专利名称：通过用电场改变跨细胞膜的离子流动而治疗疾病的方法
相关申请的交叉引用本申请要求以下申请的优先权申请日为2003年4月17日的美国申请No.10/417,142、申请日为2002年12月17日的美国临时申请No.60/433,766、以及申请日为2002年7月30日的美国临时申请No.60/399,249。上述各申请以及申请日为2001年12月14日的美国申请No.10/017,105均以其全部内容并入本文作为参考。
背景技术：
已知的电治疗装置有多种。典型地，装置的电极与患者接触，在这种情况中，电治疗装置使用施加的电流，因此可称之为电流治疗装置，实例包括TENS或PENS(Ghoname，E.A.等，Anesth.Analg.，88841-46(1999)；Lee，R.C.等，J Burn Care Rehabil.，14319-335(1993))。
如果电极不与患者接触，这种电治疗装置通过外部的电场(简称EF)在患者体内感应产生电流，因此可称之为电场或电势治疗装置。EF在所有置于其中的导体(包括动物或人体)上产生表面电荷。当施加EF时，在一个导体的相对的两面上会分别出现正电荷和负电荷。当电场交替变化时，电荷所处的位置将交替变化，由此在导体内产生交流电(见Hara，H.等，Niigata Med.，75265-73(1961))。
1972年，日本卫生福利部批准了一种电刺激装置(批准号14700BZZ00904)。1978年，美国FDA批准了以电刺激治疗骨骼疾病。不过，有关治疗方面的文献所报道的对电刺激产生的生物学反应却是多种多样的。例如，已经发现，外部正弦交互电场(ac EF)可改变细胞形态、成纤维细胞内的蛋白质合成、整合的膜蛋白的重新分布、软骨细胞内的DNA合成、细胞内钙离子浓度、人肝癌细胞内的微丝结构、以及血液中的电解质水平等等(Kim，Y.V.等，Bioelectromagnetics，19366-376(1998)；Cho，M.R.等，FASEB J.，13677-682(1999)；Hara，H.，Niigata Med.，75265-73(1961))。一些研究者认为，所观察到的很多效应并不是由电场直接产生的，而是电场影响一些主要的细胞结构例如膜受体复合体和离子转运通道的继发效应。
尽管关于感应电流(induced current)的生物学效应的研究已经持续了25年，但绝大多数这方面的研究的目的在于暴露于来自高压电输送线路和相关电气装置的强电场或强磁场中的人员的安全问题。例如，Utility公司的工人常规暴露于50-500kV/m的电场以及高达5G的磁场中，而一般的公众通常暴露于1-10kV/m的电场以及高达2G的磁场中(Portier，C.J.& Wolfe，M.S.(eds.)Assessment of Health Effects from Exposure toPower-line Frequency Electric and Magnetic Fields，NIEHS Publ.No.98-3981(National Institute of Environmental Health Sciences，1998))。现有技术中尚缺乏有关相对较低的电压和较弱的电场的效应的充分研究。此外，常规的电场治疗装置采用高电压且不能解释穿过肌体形态学的不同区域的电场强度的差异。
简言之，如Sporer在美国专利No.5,387,231中所述“现有技术还没有预见到用于进行真正有效的电治疗的适当的、有效的电学参数的组合。现有技术的仪器通常以非常高的电压或非常高的电流而运行，两者在被处理的组织均能够产生透热效应。在很多情况中，现有技术可能提及各种不同电学参数中的这一种或那一种，但总是没有考虑其他参数的重要性。”现有技术展示出迥然不同的生物学反应，并依赖于不精确的测量方式，且关注的是高电压和高电流的效应，正因如此，目前亟需鉴定出用于电治疗法的特异性参数，特别是用于采用相对较低的电压和电流的电治疗法的特异性参数。
发明内容
本发明人已经确定了能够成功治疗一些特定疾病的EF和施加电流的参数值。这些参数包括，例如，频率(赫兹)、电压(伏特)、感应电流密度(mA/m2)、施加电流密度(mA/m2)、个体持续暴露的持续时间(分钟、小时和天)、以及暴露的总持续时间(可以是一次持续暴露或多次持续暴露的总和)。
在此，“平均”施加电流密度和“平均”感应电流密度指的是，在至少一种所关注的生物体的细胞膜上产生的、每单位面积的平均电流，所述的生物体例如为人、动物、植物、或其部分、或其细胞。例如，如果所关注的生物体是人且所关注的部分是人的整个手，那么平均电流密度是整个手的平均值，也就是说，平均电流密度是手的各部分的电流密度的和除以各部分的面积的和所得的值。用于估算平均施加电流密度和平均感应电流密度的具体的公式和技术将在下文中描述。除非另有明确的说明，否则术语“生物体”涵盖了人以及其他类型的生物体。
本发明的一个实施方式依赖于施加电流。优选地，施加电流密度在大约10至大约2,000mA/m2的范围内。
本发明的另一个实施方式依赖于极低量的感应电流以控制跨细胞膜的离子运动。为了治疗引起生物体细胞内离子浓度异常的疾病或由生物体细胞内离子浓度异常所引起的疾病，该感应电流实施方式包括将生物体置于一外部电场中，该电场在细胞膜上产生的平均感应电流密度为大约0.001mA/m2至大约15mA/m2，优选地大约0.001mA/m2至大约10mA/m2，更优选地大约0.01mA/m2至大约2mA/m2。在优选的实施方式中，外部电场(E)根据方程式E＝I/εoωS进行测量，其中S是电场测量传感器的截面，εo是在真空中的感应速率(induction rate)，I是电流，ω0是2πf，f是频率。同样优选地是以方程式J＝I/B来测量感应电流(J)，其中I是测得的电流，B是圆面积，表示为B＝A2/4π，A是圆周，表示为A＝2πr，而r是半径。在本发明的另一个优选的实施方式中，在细胞膜上产生的感应电流密度持续的时间为大约10分钟至大约240分钟。在重复运用中，产生的平均感应电流密度优选地额外持续大约30分钟至大约90分钟，优选地产生的总体暴露时间低于大约1500分钟。
本发明的施加电流和感应电流的实施方式均可应用于整个肌体或仅应用于肌体的一部分。肌体的一部分可包括肢体、器官、特定的躯体组织、肌体的区域例如躯干、躯体的系统或其更加细分的部分。训练有素者能够确定一种具体的疾病究竟是需要将本发明应用于全身还是应用于局部。
本发明还进一步包括为生物体提供一种钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或这些添加剂的组合。优选地，凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
在优选的实施方式中，本发明改变了或以其他方式影响了钙或其他阳离子或多价阳离子(包括细胞外液中的阳离子电解质和蛋白质)的流动，而上述成分在激活与Ca++摄取有关的电敏感性钙受体(CaR)方面具有关键的作用。
本发明的另一个实施方式涉及一种用于电场治疗的装置。优选的电场治疗装置是一种电场治疗仪器，其包括一个主电极(main electrode)和一个对置电极(opposed electrode)；用于给所述电极施加电压的电压发生器；感应电流发生器，其通过改变对置电极与生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；以及一种用于驱动电压发生器的电源。优选地，电压发生器具有升压线圈(booster coil)并以该升压线圈的中点或一端接地。
本发明的一种更加优选的电场治疗装置具有一个主电极和一个对置电极，该对置电极被置于人体的头部、肩部、腹部、腰部或臀部附近，该对置电极与该人体躯干区域之间的距离是大约1到25cm，更优选地大约1到15cm。在另一种形式中，对置电极是天花板、墙壁、地板、家具或房间内的其他物体或表面。
另一个可选择的实施方式涉及确定用于电场治疗或施加的电流治疗的最佳参数。一种用于确定电场治疗的最佳参数的优选的方法包括以下步骤(i)鉴别一种要在活的生物体中引发的所需的生物学反应；(ii)选择或测量生物体中或来自该生物体的组织样品或培养物中的细胞膜上的平均感应电流密度；(iii)选择或测量在与所述生物体、样品或培养物相距为一特定距离时产生该选定的或测得的感应电流密度的外部电场；(iv)选择或测量一段持续时间以在膜上产生该选定的或测得的感应电流密度；(v)给所述生物体、样品或培养物施加该选定的或测得的电场以便在细胞膜上产生该选定的或测得的感应电流密度并达到该选定的或测得的持续时间；(vi)确定该所需的生物学反应发生的程度；(vii)任选地重复进行步骤(ii)至(vi)中的任何步骤；和/或(viii)鉴别以最佳方式引发所需的生物学反应的所述选定的或测得的感应电流密度的值、所述选定的或测得的外部电场的值、或所述选定的或测得的持续时间的值。就这种实施方式来说，术语“测量”涵盖了这样一些情况，即其中的实验者并未有意地选定、故意地选定或最初便预先选定该参数的值。例如，在术语测量所涵盖的情况中，一种电场装置产生一个随机量的或者最初是未知量的平均感应电流密度，其后由研究者直接或间接确定该量是多少。
通过以下的附图和详细说明对本发明做进一步的阐述。
图1显示了一种电场暴露系统中的场暴露盘(field exposure dish)。
图2显示了暴露于电场之后的存活细胞的百分数。
图3显示了在暴露于和未暴露于电场的含有12.5μg/ml Con-A的细胞悬液中，高[Ca2+]c细胞的数量均明显升高。
图4A和4B概况了暴露于电场的含有不同浓度的Con-A、含有或不含有1mM的CaCl2的细胞培养物的结果。
图5显示了在暴露于和未暴露于电场的、含有植物凝集素(phytohemaglutinin，PHA)的细胞中，高[Ca2+]c细胞的数量均明显升高。
图6显示，与以0.025μg/ml的Con-A进行刺激的细胞相比，添加3.125-12.5μg/ml的Con-A时，在暴露于或未暴露于电场的细胞中，高[Ca2+]c细胞的数量明显升高。
图7说明在脾细胞中，ConA诱导的钙离子浓度升高。
