(Russell-Jones等，欧洲专利申请86307849.9，
公开日为1987年4月29日)；业已将甘露糖-6-磷酸受体用于输送低密度脂蛋白到细胞中(Murray，G.J.和Neville，D.M.，Jr.，J.Biol.Chem，Vol.255(24)，pp.1194-11948，1980)；业已将霍乱毒素结合亚基受体用于将胰岛素输送到缺乏胰岛素受体的细胞中(Roth和Maddox，J.Cell.Phys.Vol.115，p.151，1983)；并且业已将人绒膜促性腺激素受体用于将与HCG结合的蓖麻毒蛋白a-链输送到具有合适HCG受体的细胞中(Oeltmann和Heath，J.Biol.Chem，vol.254，p.1028(1979))。
在本发明的一种实施方案中，涉及到放射性核素-型显象剂通过具有维生素受体，或维生素受体结合衍生物或其类似物的跨膜转运。让具有维生素受体，或维生素衍生物或类似物的受体的细胞膜与维生素-显象剂缀合物接触足够的时间，以便启动并且进行所述缀合物的跨膜转运，并且监测所述维生素-显象剂缀合物在所述动物体内的生物分布。在另一种实施方案中，所述维生素/维生素衍生物或类似物定向部分只是与细胞表面维生素受体结合，以便在所述细胞表面上浓缩螯合的放射性核素。
本发明利用了(1)维生素受体的定位和(2)相关的受体-介导的细胞内吞过程。例如，本发明利用了能专一性地结合肿瘤细胞上的或能够超量表达所述受体的其他细胞类型上的维生素，或其衍生物或类似物的维生素受体，转运蛋白，或其他表面呈递蛋白的独特的表达，超量表达，或优先表达。因此，本发明可用于检测诸如肿瘤细胞，或其他细胞类型的细胞，这些细胞通过利用受体介导的细胞内吞过程能够超量表达维生素受体，或维生素衍生物或类似物的受体，所述过程是在所述细胞与维生素-显象剂接触时发生的。
例如，微生物受体，如高亲和力叶酸受体(FR)是在癌细胞上高水平表达的。卵巢，乳腺，结肠，肺，鼻，喉，和大脑的上皮癌都报导了能表达较高水平的FR。实际，已知超过90％的所有人类卵巢肿瘤能表达大量的这种受体。因此，本发明可用于多种肿瘤类型，和与疾病状态相关的其他细胞类型的诊断显象。
业已将与配体络合的放射性核素螯合剂用作诊断诊断显象目的的非损伤性探针。例如，业已将血管活性肠肽，生长激素释放抑制激素类似物，和单克隆抗体用作配体，将放射性核素定位于诸如肿瘤细胞的细胞。单克隆抗体，和它的各种片断最初受到了最多的关注，这是因为人们相信利用单克隆抗体作定向配体可以实现精确的肿瘤专一性定向。不幸的是，这种方法是有问题的，因为i)由于它们的较大的体积，抗体具有很长的循环时间，这对于显象目的来说是不利的，ii)抗体的生产成本昂贵，iii)抗体可能是免疫原性的，因此，在使用多个剂量时，必须人源化，和iv)抗体结合的放射性核素的肿瘤与非靶定组织的比例(T/NT)不是最佳的。因此，最近的焦点集中在利用没有所述限制的较小的肿瘤专一性配体。
业已将诸如叶酸的维生素用于将显象剂引导到肿瘤细胞，并且因为它们较小的体积是有利的。所披露的用于体内肿瘤显象的第一种叶酸型定向络合物是含有125I的组胺衍生物。因为长效的125I放射性核素成分，这种络合物不被认为是相关的临床候选物。
随后，开发了肿瘤显象的去铁胺-叶酸缀合物(去铁胺螯合物67Ga，γ-发射放射性核素，它具有78小时的半衰期)。发现了该缀合物的肝胆管清除，因此，由于在精确的显象腹部定位方面的预期的问题而终止了临床前的开发。不过，通过用一种有效的111In螯合剂(半衰期68小时)-二乙三胺五乙酸(DTPA)取代所述的去铁胺螯合剂克服了这一障碍。证实了消除111In-DTPA-叶酸的主要途径是通过肾脏。
最近，业已将99mTc用作用于诊断显象的优选放射性核素，因为i)这种放射性核素容易从商业销售的99Mo-99mTc发射剂获得，ii)与生产111In的成本相比，生产大量99mTc的成本是微不足道的，和iii)99mTc具有更短的(6小时)半衰期，这样可以服用更大剂量的放射性核素，能够产生更高分辨率的图像，而又不会使活体器官接收有害的辐射。
业已开发了若干种叶酸型99mTc缀合物。例如，业已证实了99mTc-6-肼基烟酰胺-肼基(HYNIC；Guo等，J.Nucl.Med.，40(9)1563-1569(1999))，99mTc～12-氨基-3，3，9，9-四甲基1-5-氧杂-4，8二氮杂-2，10-dodecanedinoe二肟(氧杂)(Linder等，Soc.Nucl.Med.，Proc.47th Annual Meeting，2000，41(5)119P)，99mTc-乙烯二半胱氨酸(Ilgan等，Cancer Biother.& Radiopharm.，13(6)427-435(1998))，和99mTc-DTPA～叶酸(Mathias等，Bioconjug.Chem.，11(2)253-257(2000))的叶酸缀合物在体内肿瘤摄取质量方面的应用前景。不过，还需要其他维生素-型99mTc缀合物，或利用其他放射性核素的维生素-型缀合物，它具有最佳的肿瘤与非目标组织比例(T/NT)，并且是通过肾脏消除的。所述维生素型缀合物应当适合作为肿瘤显象剂的临床开发，并且用于其他疾病状态的诊断。
在一种实施方案中，提供了具有以下结构式的化合物 其中，V是维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链，M是放射性核素的阳离子，n是1或0，而k是1或0。所述维生素是受体-介导的体内跨膜转运的底物。
在另一种实施方案中，提供了一种用于诊断显象的组合物，它包括具有以下结构式的化合物
其中，V是维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链，M是放射性核素的阳离子，n是1或0，和它的可以药用的载体。所述维生素是受体-介导的体内跨膜转运的底物。
在另一种实施方案中，提供了一种对动物体内的一群细胞进行显象的方法，其中，所述细胞以这些细胞表面上的维生素受体为特征。所述方法包括给所述动物服用有效量的包括具有以下结构式的化合物的组合物 其中，V是维生素，或对细胞表面维生素受体专一的受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链，M是放射性核素的阳离子，n是1或0，和它的可以药用的载体，并且监测所述化合物在所述动物体内的生物分布。
在另一种实施方案中，提供了具有以下结构式的化合物 其中，V是维生素，它是受体-介导的体内跨膜转运的底物，或维生素受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链，M是放射性核素的阳离子，n是1或0，而k是1或0。
在另一种实施方案中，提供了用于诊断显象的组合物，它包括具有以下结构式的化合物
其中，V是维生素，它是受体-介导的体内跨膜转运的底物，或维生素受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链，M是放射性核素的阳离子，n是1或0，和它的可以药用的载体。
在另一种实施方案中，提供了一种对动物体内的一群细胞进行显象的方法，其中，所述细胞以这些细胞表面上的维生素受体为特征。所述方法包括给所述动物服用有效量的包括具有以下结构式的化合物的组合物 其中，V是维生素，或对细胞表面维生素受体专一的受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链，M是放射性核素的阳离子，n是1或0，和它的可以药用的载体，并且监测所述化合物在所述动物体内的生物分布。
在上述任何实施方案中，所述化合物中的V可以是，例如，选自下列一组的维生素叶酸，核黄素，硫胺素，维生素B12，和生物素，或其衍生物或类似物。在上述任何实施方案中，在所述化合物中的放射性核素可以选自，例如，下列一组放射性同位素镓，铟，铜，锝，和铼。