图8显示了以终浓度为0.4μM的A23187进行刺激的BALB 3T3小鼠胚胎细胞中，DiBAC染料亮度变化的时间过程。
图9显示了产生的电流密度为大约200μA/cm2的100Hz的电场(EF)对BALB 3T3膜电位的影响。
图10也显示了产生的电流密度为大约200μA/cm2的100Hz的电场(EF)对BALB 3T3膜电位的影响。
图11显示了应激对血浆促肾上腺皮质激素(在此称为“ACTH”)水平的影响。
图12A和12B显示了暴露于电场对正常大鼠(A)和卵巢切除大鼠(B)的血浆ACTH的影响。
图13显示了暴露于电场对正常大鼠的血浆ACTH水平的影响(n＝6)。
图14A和14B显示了在正常的大鼠(A)和卵巢切除的大鼠(B)中，暴露于电场对限制活动(restraint)所诱导的血浆葡萄糖水平变化的影响。
图15A和15B显示了在正常的大鼠(A)和卵巢切除的大鼠(B)中，暴露于电场对限制活动所诱导的血浆乳酸水平的影响。
图16显示了在卵巢切除的大鼠中，暴露于电场对限制活动所诱导的血浆丙酮酸水平的影响。
图17显示了在卵巢切除的大鼠中，暴露于电场对限制活动所诱导的白细胞(WBC)计数的影响。
图18示范性说明了使用电场治疗装置产生的电场的概念图，在此为来自Hakuju Institute for Health Science的BioniTron Chair。
图19是本发明的一种优选的电场治疗仪器的示意图。
图20A和20B显示了另一种优选的电场治疗仪器。
图21A和21B显示了另一种优选的电场治疗仪器。
图22的图表显示了电场治疗仪器的一种优选的电路图。
图23A是一个模拟人体的主视图，图23B是透视图，而图23C的视图显示了连接于颈部的电场测量传感器。
图24显示了用于测量由电场治疗仪器所产生的感应电流的装置。
图25显示了施加的电压与感应电流之间的关系。
图26显示了头部电极的位置与在颈部感生的电流之间的关系。
图27说明了未接地的人体的不同位置的感应电流密度(mA/m2)。
图28显示了暴露于电场对人的各种症状的缓解作用。
具体实施例方式
A.调节跨细胞膜例子流动的方法离子失衡既可以是疾病或病症的结果，也可以是医学治疗或补充的不良反应。本发明通过在细胞膜上产生电流而改变跨细胞膜离子流动。本发明还影响细胞膜的成分，例如跨膜蛋白。本发明可恢复或平衡细胞的离子动态平衡或改变细胞膜的膜电位。因此，本发明可用于预防或治疗与细胞内和细胞外离子浓度相关的疾病，例如与钙(Ca2+)、镁(Mg2+)、钠(Na+)、钾(K+)和氯(Cl-)浓度相关的疾病。
为了治疗与血清钙浓度相关的疾病，在细胞膜上产生的平均感应电流密度优选地为大约0.3mA/m2至大约0.6mA/m2，更优选地大约0.4mA/m2至大约0.5mA/m2，最优选地为大约0.42mA/m2。使用施加电流来治疗与血清钙浓度相关的疾病，平均施加电流密度优选地为大约60mA/m2至大约2,000mA/m2，且在细胞膜上产生的平均施加电流密度的持续时间为大约1分钟至大约20分钟，更优选地大约2至大约10分钟。
可用于本发明的方法的组织包括例如，肌肉骨骼组织、中枢和周围神经系统组织、胃肠道系统组织、生殖系统组织(男性和女性)、呼吸系统组织、心血管系统组织、内分泌系统组织、免疫系统组织、淋巴系统组织和泌尿生殖系统组织。
真核细胞的生物膜例如质膜对这些离子具有选择性通透性。这种选择性通透性可使得建立一种跨膜膜电位。细胞利用这种膜电位来转运分子通过细胞膜。与产生膜电位相关的离子中有许多具有至关重要的功能。例如，肌细胞中的钙离子达到域浓度便产生收缩。在胰腺系统的外分泌细胞中，钙离子达到域浓度触发消化酶的分泌。相似地，不同浓度的钠和钾离子对于电冲动通过神经轴突的传导是至关重要的。
离子浓度和膜电位通过称为电压门控离子通道(voltage-gated ionchannels)的一大类蛋白质来维持。电压门控离子通道是跨膜蛋白，具有离子选择性孔，可使得离子通过生物膜，这取决于通道的构象状态(conformational state)。通道的构象受到一个电压敏感部分的影响，该部分具有携带电荷的氨基酸可与膜电位发生反应。通道可以是导电的(开放的/激活的)或非导电的(关闭的/失活的)。
由于特定的离子(即Ca2+)与心血管的健康相关，因此本发明可用于预防或治疗心血管疾病。这些疾病包括，例如，心肌病、扩张充血性心肌病、肥厚性心肌病、心绞痛、变异性心绞痛、不稳定心绞痛、动脉硬化、动脉瘤、腹主动脉瘤、外周动脉疾病、血压疾病如低血压和高血压、体位性低血压、慢性心包炎、心律不齐、心房纤颤和房扑、心脏病、左室肥大、右室肥大、心动过速、房性心动过速、室性心动过速、以及高血压。
本发明还可用于预防或治疗血液的疾病。这些疾病包括，但不限于，低钠血症、高钠血症、低钾血症、高钾血症、低钙血症、高钙血症、低磷血症、高磷血症、低镁血症、和高镁血症，以及血糖调节性疾病如糖尿病、成年起病的糖尿病和少年糖尿病。
在本发明的一个实施方式中，将凝集素与电场共同施用以增加跨细胞膜的Ca2+流动。可用于本发明的凝集素包括，例如，伴刀豆凝集素A(ConA)和麦胚凝集素。在另一个实施方式中，本发明所产生的离子流动是通过钙添加剂共同产生的。在另一个实施方式中，本发明所产生的离子流动是通过维生素D添加剂共同产生的或通过钙添加剂和维生素D添加剂共同产生的。本发明的维生素D添加剂包括，例如，维生素D2(ergocalciferol)和维生素D3(cholecalciferol)。相似地，本发明的方法可与一种补充光源一同施用，后者可施用于生物学样品或患者的表面。该光源所发射的波长的范围为大约225纳米至大约700纳米。在本发明的一个实施方式中，与本发明的方法一同使用的光源的波长的范围为大约230纳米至大约313纳米。
在本发明的另一个实施方式中，另一种分子可与本发明产生的离子流动一同转移通过细胞膜。所述可与离子流动一同转移的另一种分子可以是由肌体天然产生的，或者可以是通过添加而提供的(例如通过维生素等等)。例如，跨细胞膜的钙离子流动可增加细胞对葡萄糖的摄取。可与本发明产生的离子流动一同转移通过细胞膜的另一种分子包括营养药(neutraceuticals)(例如目的在于预防或治疗疾病和/或病症而有计划地且定量地补充的一种营养添加剂)。此外，本发明的方法可与高营养治疗(例如为了治疗一些疾病而施用超过正常需求的营养物，所述疾病例如为昏迷或重度烧伤或胃肠道疾病)相结合应用。
实施例1-60Hz电场在经凝集素刺激的小鼠脾细胞中上调细胞质的钙(Ca2+)水平用于本实验的电场暴露系统由以下4部分组成由聚碳酸酯制成的场暴露盘；功能发生器(SG-4101，IWATSU Co.Ltd.，Tokyo，Japan)；数字型万用表(VOAC-7411 IWATSU，Tokyo，Japan)；以及控制器(Hakuju Co.Ltd.，Tokyo，Japan)。图1所示为电场暴露系统中的场暴露盘。场暴露盘由盖子、盘状容器和环形插入体(内部直径12mm)组成。通过功能发生器在2个环形铂电极之间(细胞培养物空间)产生电场，并通过控制器和数字型万用表进行精细调节。通过测量场暴露盘的细胞培养物空间内的电流密度确定60Hz电场的场强。
通过下式计算电流密度电流密度＝I/S，其中“I”是施加电流(μA)，S是细胞培养物空间(0.36π)的面积(cm2)。因此，可按照如下计算电流密度电流密度＝0.885I[μA/cm2]。
在进行电场暴露之前，将大约1.5ml的分析缓冲液(137mM NaCl，5mM KCl，1mM Na2HPO4，5mM葡萄糖，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，0.1％(w/v)BSA和10mM HEPES pH7.4)注入电极室。为了避免细胞与下方电极接触，将聚碳酸酯膜(Isopore，MILLIPORE，MA USA)置于盘状容器和插入体之间。将大约1ml的细胞悬液注入培养孔/空间并盖上盖子。
制备细胞4-7周龄的雌性BALB/c小鼠得自CLEA公司(Tokyo，Japan)，装备了清洁空气过滤装置的常规动物房中喂养，这些小鼠经麻醉后切除脾脏，制备脾细胞的细胞悬液。为测定细胞活力，将细胞培养于添加了10％胎牛血清(FSB)的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(SIGMA，MO，USA)中。在细胞制备完毕后4小时进行[Ca2+]c的测定，在测定[Ca2+]c的过程中，细胞被维持于Hank′s平衡盐溶液(HBSS)(SIGMA，MO，USA)。细胞在使用前被存放于4℃。
测定暴露于电场的细胞的活力将小鼠脾细胞(5×106细胞/ml)暴露于60Hz的6μA/cm2或60Hz的60μA/cm2的电场达30分钟和24小时，37℃，5％CO2。将假处理细胞(对照细胞)置于场暴露盘达30分钟和24小时，但不暴露于电场。在暴露后30分钟和24小时自场暴露盘收集细胞悬液，将细胞悬液以2.5μg/ml的碘化丙啶染色达30分钟，4℃，然后以流式细胞仪分析死细胞。制备细胞用于分析高[Ca2+]c细胞和使用的凝集素将脾细胞(106细胞/ml)在含有2.5μM fluo-3-acetoxylmethyl(Molecular Probes，USA)[Vandenberghe等，1990]的HBSS中在37℃孵育20分钟。然后将细胞悬液以含有1％FBS的HBSS稀释5倍，在37℃孵育40分钟，以分析缓冲液洗涤3次，然后将细胞以1×106/ml的浓度悬浮在分析缓冲液中。在制备细胞的整个过程中，将细胞悬液轻柔地混合。
考虑到有报道认为EMF与有丝分裂原之间具有协同性相互作用(Walleczek and Liburdy，1990)，因此使用了伴刀豆凝集素A(Con-A)(Seikagaku Co.，Tokyo，Japan)和植物凝集素(PHA)(SIGMA，MO，USA)。为了确定60Hz(6μA/cm2)EF对产生高[Ca2+]c细胞的影响的实验设计考虑到先前的暴露的鼠的脾细胞活力测试的结果，我们在进行以下5组实验时选择采用最佳的培养和暴露条件(60Hz，6μA/cm2EF)
(1)将悬浮于HEPES缓冲盐溶液(BS)+1mM CaCl2中的细胞暴露于EF总共40分钟，在暴露开始后第8分钟加入12.5μg/ml的Con-A。对照组为含有Con-A的未暴露于EF的细胞以及不含Con-A的暴露于电场的细胞。在特定的暴露时间点测定高[Ca2+]c细胞的百分比；(2)将HEPES-BS+1mM CaCl2中的细胞暴露共12分钟，在暴露开始后第4分钟加入不同浓度(1ng-12.5μg/ml)的Con-A。对照组基本上与实验组相同但不进行EF暴露；(3)将HEPES-BS+1mM CaCl2中的细胞暴露总共8分钟，在暴露开始后第4分钟加入5μg/ml的PHA。对照组为含有PHA的未暴露于EF的细胞以及不含PHA的暴露于电场的细胞；(4)将悬浮于无CaCl2的HEPES-BS中的细胞暴露总共12分钟，在暴露开始后第4分钟加入不同浓度(1ng-5μg/ml)的Con-A。对照组基本上与实验组相同但不进行EF暴露；以及(5)为了评价EF暴露的持久效应，将悬浮于HEPES-BS+1ml CaCl2的细胞暴露总共4分钟，然后加入不同浓度(0.025-12.5μg/ml)的Con-A，然后在无EF暴露的情况下用流式细胞仪监测随后8分钟内高[Ca2+]c细胞的产生情况。对照组基本上与实验组相同但不进行任何EF暴露。
统计学分析采用Student′s T检验进行确定细胞活力的统计学分析。通过ANOVA(组间方差分析)、Student′s T检验和配对T检验分析各组间由EF暴露对[Ca2+]c产生的效应的结果。所有的统计学计算均采用MUS-EXCEL日文版本进行(Microsoft Office softwareVer.9.0.1，Microsoft Japan Inc.Tokyo，Japan)。
结果图2显示了EF暴露后的活细胞的百分比。在所有三组一式二份的样品中，暴露于6μA/cm2或者60μA/cm2后有超过98％的细胞是活的。
在含有12.5μg/ml Con-A的暴露于和未暴露于电场的细胞悬液中高[Ca2+]c细胞的数量均明显升高(图3)。在图3中，圆形代表暴露于EF的无Con-A的悬液，三角形代表暴露于EF的含有Con-A的悬液，而方形代表未暴露于EF的含有Con-A的悬液。那些暴露于电场的无Con-A的细胞悬液基本上保持不变。Con-A诱导的反应在加入有丝分裂原后立即出现且在加入有丝分裂原5-8分钟后达到饱和。在暴露于和未暴露于EF的Con-A诱导的细胞之间无明显差异(P＞0.05)。
图4A和4B概括了暴露于电场的、含有不同浓度的Con-A、加或不加1mM的CaCl2的细胞培养物的结果。图4A显示了加了1mM的CaCl2的培养物的结果。在图4A中，暴露于EF的培养物(黑色条形)和未暴露于EF的培养物(白色条形)均含有1mM的CaCl2，并含有不同浓度的Con-A(0.01μg/ml至5μg/ml)。在存在CaCl2的情况下(图4A)，EF显著升高Con-A依赖性[Ca2+]c(P＜0.01ANOVA)。尽管高[Ca2+]c细胞的升高在0.675-5.0μg/ml Con-A刺激组更为明显，但仅在1.25μg/ml和2.5μg/mlCon-A诱导的细胞至显示出显著的差异(P＜0.05配对T检验)。在图4B中，暴露于EF的培养物(黑色条形)和未暴露于EF的对照培养物(白色条形)均含有不同浓度的Con-A，但不含有CaCl2。在无Ca2+的细胞条件下，对照组和EF暴露组中Con-A依赖性[Ca2+]c升高均可以忽略(图4B)。
为了确定是否EF依赖性[Ca2+]c上调仅限于Con-A，还分析了PHA刺激的细胞。暴露于和未暴露于电场的含有PHA的细胞均记录到高[Ca2+]c细胞的明显升高(图5)。不过，暴露于电场的细胞与未暴露组相比更明显(P＜0.05配对T检验)。
在未暴露于或者以前暴露于EF达4分钟的细胞悬液中加入3.125-12.5μg/ml的Con-A，与以0.025μg/ml的Con-A刺激的那些细胞相比，高[Ca2+]c细胞明显增加(图6)。以3.125和6.25μg/ml的Con-A刺激的细胞显示出高[Ca2+]c细胞的持久升高，其在Con-A刺激后大约8分钟才下降，而以更高浓度的Con-A(12.5μg/ml)刺激的细胞培养物则在Con-A刺激后大约4分钟出现高[Ca2+]c细胞的下降。仅在6.25μg/ml的Con-A的情况下，才在2-4分钟时观察到明显的EF暴露的增加作用(P＜0.05配对T检验)。
实施例2-低频电场对血管活性物质在人血管内皮细胞中诱导的细胞内钙(Ca2+)应答的影响为评价EF对人血管内皮细胞(此后称为HUVEC)的影响，测定了以ATP和组胺刺激的HUVEC中的细胞内钙水平。为评价EF对HUVEC的影响，将HUVEC暴露于50Hz(30,000V/m)的EF，3,000伏特。估计EF在HUVEC上产生的感应电流密度为0.42mA/m2。HUVEC暴露于这些测试参数的时间为24小时。
暴露后，通过fluo3流式细胞仪测定细胞浆内的游离Ca2+浓度。以实时暴露(real-exposure)共聚焦激光显微镜确定了fluo3图象强度的变化。结果证实EF升高了HUVEC中的钙浓度。
B.治疗增殖性细胞疾病的方法为了治疗增殖性细胞疾病，特别是那些涉及分化的成纤维细胞的增殖性细胞疾病，在细胞膜上产生的平均感应电流密度优选地为大约0.1mA/m2至大约2mA/m2，更优选地大约0.2mA/m2至大约1.2mA/m2，且更加优选地为大约0.29mA/m2至大约1.12mA/m2。以施加电流在细胞膜上产生的平均施加电流密度优选地为大约10mA/m2至大约100mA/m2。
成纤维细胞是来自胚胎中胚层组织的细胞类型。成纤维细胞能够在体外进行培养，病分泌基质蛋白例如层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原。培养的成纤维细胞通常不如组织中的成纤维细胞的分化程度高。不过，经过适当的刺激，成纤维细胞能够分化为多种类型的细胞，例如脂肪细胞、结缔组织细胞、肌肉细胞、胶原纤维等等。
既然成纤维细胞功能分化为多种与结缔组织和肌肉骨骼系统相关的细胞类型，那么可采用在体内或体外控制未分化的成纤维细胞生长的方法来控制来自成纤维细胞的分化的细胞的生长。例如，可通过防止成纤维细胞生长的方法来控制或防止肌肉骨骼系统组织的过度增殖性疾病。我们发现，在细胞膜上产生大约10、50或100mA/m2的施加电流密度，持续时间为24小时/天，至少7天，这以一种电流密度依赖性方式抑制了培养的成纤维细胞细胞的生长。
过度增殖性疾病包括，例如，结缔组织和肌肉骨骼系统组织相关性肿瘤，如纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索癌和脂肪肉瘤。其他可用本发明的方法预防、改善或治疗的过度增殖性疾病包括，例如，恶性肿瘤的进展和/或转移，如位于腹部、骨骼、脑、乳腺、结肠、消化系统、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、肝脏、淋巴系统、神经系统(中枢和外周)、胰腺、骨盆、腹膜、皮肤、软组织、脾脏、喉以及泌尿生殖道的肿瘤，白血病(包括急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、原粒、早幼粒、粒单、单核细胞、红白血病)、淋巴瘤(包括Hodgkins病和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、结肠癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、支气管癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、血管肉瘤、淋巴血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、淋巴血管内皮细胞肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、Ewing′s肉瘤、平滑肌肉瘤、燕麦细胞癌、基底细胞癌、胰腺癌、肾细胞癌、Wilm’s瘤、肝癌、胆管癌、腺癌、上皮细胞癌、黑色素瘤、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、emangioblastoma、听神经瘤、menangioma、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、膀胱癌、胚胎癌、囊腺癌、髓样癌、绒癌和精原细胞瘤。
实施例3-EF暴露对鼠脾细胞和3T3/A31成纤维细胞内Ca2+浓度的影响对鼠脾细胞的影响为了确定EF对鼠脾细胞内钙离子浓度的影响，将鼠脾细胞暴露于特定的60Hz的EF。将小鼠麻醉，切除脾脏。在60mm的平皿中，给脾脏注射PBS(磷酸缓冲盐溶液，含0.083％NH4Cl)。将细胞重悬并维持于Hank′s平衡盐溶液(HBSS)(SIGMA，MO，USA)，测定[Ca2+]c，该测定在细胞制备后4小时内进行。使用前将细胞置于4℃。
给脾细胞细胞施加60Hz的EF产生的施加电流密度为6、20、60和200μA/cm2。将脾细胞细胞暴露于这些条件达4分钟，其后以伴刀豆凝集素A(ConA)刺激脾细胞样品。以ConA刺激脾细胞后，以fluo3流式细胞仪测定细胞浆内的Ca2+浓度。
本实验证实，ConA升高了脾细胞内的钙浓度。钙离子浓度随施加的6-200μA/cm2的EF升高。更重要的是，钙离子浓度的升高依赖于电流密度(见图7，其中Y轴为钙浓度而x轴为时间，分钟)。
对BALB 3T3的影响为了确定EF对鼠3T3/A31成纤维细胞内的钙离子浓度的影响，将3T3细胞置于60Hz的EF。3T3来自日本原生动物性疾病国立研究中心(Japanese National Research Center for Protozoan Disease)细胞库，在37℃培养于DMEM，含5％FCS和10mM HEPES。
EF在细胞上产生的施加电流密度为200μA/cm2。暴露2分钟后，以fluo3流式细胞仪测定细胞浆游离Ca2+浓度，发现细胞内的钙浓度升高。以共聚焦激光显微镜确定了fluo3图象密度的变化。