附图简述
图1.EC 20的结构，被用作本发明显象剂的典型的化合物。
图2.99mTc-EC20的HPLC放射层析图。在Waters Nova-Pak C 18(3.9×150mm)柱上等度洗脱99mTc-EC20的样品，使用含有20％甲醇和0.2％三氟乙酸的水移动相，流速为1毫升/分钟。通过UV检测仪(280nm)和Bioscan FC-3200检波器监测HPLC分析。A峰，无99mTc；B峰，具有未知结构的含有叶酸的螯合物；C和D峰，在EC20的Dap-Asp-Cys螯合环中具有锝-氧键的顺或反构像的非对映异构体。
图3.Re-EC20和99mTc-EC20异构体的结构(金属-氧键的顺或反位置)。
图4.用各种含有叶酸的竞争剂抑制3H-叶酸与KB细胞的结合。在有或没有加大竞争剂浓度的条件下，将KB细胞在冰上与100nM3H-叶酸一起培养15分钟。(●)叶酸；(■)EC20；(▲)EC20Re异构体A； ()EC20Re异构体B；(□)DTPA-叶酸。误差线条表示1个标准误差(n＝3)。
图5.99mTc-EC20的时间决定型结合。在37℃下将KB细胞与10nM99mTc-EC20一起长时间培养。在多次洗涤之后，收获细胞，并且统计结合的放射性活性。误差线条表示1个标准误差(n＝3)。
图6.99mTc-EC20的浓度决定型结合。在37℃下，在提高99mTc-EC20浓度的情况下培养KB细胞2小时。在多次洗涤之后，收获细胞，并且统计结合的放射活性。误差线条表示1个标准误差(n＝3)。
图7.99mTc-EC20“B峰”的浓度决定型结合。在37℃下，在存在较大浓度“B峰”的情况下培养KB细胞2小时。所述B峰是通过层析方法从99mTc-EC20制剂中分离的。在多次洗涤之后，收获细胞，并且统计结合的放射性活性。误差线条表示1个标准误差(n＝3)。(●)，B峰；(°)，B峰+1mM叶酸。
图8.在Balb/c小鼠体内抑制99mTc-EC20的血液清除。在进行短时间的乙醚麻醉期间用大约0.1mL的体积给每只动物静脉注射50μg/kg EC20的剂量(67nmol/kg)。在指定的注射后时间，通过二氧化碳窒息对每一只动物实施安乐死，采集血液，并且统计相关的放射活性。误差线条表示1个标准误差(n＝3只动物)。
图9.整体γ图像(腹部视图)。图像是在给长有皮下叶酸受体阳性M109肿瘤的Balb/c小鼠静脉服用99mTc-EC20之后4小时获得的。只有肾脏(K)和肿瘤(T)表现出这种放射性示踪剂的明显积累。
图10.EC11，EC13，EC14，EC15，EC19，EC20，EC31和EC53的结构。
图11.99mTc-EC20在长有FR-阳性M109肿瘤和FR-阴性4T1肿瘤的Balb/c小鼠体内的99mTc-EC20的组织分布。
图12.EC11的HPLC分析。
图13.EC11的质谱分析。
图14.EC11的NMR分析。
图15.EC13的HPLC分析。
图16.EC14的NMR分析。
图17.EC15的质谱分析。
图18.EC19的HPLC分析。
图19.EC19的质谱分析。
图20.EC31的HPLC分析。
图21.EC53的HPLC分析。
图22.EC53的质谱分析。
图23.EC53的质谱分析。
发明详述根据本发明，提供了用于将放射性核素-型显象剂引导到能独特地表达，超量表达，或优先表达维生素受体的细胞群体的化合物和方法。因此，将维生素，或其受体结合衍生物或类似物被用作所述显象剂的定向配体。可以将所述维生素-显象剂缀合物用于将放射性核素引导到细胞上，并且在诸如肿瘤细胞群体的细胞群体中浓缩所述放射性核素，以便用于诊断显象。
本发明提供了用于诊断显象的组合物，它包括用于所述方法的具有以下结构式的化合物
或 在所述化合物中，V是维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链，M是放射性核素的阳离子，而n是1或0。所述维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物，是受体-介导的体内跨膜转运的底物。
本发明还提供了具有以下结构式的化合物 和 其中，V是维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链，M是放射性核素的阳离子，n是1或0，而k是1或0。所述维生素是受体-介导的体内跨膜转运的底物。
所述化合物的例子是图1所示的被称为EC20的化合物。用于本发明的其他化合物的例子是EC11，EC13，EC14，EC15，EC19，EC31，和EC53(参见图10)。所述维生素部分(例如EC20中的叶酸部分)提供了对细胞FRs的高亲和力结合。所述化合物还含有双功能肽型螯合剂，它提供了用于螯合放射性核素，例如，99mTc(参见图1)的位点，并且所述化合物可选择性地包括接头，通过该接头可以将所述维生素部分共价结合在所述螯合部分上。
根据本发明，所述化合物的维生素部分是维生素，它是受体-介导的体内跨膜转运的底物，或维生素受体结合衍生物或其类似物。所述维生素通过接头(L)选择性地与所述化合物的螯合剂部分结合。所述螯合剂部分包括通过第三个氨基酸残基与半胱氨酸基团连接的α，β-二氨基丙酸部分。所述化合物的螯合剂部分适合结合放射性核素阳离子(M)(其中k＝1)。
根据本发明，所述具有结合的放射性核素的化合物被称为“维生素-显象剂缀合物”。
所述接头(如果存在的话)的结构对于本发明来说是不重要的。因此，例如，它可以是任何生物兼容性二价键。通常，所述接头包括大约1-大约30个碳原子，更常见的是大约2-大约20个碳原子。通常采用较低分子量的接头(即，分子量大约为30-大约300的接头)。另外，所述维生素部分可以是维生素，或它的衍生物或类似物。例如，含有一个与蝶酸连接的L构型的谷氨酸的叶酸。如图1所示，EC20包括与所述螯合剂部分结合的叶酸类似物，因为EC20具有D构型的谷氨酸。EC11和EC14包括两个谷氨酸残基，因此，所述化合物还可以，例如，被认为是叶酸的衍生物(图10)。
被认为能诱导受体介导的细胞内吞作用并且可应用于本发明披露的方法中的维生素包括烟酸，泛酸，叶酸，核黄素，硫胺素，生物素，维生素B12，和脂溶性维生素A，D，E和K。这些维生素，以及它们的类似物和衍生物构成了与显象剂结合以便形成用于本发明的维生素-螯合剂缀合物的维生素。优选的维生素部分包括叶酸，生物素，核黄素，硫胺素，维生素B12，和这些维生素分子的类似物和衍生物，以及其他相关的维生素受体-结合分子。
叶酸，亚叶酸，蝶酸，蝶酰聚谷氨酸，和叶酸受体-结合蝶啶如四氢蝶呤，二氢叶酸，四氢叶酸，和它们的脱氮和二脱氮类似物可用于本发明。术语“脱氮”和“二脱氮”类似物表示本领域所公认的叶酸类似物，它具有取代天然存在的叶酸结构上的一个或两个氮原子的碳原子。例如，所述脱氮类似物包括1-脱氮，3-脱氮，5-脱氮，8-脱氮，和10-脱氮类似物。所述二脱氮类似物包括，例如1，5二脱氮，5，10-二脱氮，8，10-二脱氮，和5，8-二脱氮类似物。以上是叶酸类似物或衍生物，并且可以与叶酸受体结合。可用于本发明的其他叶酸类似物或衍生物包括叶酸受体-结合类似物氨喋呤，氨甲喋呤(氨甲叶酸)，N10-甲基叶酸，2-脱氨-羟基叶酸，脱氮类似物，如1-脱氮甲喋呤或3-脱氮甲喋呤，和3′，5′-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰谷氨酸(二氯氨甲叶酸)。
所述维生素，或它的衍生物或其类似物能够选择性地与要显现的细胞群体结合，因为在所述靶细胞上优先表达了所述维生素，或衍生物或类似物的受体，其中，所述受体是可以结合的。所述维生素的结合位点可以包括能够特异地结合受体的任何维生素分子的受体，所述受体或其他蛋白是由要显现的细胞群体独特的表达，超量表达的，或优先表达的。由要显现的细胞独特表达，超量表达，或优先表达的表面呈递蛋白是在其他细胞上不存在或以较低含量存在的受体，提供了选择性地，快速地，和灵敏地观察靶定的细胞的方法，用于利用本发明的维生素-显象剂缀合物进行诊断显象。