实施例4-钙离子载体(Calcium Ionophore)和EF对BALB 3T3膜电位的影响图8显示，钙离子载体改变了鼠BALB 3T3/A31成纤维细胞/胚胎细胞的膜电位。图8显示了以终浓度为0.4mM的A23187刺激的BALB 3T3细胞中DiBAC强度随时间的变化。A23187是一种来自Streptomyceschartreusensis的一元羧酸，其可作为一种移动载体式(mobile-carrier)钙离子载体。DiBAC是一种荧光染料，当细胞膜电位变化时，DiBAC可进入细胞膜。因此，当BALB 3T3细胞的膜发生去极化时，DiBAC进入细胞膜，由此使BALB 3T3细胞中的DiBAC信号强度(Y轴)升高。
图9显示了100Hz的电场(EF)对BALB 3T3的膜电位的影响，该EF产生的电流密度为大约200mA/cm2。以流式细胞仪来测量膜电位的变化。流式细胞仪的方法学如下。给DMEM中的培养物补充5％FCS 10mMHEPES。然后用0.02％的胰蛋白酶和0.025％的EDTA使之不再贴壁，然后将其重悬于HEPES缓冲盐溶液，137mM NaCl，5mM KCl，1mMNa2HPO4，5mM葡萄糖，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，0.1％(w/v)BSA和10mM HEPES pH7.4。然后加入DiBAC4(3)，终浓度为200nM。将其在37℃孵育＞5分钟。然后进行流式细胞仪测量。
图10也显示了100Hz的电场(EF)对BALB 3T3的膜电位的影响，该电场产生的电流密度为大约200mA/cm2。
实施例5-细胞外电流改变滑膜成纤维细胞间隙连接细胞通讯我们测定了低水平的电流对由连接蛋白43蛋白介导的间隙连接细胞通讯(GJIC)的影响。将汇合的单层滑膜成纤维细胞(HIG-82)和神经母细胞瘤细胞(5Y)在槽液(bath solution)中暴露于0-75mA/m2(0-56mV/m，60Hz)，并用制霉菌素双片(double-patch)和单片(single-patch)方法测量单通道电导、细胞膜电流-电压(I-V)曲线、和Ca2+内流。在暴露于20mA/m2的HIG-82细胞中，间隙连接通道的关闭和开放状态的电导均明显降低(分别为0.76pA和0.39pA)；对5Y细胞之间的间隙连接通道的电导没有产生影响。低达10mA/m2的电流密度明显升高HIG-82细胞中的Ca2+内流，但对5Y细胞没有影响。两种细胞类型的质膜的I-V曲线不依赖于60-Hz电流、0-75mA/m2，说明60-Hz电流对HIG-82细胞中的GJIC的影响不是由膜电位的变化介导的。
结论是低水平的细胞外电流能够改变滑膜细胞的GJIC，其机制不依赖于膜电位的改变，但可能依赖于Ca2+内流。结果说明，滑膜细胞中由GJIC介导的应答，例如其对促炎症因子的分泌应答，可通过使用细胞外低频电流而受到拮抗。
C.减轻应激的方法本发明可用于治疗或预防应激以及应激相关性疾病，例如免疫系统功能下降、感染、高血压、动脉硬化以及胰岛素抵抗血脂异常综合征(insulin resistance dyslipidemia syndrome)。为治疗应激、免疫抑制性疾病以及为降低ACTH或皮质醇的水平，在细胞膜上产生的平均感应电流密度优选地为大约0.03mA/m2至大约12mA/m2，更优选地0.035mA/m2至大约11.1mA/m2。随施加电流，平均施加电流密度优选地为大约60mA/m2至大约600mA/m2。
应激与多种健康问题相关，包括高血压、动脉硬化和胰岛素抵抗血脂异常综合征，以及某些免疫功能疾病(Vanitallie T.B.，Metabolism，5140-5(2002))。研究人员发现，应激可影响肾上腺皮质激素(如皮质醇和皮质酮)的正常内稳态。激素皮质酮产生于肾上腺，其变化是应激的一个常用指标。在一项研究中，将小鼠暴露于高达50kV/m、60Hz的电场，研究中观察到血浆皮质酮浓度降低，但仅发生在暴露的最初阶段(Hackman，R.M.& Graves，H.B.，Behav.Neural Biol.32201-213(1981))。与此类似，Portet和Cabanes报道，当把兔子和大鼠暴露于50kV/m，50Hz，发现肾上腺内的皮质醇水平降低，但血液中的皮质醇浓度未降低(Portet，R.& Cabanes，J.，Bioelectromagnetics 995-104(1988))。
ACTH是一种表达于垂体腺的肽，其作用几乎仅仅是调控皮质醇的分泌。体内ACTH的水平是肌体应激水平的有力指标，这主要是因为ACTH的作用是调控皮质醇(其是一种对于应激反应(例如创伤)来说至关重要的主要的抗炎分子)的分泌。有趣的是，研究人员发现，暴露于电场30-120天后ACTH水平没有升高(Free，M.J.等，Bioelectromagnetics 2105-121(1981))。在一项研究中，大鼠被暴露于100kV/m，60Hz达1-3小时，没有发现血浆ACTH发生变化(Quinlan，W.J.等，Bioelectromagnetics 6381-389(1985))。将小鼠暴露于10kV/m，50Hz，血清ACTH的浓度较对照组升高(deBruyn，L.& deJager，L.，Environ.Res.65149-160(1994))。肾上腺皮质一处区域的脂质染色增强，但仅出现于雄性。作者得出结论认为，电场是一种应激子(stressor)。在暴露于15kV/m，60Hz电场达30天的大鼠中也观察到血液ACTH浓度的变化(Marino，A.A.等，Physiol.Chem.Phys.9433-441(1977))。
与此不同，我们发现，给测试动物施加一具有特定参数的电场可降低应激诱导的ACTH浓度。例如，施加一17,500V/m电场(50Hz)，电压为7,000V，且感应电流密度为大约0.035-0.5mA/m2，持续时间为60分钟，这在测试动物中降低了应激诱导的血清ACTH水平。
实施例6-50Hz电场对限制活动大鼠的血浆ACTH、葡萄糖、乳酸盐和丙酮酸盐水平的影响电场暴露系统本实施例使用的电场暴露系统由三个主要部分组成一个高电压发生器(Healthtron TM，最大输出对于9,000V；Hakuju Institute for HealthScience Co.Ltd.，Tokyo，Japan)，一个稳压电源(TOKYO SEIDEN，Tokyo，Japan)，以及一个EF暴露笼。暴露笼由一个圆柱形塑料笼(Φ400mm，高度400mm)和置于该圆柱形笼的上方和下方的两个不锈钢电极(1,200×1,200mm)组成。为了在笼中形成EF(50Hz；17,500V/m)，给上方电极施加稳定的交流电(50Hz；7,000V)。
实验动物雌性7周龄Wistar大鼠，体重300-350g，购自Charles River Japan，Inc.(Tokyo，Japan)，喂养于配备空气清洁装置的常规动物房中。
限制活动应激以薄聚碳酸酯裹单(sheets)包裹各只大鼠以限制活动，将其置于下方电极的上方达30分钟。
实验设计按照如下所述测定EF对限制活动应激的影响。为了评估采用薄聚碳酸酯裹单的限制活动的过程，将6只大鼠分成2组，即单纯限制活动组和限制活动加安定处理组。为了测定暴露于EF的影响，我们使用了正常的和卵巢切除的大鼠。将正常大鼠分成2组，即单纯限制活动组和限制活动加EF组。此外，将卵巢切除的大鼠分成如下4个亚组假EF暴露处理(A1)，假EF暴露处理和限制活动(A2)，EF暴露和限制活动(A3)，假EF暴露处理和安定处理和限制活动(A4)。
在进行实验前4周进行卵巢切除。本研究中采用的EF暴露和限制活动处理如下将大鼠暴露于50Hz、17,500V/m EF共1小时。在后半程EF暴露过程中，将大鼠以薄聚碳酸酯裹单包裹以限制活动。对照组的实验设计与实验组相同，但不进行EF暴露。
收集血样在实验开始前自锁骨下静脉采集1ml的血液，并通过在4℃，1,500xg离心10分钟制备血浆。在测定激素前将血浆存放于-80℃。实验后，通过在麻醉下进行心脏穿刺自每只大鼠收集3ml全血，置于含有9mgEDTA的玻璃管中。将1ml血液置于血液分析条件下。将另外2ml离心(1,500xg，10分钟，4℃)，将上清液存放于-80℃直至测定激素、葡萄糖、乳酸盐和丙酮酸盐。
血液分析血液学分析包括红细胞和白细胞计数、血小板计数、红细胞压积和血红蛋白水平，使用自动多项血细胞仪进行(Sysmec CC-78，Sysmec inc.，Tokyo，Japan)。通过自动分析仪(7170 Hitachi，Hitachi Co.Ltd.，Tokyo，Japan)测定血浆葡萄糖、乳酸盐和丙酮酸盐水平。ACTH水平通过使用一种ACTH放射免疫分析试剂盒(ACTH IRMA，MITSUBISHICHEMICAL Co.Ltd.)和伽马计数仪(Auto-Gamma 5530 GammaCounting System，Packard Instrument Co.ltd.)来测定。血浆皮质酮水平使用商品化试剂盒(ImmuChem Double Antibody Corticosterone kit，ICNBiomedicals Inc.)测定。
统计学分析将结果表示为平均值±标准误(S.E.)或将数据组表示为中位数、第25位百分点、第75位百分点、最小值和最大值。通过Student′s T检验计算配对组之间的差异的统计学显著性，显著性被定义为P＜0.05。所有统计学分析的计算均以MU-EXCEL日文版本进行(Microsoft Office软件Ver.9.0.1，Microsoft Japan Inc.Tokyo，Japan)。
结果由限制活动应激引起的血浆ACTH水平的改变图11显示了应激对血浆ACTH水平的影响。给大鼠腹腔内施用1mg/kg B.W.的安定(实心圆形)或盐水(空心方形)。施用安定30分钟后，使大鼠限制活动以引起应激反应。图11显示了限制活动开始后30分钟各个大鼠的ACTH水平。限制活动前和后的值(平均值±S.E.)在单纯限制活动组为231±135和1177±325μg/ml，在限制活动加安定组为358±73和810±121μg/ml。比较各组限制活动应激前和后的ACTH水平，30分钟的限制活动使单纯限制活动组和限制活动加安定组的血浆ACTH水平分别升高了5.1倍和2.3倍。
EF暴露对限制活动所诱导的血浆ACTH水平变化的影响图12A和12B显示了暴露于EF对正常(A)和卵巢切除的大鼠(B)的血浆ACTH水平的影响。大鼠在EF暴露的后半程受到限制。在EF暴露之前和之后60分钟测定以下各组的血浆ACTH水平未处理(n＝6)、单纯限制活动(假处理，n＝6)、在EF期间限制活动(EF，n＝6)以及在假EF处理期间限制活动和安定(假处理和安定，n＝6)。安定在EF开始前30分钟添加。数据以框来表示，其中将每个大框分为2个小框的水平线代表中位数，形成每个大框的底部的水平线代表第25位百分点，形成每个大框的顶部的水平线代表第75位百分点，位于每个大框上方的水平线代表最大值，而位于每个大框下方的水平线代表最小值。暴露前的值未显示。*P＜0.05，与暴露前的值相比。P＜0.05，与未处理组相比。
在卵巢切除的大鼠中，未限制活动组的血浆ACTH水平在60分钟期间没有任何改变。在其他3组中，ACTH水平在限制活动期间升高(图12B)。比较开始之前和之后，血浆水平在“单纯限制活动组”、“限制活动和EF组”以及“限制活动和安定组”中分别升高18.6、13.4和13.7倍。
图13显示了EF暴露对正常大鼠(n＝6)血浆ACTH水平的影响。数据表示为中位数、第25位百分点、第75位百分点、最小值和最大值。图12A和13显示了正常大鼠的ACTH和皮质酮的血浆水平的变化。“单纯限制活动组”和“限制活动和EF组”的ACTH水平分别为1595±365和1152±183(μg/ml)，而皮质酮水平分别为845±48和786±24(ng/ml)。
EF暴露对血浆参数的影响图14A和14B显示了EF暴露对限制活动所诱导的正常(A)和卵巢切除的大鼠(B)的血浆葡萄糖水平变化的影响。在开始后60分钟测定这些水平(n＝6)。各组的样品数均为6。数据表示为中位数、第25位百分点、第75位百分点、最小值和最大值。*P＜0.05，与未处理组相比。
在卵巢切除的大鼠中，限制活动使血浆葡萄糖水平升高(P＜0.05Student′s T检验)，而EF或安定倾向于抑制这种升高(图14B)。不过，在没有进行卵巢切除的正常大鼠中没有观察到EF组中的对血浆葡萄糖水平的抑制趋势(图14A)。
图15A和15B显示了在正常大鼠(A)和卵巢切除的大鼠(B)中，EF暴露对限制活动所诱导的血浆乳酸盐水平的影响。在开始60分钟后测定上述水平(n＝6)。数据表示为中位数、第25位百分点、第75位百分点、最小值和最大值。*P＜0.05，与未处理组相比。P＜0.05，与假处理组相比。在卵巢切除的大鼠中，与未处理组相比，单纯限制活动组的血浆乳酸盐水平没有明显变化(图15B)。在EF暴露并施用安定的组中，血浆乳酸盐水平明显低于单纯限制活动组(P＜0.05Student′s T检验)(图15B)。在正常大鼠中，在有和无电场的情况下的血浆乳酸盐水平(平均值±S.E.)分别为28.6±3.6和38.1±3.7(mg/dl)(图15A)。统计学分析结果显示，暴露于EF的动物的乳酸盐水平明显低于单纯限制活动组(P＜0.05Student′s T检验)。
图16显示了在卵巢切除的大鼠中，EF暴露对限制活动所诱导的血浆丙酮酸盐水平的影响。在开始60分钟测定上述水平(n＝6)。数据表示为中位数、第25位百分点、第75位百分点、最小值和最大值。*P＜0.05与未处理组相比。在卵巢切除的大鼠中，单纯限制活动组的血浆丙酮酸盐水平与未处理组相比没有明显差异，但趋向因限制活动而降低。暴露于EF组的个体或施用安定的个体明显低于假EF暴露处理组的个体(P＜0.05Student′s T检验)(图16)。
图17显示了在卵巢切除的大鼠中，EF暴露对限制活动所诱导的白细胞(WBC)计数的影响。在开始60分钟测定上述水平(n＝6)。数据表示为中位数、第25位百分点、第75位百分点、最小值和最大值。*P＜0.05，与未处理组相比。通常，所观察到的由限制活动引起的改变涉及白细胞(WBC)的数量。未处理组、单纯限制活动组、暴露于EF组和施用安定组的WBC计数分别为78、99、96和85(×102细胞/微升)(图17)。统计学分析结果显示，在卵巢切除的大鼠中，限制活动的动物的WBC水平明显高于未处理组(P＜0.05Student′s T检验)。暴露于EF组或施用安定组的WBC水平趋向于高于未处理组，且低于单纯限制活动组。
实施例7-脑电图研究将6只大鼠暴露于估计为17,500V/m的电场，每天15分钟，共7天。用于暴露动物的装置为暴露笼(前述)。将6只大鼠用作对照(假暴露)。观察以下参数(终点)检测脑电图异常；各个EEG水平群(清醒、静息、慢波浅睡眠、慢波深睡眠、以及快波睡眠)的百分比；以及额叶EEG能谱δ(1-3.875Hz)、θ(4-15.875Hz)、α(8-12Hz)、β1(12.125-15.875Hz)和β2(16-25Hz)的百分比。重复暴露于7,000V(17,500V/m)达15分钟，观察到在第1天慢波浅睡眠水平明显增加达1-2小时。在第7天，观察到暴露后0-30分钟静息期明显减少，且观察到清醒期。暴露后，观察到0.5-1小时期间清醒期明显减少且慢波浅睡眠期明显增加。暴露后，观察到1-2小时期间清醒期明显减少且慢波深睡眠期明显增加。此外，暴露后，观察到2-4小时期间慢波浅睡眠期明显增加。
没有观察到自发EEG波形或行为异常。在本研究中没有发现重复暴露于电场可引起大鼠额叶频率分析的神经学问题。
D.其他疾病或病症为了治疗电解质失衡，在细胞膜上产生的平均感应电流密度优选地为大约0.4mA/m2至大约6.0mA/m2，更优选地大约0.4mA/m2至大约5.6mA/m2，且更加优选地为大约0.43mA/m2至大约5.55mA/m2。
为了治疗关节炎，在细胞膜上产生的平均感应电流密度优选地为大约0.02mA/m2至大约0.4mA/m2，更优选地大约0.025mA/m2至大约0.35mA/m2，最优选地为大约0.026mA/m2至大约0.32mA/m2。
为了治疗体重超重，在细胞膜上产生的平均感应电流密度优选地为大约0.02mA/m2至大约1.5mA/m2，更优选地大约0.02mA/m2至大约1.2mA/m2，最优选地为大约0.024mA/m2至大约1.12mA/m2。
本发明还可用于预防或治疗肌肉骨骼以及结缔组织疾病。这些疾病包括，例如骨质疏松症(包括老年性、继发性以及青少年特发性)、骨质变薄疾病(bone-thinning disorders)、腹腔疾病、热带性腹泻、粘液囊炎、硬皮病、CREST综合征、Charcot′s关节、骨折的适当修复、韧带和软骨撕裂的适当修复。本发明还可用于类风湿性关节炎免疫抑制疾病、神经痛、失眠、头痛、面神经麻痹、神经衰弱、关节炎、关节痛、过敏性鼻炎、应激、慢性胰腺炎、DiGeorge异常、子宫内膜异位症、尿路梗阻、假性痛风、甲状腺疾病、甲状旁腺疾病、垂体功能低减、胆石症、消化性溃疡、唾液腺疾病、食欲异常、恶心、呕吐、口干、多尿、眩晕、良性突发性位置性眩晕、失弛缓症以及其他神经系统疾病、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、弥漫性食道痉挛、以及短暂脑缺血发作(TIA)。本发明还可用于治疗涉及渗透压和渗透压维持的其他肾脏疾病以及涉及渗透压失衡的疾病或病症。
E.电场治疗仪器EF仪器的设计是要产生一个电场，而个体倍置于电场中。如图18所示，电场可包围整个研究对象。或者电场可仅包围该对象的一个特定区域或器官。
图19石显示本发明的一个实施方式的高电压产生仪器(1)的示意图。也就是说，电势治疗仪器(1)包含一种电势治疗装置(2)、一个高电压产生仪器(3)和一种商品化电源(4)。电势治疗装置(2)包含一种椅子(7)，其具有扶手(6)，个体(5)坐在椅子中；一个头部电极(8)，其作为附于椅子的上端的对置电极并置于个体的头部(5)上方；以及一个第二电极(9)，其作为一种足登电极(ottoman electrode)，该电极是主电极，个体将(5)下肢放置于其上表面上。要注意的是，头部电极(8)作为第二电极(9)即主电极的对置电极，也可以是天花板、墙壁、地板、家具、或房间内的其他物品或部分。高电压产生仪器(3)产生高电压以便给头部电极(8)和第二电极(9)加上电压。高电压产生仪器(3)通常被安置在椅子(7)下方，位于下肢和地板之间，或者位于椅子(7)附近。第一电极或头部电极(8)与患者头顶之间的距离(d)是可以变化的。头部电极(8)和第二电极(9)由绝缘材料围绕。该第二电极(9)通过电线(11)连接于高电压产生仪器(3)的高压输出端(10)。高压输出端(10)给头部电极(8)和第二电极(9)加上电压。此外，椅子(7)和第二电极(9)在接地处包括绝缘体(12)、(12)′。通过在床架(31)上放置不同厚度的垫子可很容易改变人体表面与第一电极(8a)之间的距离(d)。
图20A[透视图]和图20B[说明对象(5)和涂成黑色的相应电极之间的位置关系的侧视图]显示了具有另一种结构的椅子形式的电势治疗装置(2C)。椅子(7a)具有一种前开式遮盖物(34)以遮盖对象(5)。该遮盖物(34)具有一个第一电极(8c)，作为容纳对象(5)头部的对置电极；一个第二电极(9c)，其是作为主电极的足登电极；以及另一个第一电极(80c)，其被置于坐姿的肩部至腰部的位置，作为置于腰部以上的躯体部分的对置电极。另一个第一电极(80c)具有多个侧面电极(80c′)，以便自侧面遮盖对象(5)的躯体。优选地，第一电极(8c)被设置为沿着人体的头部，另一个第一电极(80c)以多节的形式沿着自双肩至腰部的纵向而放置。这些第一电极(8c)、另一个第一电极(80c)、侧面电极(80c′)和第二电极(9c)被置于绝缘材料(35)中。遮盖物(34)附有由绝缘体制得的可分离式垫子构件。因此，通过附上不同厚度的垫子构件可改变人体表面与第一电极(8c)、(80c)、(80c′)之间的距离。在这种即上述的电势治疗装置(2c)中，感应电流控制器件可通过改变施加于作为对置电极的第一电极(8c)、(80c)、(80c′)和第二电极(9c)的施加电压以及第一电极(8c)、(80c)、(80c′)与人体躯干表面之间的距离(d)，或者通过控制施加于第一电极(8c)、(80c)、(80c′)和第二电极(9c)的施加电压并进一步通过改变第一电极(8c)、(80c)、(80c′)与人体表面之间的距离(d)，而控制体表电场并在人体躯干相应区域通过极其微量的感应电流。