根据本发明，所述维生素显象剂缀合物能够与要显现的癌细胞或其他细胞上的受体高亲和力结合。所述高亲和力结合可能是所述维生素部分所固有的或所述高亲和力可以通过使用化学修饰的维生素(即类似物或衍生物)或通过存在于所述缀合物的维生素和螯合剂部分之间的特殊化学连键加强。
根据本发明，所述螯合剂可以与多种不同的维生素，或维生素受体结合衍生物或类似物缀合，以便增加与相应的细胞膜受体结合的机会。另外，维生素-显象剂缀合物的剂量的独立部分可以构成不同的维生素-显象剂缀合物，以便增加与相应的细胞膜受体结合的机会。
一般，在螯合剂和维生素，或维生素受体结合衍生物或类似物之间形成络合物的任何方法都可用于本发明。所述螯合剂可以通过使用二价键通过所述螯合剂和维生素的直接缀合，所述螯合剂可以与维生素，或维生素受体结合衍生物或类似物形成络合物。另外，所述维生素和螯合剂可以是在不使用接头的情况下缀合的。如果使用接头的话，所述接头可以通过氢键，离子键，或共价键直接缀合所述维生素，或维生素受体结合衍生物或类似物，以及所述螯合剂。另外，根据本发明，所述二价键可以包括结合所述螯合剂和维生素，或维生素受体结合衍生物或类似物的间接方式，如通过中间接头，间隔臂，或桥连分子连接。直接和间接结合的方法，都必须不会妨碍所述维生素，维生素受体结合衍生物或类似物与所述细胞膜上的维生素受体结合，以便实施本发明的方法。
无论是否使用接头，所述维生素，或维生素受体结合衍生物或类似物，和所述螯合剂的共价结合可以通过酸，醛，羟基，氨基，或肼基之间形成酰胺，酯或亚胺基键实现。例如，可以利用羰基二咪唑或标准碳二亚胺结合试剂，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)激活维生素部分或螯合剂部分上的羧酸，然后与所述缀合物的其他成分起反应，或与至少一个亲核性基团，即羟基，氨基，肼基或巯基的接头起反应，以便形成有或没有通过酯，酰胺，或硫酯键结合的接头的维生素螯合剂缀合物。
适合诊断显象的放射性核素包括放射性核素镓，铟，铜，锝和铼，包括同位素111In，99mTc，64Cu，67Cu，67Ga或68Ga。所述放射性核素是阳离子型的，并且通过所述缀合物的螯合基团与所述螯合剂络合，以便形成维生素显象剂缀合物。
本发明的维生素-显象剂缀合物被用于利用闪烁成像技术选择性显现动物体内的一群细胞，其中，所述细胞群体能够独特地表达，超量表达，或优先表达维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物的受体。所述维生素-显象剂缀合物可用于显现致病性细胞的群体，只要所述细胞能独特地或优先表达或超量表达维生素受体或结合维生素衍生物或类似物的受体就行。
本发明可应用于致病性细胞群体，它们能导致多种病状，包括癌症，和通过其他类型的致病性细胞介导的疾病，所述细胞能超量表达维生素受体或能够结合维生素衍生物或类似物的受体。因此，所述致病性细胞群体可以是致瘤的，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，或它可以是非治瘤的。如果所述细胞群体是癌细胞群体，所述癌细胞可以自发产生或通过诸如存在于宿主动物种系的突变或体细胞突变自发发生，或者所述癌症可以是化学，病毒，或辐射诱导的。本发明可用于癌症诸如肿瘤，恶性肿瘤，淋巴瘤，Hodgekin′s病，黑素瘤，间皮瘤，Burkitt′s淋巴瘤，鼻咽癌，和骨髓瘤的诊断显象。所述癌细胞群体可以包括，但不局限于口腔，鼻咽，甲状腺，内分泌，皮肤，胃，食道，咽，喉，胰腺，结肠，膀胱，骨，卵巢，宫颈，子宫，乳腺，睾丸，前列腺，直肠，肾，肝，肺和大脑癌。对于所述细胞群体是癌细胞群体的实施方案来说，肿瘤细胞，包括原发性肿瘤细胞或具有转移的癌细胞或处在与原发性肿瘤分离的过程中的肿瘤细胞，可以利用维生素显象剂缀合物显现。
本发明的维生素-显象剂缀合物可用于诊断疾病症状或监测疾病的发展。例如，本发明的诊断显象方法可用于监测癌症的发展，与预防性治疗结合，以便预防在通过任何治疗方法切除之后的肿瘤复发，所述方法包括肿瘤的手术切除，放疗，化疗，或生物治疗。
本发明的组合物和方法可用于人类临床药和兽医用途。因此，具有要显现的细胞群体的动物可以是人，或者对于兽医用途来说，可以是实验室，农业，家养，或野生的动物。本发明可应用的动物包括，但不局限于人，实验室动物，如啮齿类动物(例如，小鼠，大鼠，仓鼠等)，兔子，猴子，黑猩猩，家养动物，如狗，猫，和兔子，农业动物，如牛，马，猪，绵羊，山羊，和圈养的野生动物，如熊，熊猫，狮子，虎，豹，大象，斑马，长颈鹿，大猩猩，海豚，和鲸鱼。
用于诊断显象的组合物包括在通过一个或通过多个剂量服用时能够在进行诊断显象的动物体内有效显现靶细胞的量的维生素-显象剂缀合物。含有维生素-显象剂缀合物的诊断显象组合物优选通过肠胃外途径给动物服用，例如，真皮内，皮下，肌内，腹膜内，静脉内，或膜内。另外，含有维生素-显象剂缀合物的组合物可以通过其他医学上可以使用的方法给动物服用，并且，可以使用任何有效剂量和合适的剂型，包括口服和吸入剂型。
肠胃外剂型的实例包括所述维生素-显象剂缀合物的水溶液，存在于等渗盐水，5％葡萄糖或其他众所周知的可以药用的液体载体中，如液体醇，乙二醇，酯，和酰胺。本发明的肠胃外剂型可以是可复水的冷冻干燥形式的，包括所述剂量的维生素-显象剂缀合物。
所述诊断显象组合物中的维生素-显象剂缀合物的剂量可以根据动物的大小，要定向进行诊断显象的细胞群体，所使用的特定维生素显象剂缀合物，以及服用所述缀合物的途径而明显不同。给所述动物服用的有效量是基于所述动物的身体表面积，体重，和医生对动物症状的评估。有效剂量可以是大约1ng/kg-大约1mg/kg范围内，更优选大约100ng/kg-大约500/μg/kg，最优选大约100ng/kg-大约25μg/kg。
服用含有维生素-显象剂缀合物的诊断显象组合物的任何有效方案都可以使用。例如，所述诊断显象组合物可以作为单剂量服用，或者可以通过多个剂量服用，如果必要的话，以便实现所述靶细胞群体的显现。在首次注射之后，可以数日或数月的间隔给所述动物服用其他注射剂量的含有所述维生素-显象剂缀合物的诊断显象组合物，并且，所述其他注射可用于监测疾病状态的发展。含有维生素-显象剂缀合物的诊断显象组合物还可以与未标记过的维生素一起组合使用。“与…组合”表示所述未标记过的维生素可以与所述显象剂共同服用，或者在服用所述显象剂之前预先注射未标记过的维生素，以便提高图像质量。例如，所述显象剂可以与大约0.5ng/kg-大约100mg/kg，或大约1μg/kg-大约100mg/kg，或大约100μg/kg-大约100mg/kg的未标记过的维生素组合服用。
所述诊断显象组合物通常被制备成用于肠胃外服用，并且是以能够使靶细胞群体有效显象的量给所述动物服用的。通常给所述动物服用含有所述维生素定向显象剂的诊断显象组合物，并且在经过一段时间之后，使所述维生素-显象剂缀合物在所述靶细胞群体中输送和浓缩，并且对所述动物进行显象过程，并且显象可以通过所述维生素-显象剂缀合物完成。在用于监测疾病发展过程或诊断时，显象方法通常是在服用含有维生素-显象剂缀合物的诊断显象组合物之后大约1-大约6小时进行的。
本发明还提供了对动物体内的一群细胞进行显象的方法，其中，所述细胞以存在于所述细胞表面上的维生素受体为特征。所述方法包括以下步骤给所述动物服用有效量的包括具有以下结构式的化合物的组合物
或 其中，V是所述维生素，或对细胞表面维生素受体专一的受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链，M是放射性核素的阳离子，n是1或0，和它的可以药用的载体，并且监测所述化合物在所述动物体内的生物分布。