图21A[透视图]和图21B[侧视图]显示了具有另一种结构的电势治疗装置(2A)。电势治疗装置(2A)采用了床的形式。用于容纳对象(5)的箱体(32)被放置于床架(31)上。在该箱体(32)内放置相应的电极。简言之，其具有作为对置电极的一第一电极(8a)以及作为主电极的被置于人体腿部的一第二电极(9a)。第一电极(8a)被置于人体的头部、肩部、腹部、下肢和臀部或其他区域。且优选地，第一电极(8a)具有与人体的头部、肩部、腹部和臀部大致相当的形状、宽度和面积。图中空白的区域显示的是没有放置电极的点。电极被置于绝缘体(33)内。由绝缘体(未显示)制得的垫子被放置在床架(31)的相应的电极上。在此，准备了厚度不同的垫子。
在上述图19中，头部电极(8)高出对象(5)的头部和人体躯干表面的距离(d)被设定为大约1至25cm，在图20A中，第一电极(8c)、(80c)、(80c′)与对象(5)的人体躯干表面的距离(d)被设定为大约1至25cm，优选地大约4至25cm，且在图21A中，第一电极(8a)、(8b)与对象(5)的人体躯干表面的距离(d)被设定为大约1至25cm，优选地大约3至25cm。
高电压产生仪器(3)，如以下图22的电路框图所示，具有一升压变压器(t)，用于将商品化的电源100V AC的电压升高至例如15,000V；以及限流电阻器(R)、(R)′，用于控制流向相应电极的电流。该高电压产生仪器(3)具有这样一种构造，其中升压线圈(T)的中点(s)是接地的，且接地电压被设置为升高的电压的一半。如有附文的线条所示，点(s′)可接地。在此，如图22的框图所示，自100V AC电源通过高电压产生仪器(3)的电压控制器(13)得到高电压，该高电压侧中点(s)通过升压变压器(T)而接地，进一步，通过用于保护人体的限流电阻器(R)、(R′)，将相应的高电压连接至头部电极(8)、(8c)等(见下文)和第二电极(9)、(9c)等(见下文)。并且，电势治疗仪器(1)具有感应电流控制器件。该感应电流控制器件，通过改变施加于头部电极(8)和第二电极(9)的施加电压，以及头部电极(8)与人体躯干表面之间的距离(d)，或者通过控制施加于头部电极(8)和第二电极(9)的施加电压，或者进一步通过改变头部电极(8)与人体躯干表面之间的距离(d)，从而控制肌体躯干电场，可在对象(5)的组成人体躯干的相应区域引起极其微量的感应电流。通过在床架(31)上放置不同厚度的垫子可容易地改变人体表面与第一电极(8a)之间的距离(d)。
甚至在电势治疗仪器(1)中施加高电压的情况下，通过升高感应电流，即使治疗时间与常规方法的时间相同，也可获得更好的治疗效果。此外，可在比已往更短的时间内完成治疗。此外，为了获得同样的治疗效果，可以用较低的电压，在与已往相同的治疗时间内，得到与现有技术相同的数值的感应电流。
本发明的电势治疗仪器(1)被设计为尽可能地避免高输出电子噪音、高频无线电噪音以及强磁场。为了降低电磁场干扰对电势治疗仪器(1)的影响，优选地在设计和制造中使用传动式机械开关、继电器和电动机或电定时器或其他电气元件，而不使用电子元件、半导体、有功部分(powercomponent)(如半导体开关元件、三端双向可控硅开关元件)、电子定时器或EMI敏感型微型计算机。不过，作为电子功能元件，发光二极管电源的电子串联总线开关调节器式有效的，且该发光二极管被用作光源，用于通知对象或操作者本发明的电势治疗仪器是处于工作还是非工作状态。
如上所述，模拟人体(h)可用于测量EF和感应电流，如图23A、23B和23C所示。该模拟人体(h)由PVC制成，其表面涂有银和氯化银的混合溶液。这样制得其阻抗(1KΩ或更低)相当于正常人体的阻抗。全世界均采用模拟人体(h)护理模拟器，其尺寸类似于一般人体的平均值，例如，其高度为174cm。其尺寸进一步描述于表1。
表1-测量模拟人体的电流密度
通过将盘装电场测定传感器(e)附于模拟人体(h)的测定区域而测定体表电场。测定在115V/60Hz和120V/60Hz的条件下进行。
图24显示了一种测量感应电流的方法以及所用的仪器。在感应电流测定仪器(20)中，如图23A和23B所示，将模拟人体(h)以通常的坐姿置于椅子(7)中。头部电极(8)位于头部上方作为对置电极，将其调整并设置在模拟人体(h)头顶上方11cm处。采用以下步骤进行测定，测定相应的部分例如在图24中示出的k-k′线部分，通过光学传输来传输感应电流波形，并在感应电流测量仪器(20)的接地端观察该波形。在此，施加电压是15,000V。在该测量方法中，测定在模拟人体(h)的相应区域的截面的感应产生的电流，通过用两根导线造成流过模拟人体(h)的截面的电流的短路(22)[未显示]，可得到感应电流。通过I/V转换器(23)将测得的感应电流转换成电压信号(图24)。随后，通过发送端的光模拟数据线路将该电压信号转换成光信号。
通过一种光纤电缆(25)将这些光信号传输至接收端的光模拟数据线路(26)，并转换成电压信号。通过例如频率分析仪(27)处理该电压信号，用于以波形观察和分析记录仪进行频率分析。在发生端[未显示]的I/V转换器(23)和光模拟数据线路(24)之间放置缓冲器和加法器。因此，表2显示了在115V/60Hz和120V/60Hz测定得到的、在模拟人体(h)的相应区域的部分的电场值和感应电流值。如果电场值与表2不同，那么相应地，可知流过该处的感应电流值也不同。因此认为，显然可以通过改变有关的相应区域的电场而获得对真正的人体躯干的相应区域有效的感应电流。
表2-电场值和感应电流值之间的关系
通过测定如图24所示的相应区域的感应电流所得到的相应区域的感应电流值，采用以下方程式，可得到体表电场E。即E＝I/εoωS。在此，S是电场测量传感器的截面，εo是在真空中的感应速率，I是感应电流，ω是2πf，f是频率。当相应区域的感应电流是通过上述方法而获得时，可采用以下方程式得到相应区域的感应电流密度J。即A＝2πr，B＝πr2，B＝A2/4π，J＝I/B，其中A是圆周，B是圆面积，r是半径，I是测得的电流，而J是感应电流密度。
当进行电势治疗时，通过控制头部电极(8)的电压和施加于第二电极(9)的施加电压，上述的感应电流控制器件可产生流过人体躯干相应区域的极其微量的感应电流。
表3显示了以下之间的关系(1)鼻、颈部和躯干的感应电流(μA)，(2)鼻、颈部和躯干的感应电流密度(mA/m2)，120V/60Hz时的施加电压(KV)。在施加电压相同时，电流密度的趋势是颈部最高，躯干其次，鼻部最低。注意，表3的感应电流密度低于10mA/m2，10mA/m2或更低的电流密度被国际非离子辐射保护委员会(International Commission onNon Ionizing Radiation Protection)认为是安全的。
表3-施加电压和感应电流
图25也说明了施加电压(KV)和鼻、颈部和躯干的感应电流(A)之间的关系。如图25所示，施加电压和感应电流之间是成比例的。
表4显示了作为头部电极(8)与头顶部之间的距离(d)的函数的人颈部感应电流和感应电流密度的变化。
表4-感应电流的变化作为与电极的距离的函数
表4说明，当距离为15cm或更高时，感应电流稳定于30μA。因此，在通过改变距离而改变感应电流时，距离应该是15cm或更低。图26也显示了感应电流的变化依赖于距离(d)。
在一项涉及300例腰背痛病人的实验中，我们确定了如下最佳剂量和参数。简言之，最佳剂量的数值是通过控制在组成人体躯干的区域中产生的感应电流值和感应电流流动时间而得到的。另外，其可通过控制产生的第一电极电压和第二电极电压的施加电压总和及其施加时间而得到。对于腰背痛，EF的最佳治疗作用可通过如下获得，施加电场大约30分钟，电压为大约10KV至大约30KV，优选地大约15KV。也就是说，大约300KV/分钟至大约900KV/分钟，优选地大约450KV/分钟。
在此，表5显示了以115V/50Hz在组成模拟人体(h)的躯干的相应区域的截面测得的感应电流值，以及自该感应电流值计算得到的感应电流密度，其中考虑了表1的模拟人体(h)的尺寸。自表5，测得的组成人体躯干的相应区域的感应电流(μA)值和计算得到的感应电流密度(mA/m2)的值如下眼；18/0.8，鼻；24/1.3，颈部；27/3.1，胸部；44/0.9，胸口；8.6/1.6，和躯干；91/2.8。
表5-区域、感应电流值和感应电流密度
此外，基于前述的感应电流和感应电流密度，在120V/60Hz的感应电流和感应电流密度可根据以下方程式1和方程式2计算。
方程式1感应电流；I(60Hz)＝I(50Hz)×60/50×120/115方程式2感应电流密度；J(60Hz)＝J(50Hz)×60/50×120/115表6显示了在120V/60Hz时的人体躯干相应区域的感应电流和感应电流密度的计算结果。自表6，测得的组成人体躯干的相应区域的感应电流(μA)值和计算得到的感应电流密度(mA/m2)的值如下眼；23/0.9，鼻；30/1.7，颈部；34/3.9，胸部；55/1.2，胸口；11/2.3，和躯干；114/3.6。
表6-区域、感应电流值和感应电流密度
当电极与人体区域之间的距离是定值的时候，上述施加电压和人体躯干相应区域内的感应电流是成比例的。因此，当使用椅子来治疗人体时，可通过控制施加电压的产生和施加的时间而得到最佳剂量的量，这是因为，如果电极与人体之间的距离是由最大公约数决定的，那么人体相应区域的电场强度最主要地由施加电压决定。
本领域人员能够理解，可通过使用适当的电场仪器，例如HealthtronHES-30TM装置(Hakuju Co.)，来控制施加电压的数值以及电流密度。例如，通过升高用于施加EF的电极的电势，可增大在存在生物学样品的情况下产生的感应电流。本领域人员已知其他的适当的仪器，包括但不限于，00298装置(Hakuju Co.)、HEF-K 9000装置(Hakuju Co.)、HES-15A装置(Hakuju Co.)、HES-30装置(Hakuju Co.)、AC/DC发生器(Sankyo，Inc.)、以及功能发生器SG 4101(Iwatsu，Inc.)。表7给出了示范性仪器的一些特征以及对这些仪器的说明。
其他的可用于本发明的方法的电场仪器包括美国专利No.4,094,322所述的产生电场的仪器，在此将该文件的全部内容并入本文作为参考。这种治疗性仪器能够直接将电场输送至躺在该仪器中的患者的所需部位。美国专利No.4,033,356、美国专利No.4,292,980、美国专利No.4,802,470和英国专利GB 2 274 593描述了其他一些电场仪器，在此将上述各文件的全部内容并入本文作为参考。
表7提供了可用于本发明的方法的选定的EF仪器的具体说明。
使用一种双阶段有限差异程序(two-stage finite-difference procedure)(Hart，F.X.，Bioelectromagnetics 11213-228(1990))计算出由60-Hz电场在均质但形状不规则的人体模型中感应产生的电流密度分布。对于暴露于10kV/m的电场中的未接地的人体模型，在腰背部水平穿过躯干的平面的感应电流密度是1.14mA/m2(图27)。其他部位的电流密度的范围是0.8-3.5mA/m2。确切的数值取决于模型与地面之间的电容耦合，但合理范围耦合条件产生的变化应低于计算得到的电流密度的上下2倍。其他研究结果与此相似(Gandhi，O.P.& Chen，J.Y.，Bioelectromagnetics Suppl.143-60(1992)；King，R.W.P.，IEEE Trans.Biomed.Eng.45520-530(1998))。
采用了有限差异时间域方法来计算以解剖学为基础的人体模型中的感应电流(Furse，C.M.& Gandhi，O.P.，Bioelectromagnetics 19293-299(1998))。使用超级计算机进行计算可产生比以往更高的分辨率。表8显示了在模型的特定组织中感应产生的电流密度的结果。使用包括脂肪-肌肉(Chuang，H.-R.& Chen，K.-M.，IEEE Trans.Biomed.Eng 36628-634(1989))和骨骼-大脑(Hart，F.X.& Marino，A.A.，Med.Biol.Eng.Comp.24105-108(1986))等组织的复合模型的研究也得到了类似的结果。
表8-暴露于60Hz，10kV/m电场的人体特定组织的感应电流密度
实施例8-暴露于电场(EF)其对于病人的一些临床症状的减轻作用使用了电场暴露仪器Healthtron(Model HES 30，Hakuju Institute forHealth Sciences Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)。Healthtron包括一渐增式变压器(用于控制电路中的电压的装置)、座位和电极。其在相对的两个电极中的一个上施加高电压，以便在这两个电极间产生恒定的电势差并在两者之间形成EF。
在暴露过程中，使用者舒适地坐着并可读书或睡眠。为了防止发生因电流产生所引起的意外电击事件，在治疗过程中，对象不得与地板以及任何人(操作者以及其他带电者)有任何形式的身体接触。以绝缘体覆盖的电极被置于地板上(允许双足放在上面)和各患者的头上。将30,000伏的初始电源(ELF为50或60Hz)施加于放置在足部的电极，在放置于足部和头部的电极之间产生一EF。每次暴露于电场的时间持续30分钟，暴露的频率在每天一次至每周一次不等。
根据自1994年8月1日至1997年6月30日在日本东京ToranomonClinic Minato-ku进行的调查问卷得到的结果对Healthtron的功效进行评价，调查过程由Yuichi Ishikawa，MD直接负责监控。总共1,253个患者(489男性；764女性)使用了该器械，其中505个患者(208男性，297女性)至少两次就诊并使用了Healthtron装置并使用了该器械。其他人可能使用该装置两次以上。为了降低调查中的参加者的主观性，仅针对这505个患者对Healthtron的减轻症状的作用进行了评价。
每个Healthtron使用者均由一名医生接诊，并询问前一次就诊时该器械的减轻症状的效果。询问所包括的问题涉及主诉(即症状)、既往史和治疗情况、使用Healthtron的频率和用后的感受，包括其减轻症状的效果，以及使用者个人是否拥有Healthtron。首次就诊时的症状的严重程度被定为3，而将Healthtron治疗后的严重程度分为5级，即很好(5)；好(4)；不变(3)；加重(2)；以及模型加重(1)。很好和好被分类为“减轻”，也记录以天计算的减轻的持续时间，无论暴露的频率/间隔如何。
结果病人的年龄在20至90岁之间，其中85.3％由＞40岁者组成(表9)。有208个(41％)男性和297个(59％)女性。鉴定了55种症状，表9总结了经过Healthtron治疗后各种症状报告减轻的患者的比例。那些在至少有10个患者中鉴定出的症状包括肢体发凉、乏力、头痛、高血压、失眠、关节痛、腰背痛、肢体痛、皮肤搔痒、肢体麻木、肩/颈痛、以及僵硬。Healthtron治疗的减轻症状效果明显的有不伴有发热的头痛、器官疗法例如蛛网下腔或脑出血、或炎症(91.7％)、关节痛(66.7％)、腰背痛(57.3％)、肩/颈痛和僵硬(56.0-57.8％)、以及乏力(55.0％)。有趣的是，对影响运动器官(头、关节、肩、颈部、肢体和腹部)的疼痛相关性症状的减轻效果见于299人中的175人(58.5％)。这些疼痛相关性症状不是由创伤引起的。在患有皮肤搔痒的10个患者中，尽管有4人声称症状减轻，但有1人在首次治疗后临床表现反而加重。
表9-Healthtron使用者的年龄范围和性别分布
表10显示了505个患者中的55种经过鉴别的临床症状的好转率。
表10-505个患者中的55种临床症状的好转率
图28显示了505个患者中每种症状减轻所持续的时间平均值，这不考虑Healthtron治疗的频率/间隔。考虑到本研究的研究人员完全依赖于来自调查问卷所生成的数据，而本研究存在很多症状的样本数较小这一内在局限性，我们认为，只有当那些在至少10个患者中鉴定的症状显示出＞50％的减轻率时，才能有理由认为治疗具有持续的减轻症状的效果。对乏力的减轻作用为大约50天；对关节、腰背部和肩/颈部僵硬感的减轻作用为接近100天。在许多其他症状中观察到更长的症状减轻的平均持续时间，这可能反映了样本数量的大小而不代表真正的治疗效果。
F.优化电治疗参数的方法本发明对参数范围的选择和控制保证了能够使用EF作为治疗工具，同时避免了可能因使用所带来的不良反应。因此，本发明提供了所用的参数和范围，应用这些参数和范围可使得本领域人员能够使用EF作为治疗工具以获得特定的生物学结果，同时避免不良反应发生。
确定用于电场治疗的最佳参数的优选方法包括以下步骤(i)鉴别一种要在活的生物体中引发的所需的生物学反应；(ii)选择或测量所述生物体的或者来自所述生物体的组织样品或培养物的细胞的膜上的一平均感应电流密度；(iii)选择或测量在与所述生物体、样品或培养物相距为一特定距离时产生该选定的或测得的感应电流密度的外部电场；(iv)选择或测量一段持续时间以在膜上产生该选定的或测得的感应电流密度；(v)给所述生物体、样品或培养物施加该选定的或测得的电场以便在细胞膜上产生该选定的或测得的感应电流密度并达到该选定的或测得的持续时间；(vi)确定该所需的生物学反应发生的程度；(vii)任选地重复进行步骤(ii)至(vi)中的任何步骤；和(viii)鉴定出最佳地引发所需的生物学反应的该选定的或测得的感应电流密度、该选定的或测得的外部电场、或该选定的或测得的持续时间的值。
优选地，本方法进一步包括，在步骤(viii)之前，产生一剂量-反应曲线，该曲线作为该选定的或测得的感应电流密度、该选定的或测得的外部电场、或该选定的或测得的持续时间的函数。更优选地，本发明的方法进一步包括，在步骤(viii)之前，进行以下选择或测量步骤(v)被重复进行的次数，步骤(v)被重复进行的时间间隔，和在膜上产生所述选定的或测得的感应电流密度的总的持续时间。
更优选的实施方式包括以下特征中的一或多种选定的或测得的感应电流密度为大约0.001mA/m2至大约15mA/m2；感应电流密度是通过测量流经该活的生物体或其部分的特定截面的感应电流，通过将测得的电流转换成电压信号，通过将所述电压信号转换成光学信号，然后通过将所述光学信号重新转换成电压信号，并分析波形和频率，从而选定的或测得的；和/或外部电场(E)是根据方程式E＝I/εoωS而选定的或测得的，其中S是电场测量传感器的截面，εo是在真空中的感应速率，I是电流，且εoωS是2πf，f是频率。
一个确定用于施加电流治疗的最佳参数的优选方法包括以下步骤(i)鉴定要在活的生物体或其部分中引发的所需的生物学反应；(ii)选择或测量所述生物体的或者来自所述生物体的组织样品或培养物的细胞的膜上的一平均施加电流密度，其中该平均施加电流密度是大约10mA/m2至大约2,000mA/m2；(iii)选择或测量可产生该选定的或测得的施加电流密度的电流；(iv)选择或测量产生该选定的或测得的施加电流密度的持续时间；(v)施加该选定的或测得的电流以产生该选定的或测得的施加电流密度并达到该选定的或测得的持续时间；(vi)确定该所需的生物学反应发生的程度；(vii)重复步骤(ii)至(vi)的任何步骤，以产生一剂量-反应曲线，该曲线作为该选定的或测得的电流、该选定的或测得的施加电流密度、和该选定的或测得的持续时间的函数；以及(viii)鉴定出最佳地引发所需的生物学反应的该选定的或测得的电流、该选定的或测得的施加电流密度、或该选定的或测得的持续时间的值。优选地，本发明的方法进一步包括，在步骤(viii)之前，进行以下选择或测量步骤(v)被重复进行的次数，步骤(v)被重复进行的时间间隔，和在膜上产生的施加电流密度的总的持续时间。
本发明人已经测定了最佳地治疗特定疾病的参数。一般来说，施加的EF电压(外部)的范围为大约50V至大约30kV。产生的感应电流密度的范围为大约0.001至大约15mA/m2。优选地，产生的EF感应电流密度的范围为大约0.012至大约11.1mA/m2，更优选地大约0.026至大约5.55mA/m2。