所述方法可用于在体外，例如，在细胞培养物中或在体内，其中，所述细胞构成了动物组织的一部分或以其他方式存在于动物组织中进行细胞群体的显象。因此，举例来说，所述靶细胞可以包括衬在消化道如口腔和咽喉黏膜里的细胞，所述细胞构成了小肠的绒毛，或衬在大肠里的细胞。根据本发明，所述消化道中的细胞可以通过服用包括维生素显象剂缀合物的诊断显象组合物进行定向。类似地，衬在动物的呼吸系统(鼻道/肺)里的细胞可以通过吸入本发明的络合物定向，并且，内脏器官的细胞，包括卵巢和大脑的细胞特别是可以通过肠胃外服用诊断显象组合物定向。
实施例1材料N10-三氟乙酰蝶酸是从瑞士的Eprova AG，Schaffhausen购买的。肽合成试剂是从NovaBiochem和Bachem购买的。99mTc高锝酸钠是由Syncor提供的。[ReO2(en)2]Cl是按照Rouschias的方法制备的(Rouschias，G.，Chem.Rev.，74531(1974))。纤维素平板和DEAE离子交换平板是从J.T.Baker购买的。
实施例2EC20的合成，纯化，和分析表征EC20是使用Fmoc方法通过聚合物支持的顺序方法制备的(参见下面的方案1；Fmoc＝9-芴基甲氧基羰基；Boc＝叔丁氧基羰基；Dap＝二氨基丙酸；DMF＝二甲基甲酰胺；DIPEA＝二异丙基乙胺)。EC20是在用Fmoc-L-Cys(Trt)-OH加载的酸敏感型Wang树脂上合成的。苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-膦六氟代磷酸(PyBOP)是作为活化制剂使用的，以便确保利用低当量的氨基酸进行有效结合。Fmoc保护基团是在每一个结合步骤之后，在标准条件下去掉的(存在于DMF中的含有20％的哌啶)。在最后的组装步骤之后，通过用含有2.5％乙二硫醇，2.5％三异丙基硅烷和2.5％去离子水的92.5％的三氟乙酸处理将所述肽从聚合物支持物上裂解掉。该反应还导致了t-Bu，Boc和三苯甲基保护基团的同时消除。最后，在氢氧化铵水溶液中除去三氟乙酰部分，以便得到EC20。
通过HPLC纯化粗制EC20产物，使用Xterra RP18 30×300mm，7μm柱(Waters)；流动相32mMHCl(A)，MeOH(B)；梯度条件始于99％A和1％B，以20mL/分钟的流速，用37分钟时间达到89％A和11％B。在上述条件下，EC20单体通常在14.38分钟洗脱出，而EC20二硫化物二聚体(少量污染物)在16.83分钟洗脱出。图10所示的所有其他化合物可以用类似的合成方法制备，所不同的是，EC15是按照下面所示的方案2合成的。
将2mg HPLC-纯化的EC20溶解在0.62mL的D2O，并且收集500MHz1H-NMR谱。表1(参见下文)列举了EC20分子中的所有非交换质子的化学位移，信号形状，和J值。
还通过电雾化质谱学分析了EC20。主要阳性离子峰(m/z，相对强度)746.1，100；747.1，44；556.8，32；570.8，16。
方案1a
a试剂和条件i)20％哌啶，DMF；ii)Fmoc-Asp(OtBu)-OH，PyBop，DIPEA，DMF；iii)Boc-Dap(Fmoc)-OH，PyBop，DIPEA，DMF；iv)Fmoc-D-Glu-OtBu，PyBop，DIPEA，DMF；v)N10-TFA-Pte-OH，DIPEA，DMSO；vi)F3CCO2H，HSCH2CH2SH，iPr3SiH；vii)H4NOH，pH＝10.3。
表1.EC20的1H-NMR数据。将EC20溶解在D2O中，并且采集500MHz光谱。化学位移(δ)以ppm为单位。将δ＝4.80ppm时的HOD信号用作参照。pD＝4.78；s＝单峰；d＝双峰；m＝多峰。
方案2a a试剂和条件i)20％哌啶，DMF；ii)Fmoc-Asp(OtBu)-OH，PyBop，DIPEA，DMF；iii)Fmoc-Cys(Trt)-OH，PyBop，DIPEA，DMF；iv)Fmoc-D-Glu-OtBu，PyBop，DIPEA，DMF；v)N10-TFA-Pte-OH，DIPEA，DMSO；vi)TFAA，HSCH2CH2SH，iPr3SiH；vii)H4NOH，pH＝10.3实施例3非放射性试剂小瓶和99mTc-EC20的制备将EC20试剂盒用于制备99mTc-EC20放射性药物。每一个试剂盒含有0.1mg EC20，80mg α-D-葡萄糖酸钠，80mg二水合氯化锡(II)的无菌的，非致热的冷冻干燥的混合物，并且含有足够量的氢氧化钠或氢氯酸，以便在冷冻干燥之前将pH调整到6.8±0.2。在氩气环境中将所述冷冻干燥的粉末密封在5mL小瓶中。然后在-20℃下冷冻保存所述试剂盒，直到使用或期满(现有的贮存期限大于2年)。重要的是，需要所述氯化锡(II)成分，以便还原所添加的99mTc-高锝酸盐，同时需要α-D-葡萄糖酸钠成分，以便在它与EC20化合物最终螯合之前稳定所述新还原的99mTc。
99mTc-EC20是按以下方法制备的(即99mTc与EC20的螯合)。
首先，制备含有部分淹没的铅瓶罩的煮沸的水。用70％的乙醇擦拭EC20瓶的顶部，以便对它的表面进行消毒，并且将所述小瓶放入合适的密封容器中。使用装有27号针头的被密封的注射器将存在于0.9％氯化钠中的1mL消毒的高锝酸钠99mTc注射液(15-20mCi)注射到所述密封的小瓶中。在将所述注射器从所述小瓶中取出之前，从所述小瓶中排出与所添加的高锝酸盐体积相等的体积的气体，以便使所述小瓶内的压力正常化。轻轻搅拌所述小瓶30秒，以便确保所述冷冻干燥粉末的完全溶解。然后将所述小瓶放入放置在煮沸的水浴的所述铅罩中。将该溶液加热大约18分钟，然后用至少15分钟时间冷却到室温。该溶液可以在室温(15-25℃)下遮光保存，不过应当在制备之后6小时内使用。
在室温下遮光保存长达24小时之后，通过HPLC测定所述放射性药物的放射化学稳定性。使用HPLC系统分析99mTc-EC20溶液(20μL)的样品，该系统包括Waters 600E多溶剂输送系统和490 UV检测仪，Bioscan EC-3200检波器，Laura v1.5放射层析图软件，和WatersNova-Pak C18(3.9×150mm)柱。使用含有20％甲醇和0.1％三氟乙酸的含水流动相以1mL/分钟的流速等度洗脱注射的样品。利用UV检测仪(280nm)和γ检波器监测HPLC分析。显然，在所有例子中，在至少24小时之后，残留的99mTc-EC20的放射化学纯度超过90％。
实施例4通过TLC测定99mTc-EC20的放射化学纯度99mTc-EC20的制备中的主要放射化学杂质是1)99mTc高锝酸盐，2)99mTc-葡萄糖酸盐(配体交换前体)，3)非专一性结合的99mTc(结合在除了EC20分子的预期的Dap-Asp-Cys螯合部分以外的位点上的99mTc)，和4)水解的99mTc。由于试验了99mTc-EC20的可能的临床用途，开发了三种-TLC-型方法，以便测定每一种杂质的量，并且估算99mTc-EC20的总的放射化学纯度。
在第一种系统中，用去离子水对纤维素板进行显象。99mTc-EC20，99mTc-葡萄糖酸盐，非专一性结合的99mTc和99mTc高锝酸盐移动到溶剂前面(Rf＝1.0)，而水解的99mTc保持在起点部分(Rf＝0.0)。在Rf＝0.3(距离起点1.5cm)处将所述纤维素板切成两部分，并且用剂量校正仪，对每一部分进行计数。按以下方法计算水解的99mTc的百分比A＝水解％；99mTc＝(下面部分中的μCi/在两部分中的μCi)×100。
在第二种系统中，用丙酮和0.9％NaCl(7∶3，v/v)对纤维素平板进行显影。99mTc-高锝酸盐以Rf＝0.9移动，而99mTc-EC20，99mTc-葡萄糖酸盐，非专一性结合的99mTc和水解的99mTc保持在起点(Rf＝0.0)。在Rf＝0.6处(距离起点3.0cm)将纤维素/丙酮-盐水平板切成两部分，用剂量校正仪对每一部分进行计数。99mTc-高锝酸盐的百分比按以下方法计算B＝％99mTc-高锝酸盐＝(上部的μCi/两部分中的μCi)×100。
最后，在第三种系统中，用0.3M Na2SO4对DEAE离子交换平板进行显影。99mTc-葡萄糖酸盐移动到溶剂前面(Rf＝1.0)，非专一性结合的99mTc以Rf＝0.6移动，而99mTc-EC20，水解的99mTc和99mTc-高锝酸盐保留在靠近起点的地方(99mTc-EC20。Rf＝0.1；水解的99mTcRf＝0.0；99mTc高锝酸盐Rf＝0.3)。在距离起点2.5cm处将纤维素/Na2SO4平板切成两部分，并且利用剂量校正仪对每一部分进行计数。按以下方法计算99mTc-葡萄糖酸盐和非专一性结合的99mTc的百分比如下C＝％(99mTc-葡萄糖酸盐+非专一性结合99mTc)＝(上部的μCi/两部分的μCi)×100。然后按以下方法计算99mTc-EC20的总的放射化学纯度放射化学纯度＝100-(A+B+C)。
如图2所示，99mTc-EC20制剂的HPLC分析出现了四种放射化学成分，被命名为A-D峰。证实A峰是无99mTc的，并且，该副产物可再现地以＜2％的比例存在。B峰，与99mTc-葡萄糖酸盐的峰不同(数据未显示)，是以2.8分钟的保留时间洗脱的。该成分占所述混合物的大约3％，并且被认为是由于99mTc螯合在EC20分子上的除了预计的Dap-Asp-Cys部分以外的位点所得到的。C峰和D峰(保留时间分别为4.8分钟和13.2分钟)，占制备的放射化学活性的主要部分。
实施例5Re-EC20的合成将52mg(0.010mmol)的EC20和[ReO2(en)2]Cl(52mg，0.14mmol)分别溶解在6mL和1mL氩净化的磷酸缓冲液中(0.05M，pH 5.8)。合并这两种溶液，并且在氩气中，在煮沸的水浴中加热2小时。冷冻反应混合物，并且冷冻干燥过夜。通过HPLC纯化粗产物(Xterra RPI8柱，19×150mm，10mM NH4OAc/CH3CN，流速为10mL/mm；梯度为1％-8％)。收集级分，冷冻干燥，并且在-20℃下保存待用。
由于没有质谱装置可用于分析放射活性材料，对非放射性铼类似物Re-EC20进行分析。铼和锝都是VIIA族金属，它们在物理和化学特性方面具有显著的相似性。它们还能与有机配体形成类似的络合物。这种类似的化学特性通常被应用于阐明基于根据非放射性铼类似物的锝放射性药物的新类型。有趣的是，Re-EC20的HPLC分析还表现出分别在5分钟和14.2分钟洗脱的两个主峰，类似于99mTc-EC20的C峰和D峰(色谱图未示出)。质谱分析证实，这两种成分是相当于Re-EC20络合物的异构体(m/z＝945)。实际上，这些种类很可能是具有Dap-Asp-Cys螯合环中的锝-氧键的顺或反构型的非对映异构体。因为i)Re-EC20色谱图中的两个峰表示异构体络合物，和ii)存在锝络合物中的类似异构体的报导，99mTc-EC20放射层析图中的成分C和D可能也是异构体。
实施例6细胞培养物在37℃下，在5％二氧化碳/95％空气-潮湿的环境中，使用无叶酸RPMI培养基(FFRPMI)让细胞以单层形式连续生长，所述培养基含有10％加热失活的胎牛血清(HIFCS)，不含抗生素。所述HIFCS含有它的正常内源叶酸补体，这使得所述细胞能够在这种生理学上更相关的培养基中持续生长。所有细胞实验都是用含有10％HIFCS的FFRPMI(FFRPMI/HIFCS)作为生长培养基进行的，除非另有说明。
实施例7相对亲和力测定通过稍加改进的Westerhoff等(Mol.Pharm.，48459-471(1995))所披露的方法测定各种叶酸衍生物的相对亲和力。简单地讲，在室温下，在0.25％胰蛋白酶/PBS中让FR-阳性KB细胞温和地胰蛋白酶化3分钟，然后用FFRPMI/HIFCS稀释。然后以800×g的速度离心5分钟，并且用PBS洗涤1次，将最终的细胞沉淀物悬浮在FFRPMI1640中(无血清)。在有和没有提高含有叶酸的测试物品的浓度的情况下，在冰上将细胞与100nM3H-叶酸一起培养15分钟。以10,000×g的速度使样品离心5分钟，将细胞沉淀悬浮在缓冲液中，转移到装有5ml闪烁混合物的每一个小瓶中，然后进行放射性计数。负对照试管仅装有溶解在FFRPMI中的3H-叶酸(无竞争剂)。阳性对照试管含有最终浓度为1mM的叶酸，并且从所有样品中扣除在所述样品中测定的CPMs(表示标记物的非专一性结合)。很明显，相对亲和力定义为取代与KBFR结合的50％的3H-叶酸所需要的化合物的反摩尔比，并且将叶酸对FR的相对亲和力设定为1。
用这种测定方法测定了EC20直接与叶酸竞争结合细胞表面FRs的能力。重要的是，1.0的相对亲和力值表示测试物品配体对FR的亲和力与叶酸相等。同样，低于统一值的值表示较弱的亲和力，高于统一值的值表示较强的亲和力。
在存在逐渐加大浓度的非放射性叶酸，EC20，铼-EC20(异构体A；C峰)，铼-EC20(异构体B；0峰)，或相关的叶酸型放射性药物，DTPA-叶酸的情况下，将培养的KB细胞与100nM3H-叶酸一起培养。在4℃下培养15分钟之后，将未结合的材料从细胞上漂洗掉，并且对残余的细胞结合的放射性活性进行计数。将结合的放射性活性的量对未标记的配体的浓度进行作图，并且估算IC50值(抑制50％3H-叶酸结合所需要的配体浓度)。如图4和表2所示(参见下文)，测定EC20相对叶酸对人FRs的亲和力而言具有0.92的亲和力。铼-EC20的两种异构体的相对亲和力值都非常类似于(如果不高于)母体EC20分子的亲和力(Re-EC20异构体A和异构体B的亲和力分别为1.42和1.37)。DTPA-叶酸，111In-螯合叶酸放射性药物剂对叶酸受体的相对亲和力为0.87。因此，用各种金属螯合基序对叶酸进行化学修饰，不会破坏所述维生素对FR的固有的亲和力。
表2.相对亲和力评估。相对亲和力(RA)定义为取代与FR-阳性KB细胞结合的50％的3H-叶酸所需要的化合物的反摩尔比。将叶酸的相对亲和力设定为1。每一种测试物品重复评估3次。
实施例8时间决定型细胞吸收将KB细胞接种到12孔Falcon平板上，并且过夜以便形成亚融合的单层。在用1mL新的FFRPMI/HIFCS漂洗1次之后，每一个孔接纳1mL含有10nM的99mTc-EC20的FFRPMI/HIFCS。在37℃下，将细胞培养预定时间，然后用1mL冰冷的PBS漂洗4次。在室温下，用15分钟时间，将所述细胞单层溶解在0.5mL含有1％十二烷基硫酸钠的PBS，pH 7.4中，然后利用Packardγ计数器进行放射性计数。用BioRadDC蛋白测定试剂盒对每一个样品中的样品进行定量，并且利用每个细胞2.23×10-7mg蛋白的换算系数，将细胞蛋白值换算成细胞数量。最终的制表用的值是以每个细胞的EC20分子数形式表示的。
利用这种方法定量测定了被吸收到FR-阳性KB细胞中的99mTc-EC20的动力学。如图5所示，在37℃下，在2小时内达到了稳态吸收，其中，大约3.2百万个EC20分子是细胞结合的，而1/2最大细胞结合出现在将10nM的这种放射性药物与所述细胞混合9分钟之后。有趣的是，当细胞与10倍较高浓度的99mTc-EC20(100nM；数据未显示)一起培养时，仅用37秒就达到了1/2最大饱和点。
实施例9浓度决定型细胞吸收将KB细胞接种到12孔Falcon平板上，并且过夜以便形成亚融合的单层。在用1mL新的FFRPMI/HIFCS漂洗1次之后，每一个孔接纳1mL含有增加浓度的99mTc-EC20的FFRPMI/HIFCS。在37℃下培养细胞2小时，然后用1mL冰冷的PBS，pH 7.4漂洗4次。在室温下，用15分钟时间，将所述细胞单层溶解在0.5mL含有1％十二烷基硫酸钠的PBS中，然后利用Packardγ计数器进行放射性计数。按上述方法测定蛋白含量，并且最终的制表值是以每个细胞的EC20分子数形式表示的。
如图6所示，发现99mTc-EC20的细胞吸收取决于细胞外浓度。测定所使用的特定KB细胞的每个细胞最多能够结合400万个叶酸放射性药物的分子。对所述数据进行Scatchard分析，估计结合的KD为3.2nM，该值与观察到的维生素叶酸与相同细胞的结合值相当。
尽管没有确立B峰成分的完全相同，UV吸收分析表明，它含有叶酸部分(即，所述吸收光谱包括位于363nm处的叶酸的标记性次吸收峰)。收集这种HPLC纯化的放射性标记的物质(B峰物质)，然后添加到培养的KB细胞中。如图7所示，还发现99mTc-标记过的B峰成分的细胞吸收取决于细胞外浓度。对所述数据进行的Scatchard分析测算出结合的KD为1.1nM。有趣的是，在存在过量叶酸的情况下，B峰的细胞结合被完全抑制，这表明这种次要制剂副产品也能够在放射性诊断用途中定向FR-阳性细胞。
实施例10血液清除在剂量服用之前，用无叶酸的饮食(Harlan#TD-90261)将用于本研究的动物维持大约3周时间。对这种特殊饮食的适应是重要的，因为正常的啮齿类动物饮食包括大量的叶酸(6mg/kg食物)，并且促进小鼠体内的高血清叶酸含量。另外，以前的研究业已证实，用无叶酸的饮食饲养小鼠3周时间，保持了25±7nM的安全的血清叶酸水平，这一水平明显高于在人类血清中测定的9-14nM的浓度。
99mTc-EC20溶液是在使用当天制备的，并且最初每毫升含有100μgEC20。用无菌盐水进一步稀释该溶液，以便制备工作母液。通过TLC估算该产物的放射性化学纯度为大约94％。在简单的乙醚麻醉期间，通过尾静脉给每只动物静脉注射大约0.1mL体积的50μg/kg EC20(67nmol/kg)的剂量。在注射之后指定的时间(参见图8)，通过二氧化碳窒息对每只动物实施安乐死，马上通过心脏穿刺采集血液。
如图8所示，99mTc-EC20被很快从Balb/c小鼠的循环系统中清除。估计这种放射性药物的血浆半衰期为大约4分钟，并且在4小时之后在循环系统中残留的注射的99mTc-EC20不足0.2％(假设血液占总体重的5.5％)。这一数据表明，在静脉服用之后，叶酸缀合物被很快清除，并且，有价值的组织生物分布数据只能在注射数小时之后获得，不考虑由于血液携带的放射活性导致的非专一性组织摄取。
实施例11组织分布研究使用FR-阳性M109模型评估了99mTc-EC20在体内靶定肿瘤的能力。所述肿瘤细胞与Balb/c小鼠是同源的，并且它们能够在接种之后2周之内形成皮下固体肿瘤。在该生物测定中，还评估了在结构上与99mTc-EC20类似的99mTc-EC14，所不同的是，它包括一个额外的D-Glu残基(即，Pte-D-Glu-D-Glu-βDpr-Asp-Cys)，99mTc-EC28(不含蝶酸的对照，包括苯甲酰基-D-Glu-n-Glu-βDpr-Asp-Cys)，以及以前报导的111In-DTPA-叶酸放射性药物。重要的是，99mTc-EC28对照制剂不能结合细胞表面FRs，因为它缺乏关键的蝶啶环部分。
4-5周大的小鼠(Balb/c株系)是从Harlan Sprague Dawley，Inc.(Indianapolis，IN)购买的，并且在进行实验之前，用无叶酸的饮食一共维持3周时间。在实验之前2周，将同源的，FR-阳性M109肿瘤细胞(1×106每只动物)接种到右侧腋窝的皮下组织中。所有小鼠都是雌性的，在实验当天，肿瘤的重量为54.2±29.8mg。在使用当天制备每毫升含有100μg制剂的99mTc-EC20母液，并且它的放射性化学纯度大于96％。另外两种99mTc～螯合剂，99mTc-EC14和99mTc-EC28以及111In-DTPA-叶酸也被制备成＞90％的放射性化学纯度。所有溶液都用盐水本身或含有100当量叶酸(用于竞争)的盐水溶液稀释，以便最终的放射性药物浓度为10μol/mL。
在简单的乙醚麻醉期间，通过动物尾部侧静脉通过静脉注射100μl体积的大约40μmol/kg剂量的试验物品。注射之后4小时，通过二氧化碳窒息杀死动物，并且解剖。取出特定的组织，称重，并且计数，以便测定99mTc分布。对CPM值进行衰变校正，并且以每克湿重量组织的％注射剂量形式制表。
如表3所示(见下文)，含有放射性药物99mTc-EC14，99mTc-EC20和111In-DTPA-叶酸的这三种“叶酸”主要积累在FR-阳性肿瘤和肾脏中，不过所述肾脏与肿瘤相比在每克组织中浓缩了更高百分比的注射剂量(％ID/g)。有趣的是，111In-DTPA-叶酸和99mTc-EC20的净肿瘤积累几乎相同(分别为19和17％ID/g)，而99mTc-EC14的肿瘤吸收略低于大约10％ID/g。不过，所有三种制剂都表现出高的肿瘤与血液比例(＞30∶1)。
表3.叶酸放射性药物在长有皮下M109肿瘤的Balb/c小鼠体内的生物分布
*所示出的值表示来自三只动物的数据的平均值±标准误差。
通过两种不同的方法进一步证实了叶酸专一性定向。首先，当这些制剂与100倍过量的叶酸同时服用时，99mTc-EC14，99mTc-EC20和111In-DTPA-叶酸在FR-阳性肿瘤和肾脏中的积累被有效的抑制(＞94％)。其次，99mTc-EC28对照制剂不能在肾脏和肿瘤中明显积累。这两种发现都证实了完整的“类叶酸”(或蝶酸)部分是实现所述放射性药物制剂向FR-阳性组织中吸收和保留所必须的。
实施例12γ闪烁扫描法实验之前2周将M109肿瘤细胞(1×106每只动物)接种到Balb/c小鼠的右侧腋窝的皮下组织中。在进行简单的乙醚麻醉期间，通过动物尾部侧静脉静脉注射存在100μl体积中的大约50μmol/kg剂量的试验物品。注射之后4小时，通过二氧化碳窒息杀死动物，然后放置在图像获取表面的顶部。使用Technicare Omega 500 Sigma 410放射性同位素γ照相以每分钟50-75000次计数的计数速度获取整体图像1分钟时间。用装有Medasys Pinnacle软件的Medasys MS-DOS-型计算机分析所有数据。
使用这种γ闪烁扫描法证实了FR-阳性M109肿瘤和肾脏对99mTc-EC20的吸收。如图9所示，用上述99mTc-EC20注射的小鼠的腹部图像将γ辐射定位于两个肾脏(K)和M109肿瘤区(T；肩部区)。在其他身体组织中没有观察到明显的放射性示踪剂。业已报导了111In-DTPA-叶酸放射性药物的类似的图像特征。
实施例13泌尿和代谢99mTc-EC20的泌尿HPLC物种形成特征，是使用Balb/c小鼠获得的。通过尾部侧静脉用1mCi(6.7nmol)的99mTc-EC20注射小鼠(每只小鼠大约20克)。在1，4，或6小时时间之后，通过二氧化碳窒息对两只小鼠组成的组实施安乐死，并且采集尿液。在通过GV13Millex滤膜过滤之后，用装有Nova-Pak C18 3.9×150mm柱和放射性化学检测仪的HPLC系统评估放射性化学物种形成。用含有0.1％TFA的20％的甲醇，用1mL/分钟的流速对该系统进行等度洗脱。
前面确定了111In-DTPA-叶酸的主要消除途径是通过尿液。与图2所示的HPLC曲线类似，99mTc-EC20标准物和尿液样品都具有四个放射性高峰。如表4所示(参见下文)，在该实验进行的6小时时间内，标准物的放射性化学纯度(C和D峰的总和，推测相当于顺和反99mTc-EC20)保持稳定在大约93％。在该标准物(A峰)中99mTc的量为大约2％。重要的是，在该放射性化学曲线中的B峰被认为是在非常低的，不太稳定的状态下与99mTc螯合的EC20。不过，在该级分中测定的放射活性没有包含在99mTc-EC20的总体放射性化学纯度弧线中。该数据总体上表示在这6小时的研究时间中，该制剂保持稳定。
在注射到Balb/C小鼠体内1和4小时之后，小鼠尿液中的99mTc-EC20的放射性化学物种形成曲线没有改变。不过，在注射6小时之后，存在于尿液中的放射性太低，以至于不能通过HPLC精确地测定。在进行定量的4个小时期间，在尿液中回收的放射性物质的母体药物的比例保持相对稳定在大约90％。这一值与标准物质的93％的纯度非常类似，表明了99mTc-EC20被以修饰过的形式主要被分泌到尿液中。
表4.来自Balb/c小鼠的99mTc-Ec20的分泌物和代谢。通过尾部侧静脉给小鼠注射1mCi(6.7nmol)的99mTc-EC20。在标明的时间，对每组2只小鼠实施安乐死，并且采集尿液。通过HPLC测定放射性化学物种形成。利用C和D峰的面积百分比总和(顺和反异构体)计算完整90mTc EC20的总体纯度。
实施例14血清蛋白结合将新鲜的大鼠血清，和商业化男人血清(AB型供体，SigmaChemical Co.)用于评估99mTc～EC20与血清蛋白的体外结合。在99mTc-EC20与1mL的血清在室温下混合1分钟之后，将0.3mL的血清溶液转移到干净的Centrifree超滤装置(30,000NMWL)中，重复进行三次。在用所述血清溶液对离心机加样1分钟之内，在20℃下使该装置以1000×g的速度离心20分钟。将50μL所述原始溶液的样品和来自每一个装置的滤液转移到干净的试管中，并且在自动γ计数器中计数。用相同的方法对与1mL普通盐水混合的99mTc-EC20的对照溶液进行超滤。计算三种样品中每一个的游离99mTc的百分比。
尽管99mTc-EC20仅表现出与超滤装置的低水平的非专一性结合(低于5％)，发现它的70％主要与大鼠或人类血清溶液中的＞30kDa的血清蛋白级分相关(分别为69％和72％)。重要的是，由于99mTc-EC20不能有效地和优先积累在FR阳性组织中(参见表2和图8)，它对血清蛋白的表观亲和力似乎不影响这种放射性示踪剂在体内靶定FRs的能力。
实施例15组织分布研究在本实施例中使用的方法类似于例11所述方法。用FR-阳性M109和FR-阴性4T1肿瘤模型进一步评估了99mTc-EC20在体内靶定肿瘤的能力。六周大的雌性Balb/c小鼠(n＝3/剂量组)是从Harlan SpragueDawley，Inc.购买的(Indianapolis，IN)，并且在接种肿瘤细胞之前用无叶酸饮食(Harlan TEKLAD)一共维持7天时间。
用100μl含有1％同源小鼠血清的无叶酸RPMI-1640皮下接种同源的FR-阳性M109肿瘤细胞(2×106P0每只动物)或FR-阴性4T1细胞(5×105P0每只动物)。按上述方法在使用当天制备每毫升含有100μg制剂的99mTc-EC20母液。
在接种肿瘤细胞16天之后，用500或1800nmol/kg的EC20对长有M109肿瘤的动物进行静脉内注射，而对于长有4T1肿瘤的动物来说用500nmol/kg的EC20进行注射(每个剂量组3只小鼠)。所有注射体积均为100μl。在注射4小时之后，通过二氧化碳窒息杀死动物，并且通过心脏穿孔采集血液，并且对所述动物进行解剖。取出选择的组织(心脏，肺，肝脏，脾，肾，小肠，胃，肌肉和肿瘤)，称重，并且用自动γ计数器计数，并且确定99mTc分布。通过参考用该注射制剂的稀释液制备的标准物计算所述放射性药物的吸收，以湿重量组织的百分注射剂量表示(％ID/g)。
如图11所示，证实了叶酸受体-专一性定向，因为99mTc-EC20主要积累在FR-阳性M109肿瘤和肾脏中，而不主要积累在FR-阴性4T1肿瘤中。FR-阴性4T1肿瘤中的吸收比FR-阳性M109肿瘤中的吸收低7.6倍。正如所预料的，除了肾脏之外，99mTc-EC20在正常组织中的吸收较低。以上结果表明，99mTc-EC20定向是FR-专一性的。
实施例16组织分布研究在本实施例中使用的方法类似于例11所披露的方法。利用FR-阳性KB肿瘤模型评估了99mTc-EC11(肽-A1)，99mTc-EC13(肽-A3)，和99mTc-EC14(肽-A2)在体内靶定肿瘤的能力。在接种肿瘤细胞之前，用无叶酸饮食将4周大的雄性裸鼠(n＝4/组)维持10天时间。
将FR-阳性KB肿瘤细胞(0.25×106每只动物)皮下接种到膜内部位。在接种肿瘤细胞14天之后，在下面的表5所示的缀合物的剂量(大约12μg/kg)下用99mTc-EC1 1，99mTc-EC13，或99mTc-EC14对所述动物(n＝4/组)进行静脉内注射。按上述方法在使用当天制备99mTc-EC11，99mTc-EC13，和99mTc-EC14溶液的母液。给对照动物共同服用大约20倍过量的游离叶酸(大约200μg/kg)。在注射4小时之后，通过二氧化碳窒息杀死动物，并且通过心脏穿刺采集血液，并且解剖所述动物。取出选择的组织，称重，并且用自动γ计数器计数，确定99mTc分布。通过参照用所述注射制剂的稀释液制备的标准物计算湿重量组织的百分注射剂量形式的放射性药物的吸收(％ID/g)。
如表5所示，证实了叶酸受体-专一性定向，因为99mTc-EC11，99mTc-EC13，和99mTc-EC14主要积累在FR-阳性KB肿瘤和肾脏中。通过同时服用游离叶酸抑制所述积累。以上结果表明99mTc-EC11，99mTc-EC13，和99mTc-EC14在体内能够以FR-专一性方式靶定肿瘤。
用类似方法，使用99mTc-EC53(EC20的所有D-对映体)获得了类似结果(参见下面的表6)，所不同的是，99mTc-EC53的剂量大约为50μg/kg，并且可以使用100倍过量的游离叶酸或冷的EC53。如表6所示，证实了叶酸受体受体-专一性定向，这是因为99mTc-EC53主要积累在FR-阳性KB肿瘤和肾脏中。通过共同服用游离叶酸抑制了所述积累。以上结果表明，99mTc-EC53能够以FR-专一性方式体内靶定肿瘤。
表5
所示出的值表示平均值±标准误差。假设血液占总体重的5.5％。肿瘤/背景组织比例基于每克数据的相应的百分注射剂量与99mTc-叶酸-缀合物剂量共同注射的叶酸剂量n＝3
表6
讨论本发明提供了作为显象剂用于临床显象的维生素和放射性核素螯合剂的缀合物。所述显象剂的典型例子是新设计的，合成的，和放射性化学表征的叶酸-型放射性核素螯合剂，99mTc-EC20。
99mTc-EC20是叶酸的小分子量肽衍生物，它包括D-γ-Glu肽键(参见图1)，它是用有效的固相合成方法合成的。在它的天然形式下，叶酸(或蝶酰-谷氨酸)具有存在于L构型中的单一的谷氨酰残基。不过，D-Glu对映体残基被整合到EC20分子中。重要的是，与EC20类似，用D-Glu残基取代叶酸中的L-Glu残基，不会改变叶酸与所述高亲和力FR结合的能力。
在存在α-D-葡萄糖酸盐和氯化锡(II)的情况下，发现EC20能有效螯合99mTc。在通过放射性化学HPLC分析时，所得到的99mTc-EC20制剂超过95％是由顺和反立体异构体的混合物组成，各自同样能够以高亲和力与FR结合(参见图3)。所述制剂中大约3％的99mTc在EC20分子上的某些其他位点上与EC20螯合，而不是在预期的Dap-Asp-Cys部分上螯合。尽管该成分不是以最佳表征足够的量分离的，但它证实了能够以高亲和力与FR结合(参见图6)。最后，99mTc-EC20制剂中的残余的2％的放射性活性是由于游离的99mTc产生的。
99mTc-EC20表示出与FR-阳性细胞相关的时间和浓度依赖性。99mTc-EC20被很快从血液中清除(t1/2～4分钟)，对于诊断显象剂来说它是重要的。并且99mTc-EC20优选在FR-阳性肿瘤中大量积累。
使用两种不同的方法将99mTc-EC20的性能直接与类似的FR定向制剂，111In-DTPA-叶酸进行比较。首先，发现两种叶酸型放射性药物能以相同的水平与叶酸竞争结合KB FRs(参见图3和表1)。其次，每一种制剂在长有肿瘤的小鼠体内的分布几乎是相同的(参见表2)。测定了99mTc-EC20的高的肿瘤吸收和肿瘤与血液比例。综合以上结果表明，与111In-DTPA-叶酸类似，99mTc-EC20在给患者临床服用时，能有效定位于FR-阳性肿瘤。
以前业已表征了若干种叶酸型99mTc缀合物。有关99mTc-12-氨基-3，3，9，9-四甲基-5-氧杂-4，8二氮-2，10-dodecanedinoe二肟(氧杂)叶酸缀合物的生物分布数据是有限的，不过报导了示踪剂在KB肿瘤中的中等水平的(大约7％ID/g)吸收。还报导了有关99mTc-乙烯二半胱氨酸～叶酸缀合物在长有乳腺瘤的大鼠体内的生物分布的研究。给该研究中的大鼠喂食富含叶酸的食物。因此，获得了低的肿瘤吸收和低的肿瘤与血液比例。最后，证实了99mTc-6-肼基烟酰胺-肼基(HYNIC)叶酸衍生物(HYNIC-叶酸)在24JK-FBP肿瘤中大量积累。有趣的是，99mTc-EC20在M109肿瘤中的积累水平几乎与HYNIC-叶酸在241K-FBP肿瘤中的积累水平相同(大约17％ID/g)(表2)。在静脉注射之后4小时，这两种制剂还表现出大约50∶1的肿瘤与血液的比例。
总之，制备了一种能够有效螯合99mTc的新的叶酸的肽衍生物。这种新的化合物99mTc-EC20能在体外和体内高亲和力的与FR-阳性肿瘤细胞结合。发现EC20能够以非常高的亲和力(KD大约为3nM)以时间和浓度决定型方式与培养的叶酸受体(FR)-阳性肿瘤细胞结合。通过体外相对亲和力测定，发现在单独存在或作为合成的金属螯合剂存在时，EC20能够与3H-叶酸有效竞争细胞结合。在静脉注射到Balb/c小鼠体内之后，99mTc-EC20被迅速地从循环系统中清除(血浆t1/2大约4分钟)，并且以未代谢过的形式分泌到尿液中。用长有M109肿瘤的Balb/c小鼠进行的γ闪烁扫描和定量生物分布研究的数据证实了99mTc-EC20主要积累在FR-阳性肿瘤和肾组织中。以上结果表明，99mTc-EC20是有效的，非破坏性的放射性诊断显象剂，可用于检测FR-阳性肿瘤。还证实其他EC20-相关的显象剂是有效的，包括EC11，EC13，EC14，和EC53。
在美国，每年大约有26,000个女性被诊断患有卵巢癌，并且在这些女性中存活超过5年时间的人不超过50％。导致低存活率的一个原因是，这种癌症的诊断的难度。由于担心未确定的腹部团块的破裂和潜在的癌症在腹腔中的扩散，通常不进行细针生物活组织检查。相反，受怀疑的卵巢团块的诊断和定期通常是通过剖腹手术进行的，这是一种破坏性的和昂贵的手术。由于99mTc-EC20与大量存在于卵巢癌上的FR紧密结合(包括其他癌)，这种放射性药物提供了一种廉价的，非破坏性的，但是可靠的用于恶性卵巢癌的早期诊断的方法。重要的是，通过可能的更明确的和更早的诊断疾病的复发或残余的疾病99mTc-EC20还能帮助指导临床确诊过程。
权利要求
1.一种具有以下结构式的化合物 其中，V是维生素，它是受体-介导的体内跨膜转运的底物，或维生素受体结合衍生物或其类似物；L是二价连键；R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链；M是放射性核素的阳离子；n是1或0；而k是1或0。
2.权利要求1的化合物，其中，V是选自叶酸，核黄素，硫胺素，维生素B12，和生物素的维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物。
3.权利要求1的化合物，其中，所述放射性核素选自镓，铟，铜，锝，和铼的同位素。
4.权利要求3的化合物，其中，所述放射性核素是锝的同位素。
5.权利要求1的化合物，其中，V是叶酸，或叶酸受体结合类似物或其衍生物。
6.一种用于诊断显象的组合物，它包括具有以下结构式的化合物 其中，V是维生素，它是受体-介导的体内跨膜转运的底物，或维生素受体结合衍生物或其类似物；L是二价连键；R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链；M是放射性核素的阳离子；n是1或0；和它的可以药用的载体。
7.权利要求6的组合物，其中，所述化合物中的V是选自叶酸，核黄素，硫胺素，维生素B12，和生物素的维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物。
8.权利要求6的组合物，其中，化合物中的所述放射性核素选自镓，铟，铜，锝，和铼的同位素。
9.权利要求8的组合物，其中，所述化合物中的所述放射性核素是锝的同位素。
10.权利要求6的组合物，适合肠胃外服用。
11.权利要求6的化合物，其中，V是叶酸，或叶酸受体结合衍生物或其类似物。
12.一种对动物体内的一群细胞进行显象的方法，其中，所述细胞以这些细胞表面上的维生素受体为特征，所述方法包括以下步骤给所述动物服用有效量的包括具有以下结构式的化合物的组合物 其中，V是所述维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物，对所述细胞表面维生素受体专一；L是二价连键；R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链；M是放射性核素的阳离子；n是1或0；和它的可以药用的载体；并且监测所述化合物在所述动物体内的生物分布。
13.权利要求12的方法，其中，所述化合物中的V是选自叶酸，核黄素，硫胺素，维生素B12，和生物素的维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物。
14.权利要求12的方法，其中，化合物中的所述放射性核素选自镓，铟，铜，锝，和铼的同位素。
15.权利要求14的方法，其中，所述化合物中的所述放射性核素是锝的同位素。
16.权利要求12的方法，其中，所述组合物是通过肠胃外途径给患者服用的。
17.权利要求12的化合物，其中，V是叶酸，或叶酸受体结合衍生物或其类似物。
18.一种具有以下结构式的化合物 其中，V是维生素，它是受体-介导的体内跨膜转运的底物，或维生素受体结合衍生物或其类似物；L是二价连键；R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链；M是放射性核素的阳离子；n是1或0；和k是1或0。
19.一种用于诊断显象的组合物，它包括具有以下结构式的化合物 其中，V是维生素，它是受体-介导的体内跨膜转运的底物，或维生素受体结合衍生物或其类似物；L是二价连键；R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链；M是放射性核素的阳离子；n是1或0；和它的可以药用的载体。
20.一种对动物体内的一群细胞进行显象的方法，其中，所述细胞以这些细胞表面上的维生素受体为特征，所述方法包括以下步骤给所述动物服用有效量的包括具有以下结构式的化合物的组合物 其中，V是所述维生素，或维生素受体结合衍生物或其类似物，对所述细胞表面维生素受体专一；L是二价连键；R是具有结构式H2NCHRCOOH的氨基酸的侧链；M是放射性核素的阳离子；n是1或0；和它的可以药用的载体；和监测所述化合物在所述动物体内的生物分布。
全文摘要
本发明涉及通过利用维生素作为显象剂的定向配体将放射性核素型显象剂导引到具有维生素受体，或维生素受体结合衍生物或其类似物的细胞的化合物和方法。本发明提供了用于所述方法的具有结构式(I)或(II)的化合物。在所述化合物中，V是维生素，它是受体－介导的体内跨膜转运的底物，或维生素受体结合衍生物或其类似物，L是二价连键，R是结构式为H
文档编号A61K51/04GK1662263SQ03814683
公开日2005年8月31日 申请日期2003年5月6日 优先权日2002年5月6日
发明者C·P·利蒙, M·A·帕克 申请人:恩多塞特公司