可采用的施加电流密度的范围为大约10至大约2,000mA/m2。在本发明的另一个实施方式中，产生的施加电流的范围为大约50至大约600mA/m2。在本发明的另一个实施方式中，产生的EF施加电流的范围为大约60至大约100mA/m2。
表11提供了用于治疗疾病和病症的优选参数组合。表11提供了可使用该参数组合的具体疾病、病症、器官或系统。表11还提供了具体的参数数值，不过，应该理解的是这些数值是近似值，且与之相当的范围也在本发明的预期之内。
本发明也涉及用于确定所需参数组合的方法，所述的参数例如为EF特征、感应电流密度、施加电流密度、以及暴露时间，以便能够在生物学测试对象中得到最大的所需效应。
在本发明的一个优选的实施方式中，该优化方法涉及以下步骤鉴定要在一种生物体或其部分中引发的所需的生物学效应(例如在肌肉细胞引起钙离子内流)；选择所述生物体或其部分的细胞膜的平均施加电流密度或感应电流密度的数值，其中所述数值优选地落入以下范围，对于施加电流来说该范围为大约10mA/m2至大约2,000mA/m2，而对于感应电流来说该范围为大约0.001mA/m2至大约15mA/m2；确定可产生该选定的电流密度的施加电流或EF的数值(例如频率和EF电压)；选择产生该施加电流密度的不连续的一段时间(a discrete period of time)，其中所述一段时间的范围为大约2分钟至大约10,080连续的或不连续的分钟；使用该施加电流或EF以产生该选定的电流密度；确定该所需的生物学效应发生的程度；并任意重复上述步骤。优选地，该优化程序还可产生一剂量-反应曲线，作为所述选定的数值的函数。在另一个优选的实施方式中，施加电流或EF的数值是根据该生物体的形状、重量、体脂百分比和其他与在细胞膜上产生感应电流有关的因素而确定的。
表12示范性地给出了在本发明的一些实施方式中用于在体内调节跨细胞膜离子流动的参数的组合。表13示范性地给出了在本发明的其他实施方式中，用于在体外调节跨细胞膜离子流动的参数的组合。
表12-在体内调节离子流动的示范性参数
表13-在体外调节离子流动的示范性参数
在另一个实施方式中，本发明可用作诊断工具以确定个体是否患有特定的疾病或病症。与一种疾病或病症的预防、改善和治疗相关的具体的参数可用于测定是否存在该种疾病或病症。可将参数作为诊断工具而施加，并监测效果以明确其反应性。如果患者对与该疾病相关的特定参数组合没有反应，那么这种反应的缺失提示该患者没有患该特定的疾病或病症。或者，如果该患者对(与该疾病相关)该特定参数组合出现反应，那么这种反应的出现代表存在该特定的疾病和/或病症。本发明的这种诊断实施方式可用于特定的EF参数组合已经被确定的各种疾病和/或病症。
显然，本发明的实施方式可不同于在前面的说明书和实施例中所具体描述的方式。根据以上的揭示，可以对本发明做出各种修改和变化，因此其也属于所附权利要求书的范围之内。
在
背景技术：
具体实施例方式
以及实施例中所引用的各文献(包括专利、专利申请、期刊文章、摘要、实验手册、书籍以及其他公开内容)均以其全部内容并入本文作为参考。
2001年12月14日提交的美国专利申请10/017,105描述了用于施加电场的特定的电治疗仪器和方法，将该专利申请的全部内容在此并入作为参考。
权利要求
1.一种治疗或预防引起生物体或其一部分的细胞内离子浓度异常的疾病或是由生物体或其一部分的细胞内离子浓度异常所引起的疾病的方法，包含使所述细胞恢复正常的离子浓度，该方法包括给所述生物体或部分施加一外部电场，所述外部电场在所述细胞的膜上产生大约0.001mA/m2至大约15mA/m2的平均感应电流密度。
2.权利要求1的方法，其中所述离子包含钙离子。
3.权利要求1的方法，进一步包含为所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂或所述添加剂的组合。
4.权利要求3的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述平均感应电流密度为大约0.01mA/m2至大约2mA/m2。
6.权利要求5的方法，其中所述生物体是人，且所述电场在人的细胞的膜上产生持续时间为大约10分钟至大约240分钟的所述平均感应电流密度。
7.权利要求6的方法，进一步包含随后给所述人或其部分再次施加一外部电场并再次产生额外持续时间为大约30分钟至大约90分钟的平均感应电流密度。
8.一种用于进行权利要求1的方法的装置，其中所述装置是一种电场治疗仪器，其包含(a)一个主电极和一个对置电极；(b)一个用于给所述电极施加电压的电压发生器；(c)一种感应电流发生器，其通过改变所述对置电极与所述生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；和(d)一种用于驱动电压发生器的电源。
9.权利要求8的装置，其中所述主电极不与所述生物体或其部分接触。
10.一种治疗增殖性细胞疾病的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的离子流动，该方法包括给所述生物体或部分施加一外部电场，所述外部电场在细胞膜上产生大约0.1mA/m2至大约2mA/m2的平均感应电流密度。
11.权利要求10的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.2mA/m2至大约1.2mA/m2。
12.权利要求11的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.29mA/m2至大约1.12mA/m2。
13.权利要求11的方法，其中所述离子包含钙离子。
14.权利要求10的方法，进一步包含为所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
15.权利要求14的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
16.权利要求11的方法，其中所述增殖性细胞疾病涉及分化的成纤维细胞。
17.权利要求11或14的方法，其中所述生物体是人，且所述电场在人的细胞的膜上产生持续时间为大约10分钟至大约240分钟的所述平均感应电流密度。
18.权利要求17的方法，进一步包含随后给所述人或其部分再次施加所述电场并再次产生额外持续时间为大约30分钟至大约90分钟的所述平均感应电流密度。
19.权利要求18的方法，其中所述人被置于住院病床或门诊病床上。
20.一种用于进行权利要求11的方法的装置，其中所述装置是一种电场治疗仪器，其包含(a)一个主电极和一个对置电极；(b)一个用于给所述电极施加电压的电压发生器；(c)一种感应电流发生器，其通过改变所述对置电极与所述生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；和(d)一种用于驱动所述电压发生器的电源。
21.权利要求20的装置，其中所述主电极不与所述生物体或其部分接触。
22.一种治疗电解质失衡的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的离子流动，该方法包括给所述生物体或部分施加一外部电场，所述外部电场在细胞膜上产生大约0.4mA/m2至大约6.0mA/m2的平均感应电流密度。
23.权利要求22的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.4mA/m2至大约5.6mA/m2。
24.权利要求23的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.43mA/m2至大约5.55mA/m2。
25.权利要求23的方法，其中所述离子包含钙离子。
26.权利要求22的方法，进一步包含给所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
27.权利要求26的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
28.权利要求23或26的方法，其中所述生物体是人，且所述电场在人的细胞的膜上产生持续时间为大约10分钟至大约240分钟的所述平均感应电流密度。
29.权利要求28的方法，进一步包含随后给所述人或其部分再次施加所述电场并再次产生额外持续时间为大约30分钟至大约90分钟的所述平均感应电流密度。
30.权利要求29的方法，其中所述人被置于住院病床或门诊病床上。
31.一种用于进行权利要求22的方法的装置，其中所述装置是一种电场治疗仪器，其包含(a)一个主电极和一个对置电极；(b)一个用于给所述电极施加电压的电压发生器；(c)一种感应电流发生器，其通过改变所述对置电极与所述生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；和(d)一种用于驱动所述电压发生器的电源。
32.权利要求31的装置，其中所述主电极不与所述生物体或其部分接触。
33.一种治疗与血清钙浓度相关的疾病的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的钙离子流动，该方法包括给所述生物体或部分施加一外部电场，所述外部电场在细胞膜上产生大约0.3mA/m2至大约0.6mA/m2的平均感应电流密度。
34.权利要求33的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.4mA/m2至大约0.5mA/m2。
35.权利要求34的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.42mA/m2。
36.权利要求33的方法，进一步包含给所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
37.权利要求36的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
38.权利要求34或36的方法，其中所述生物体是人，且所述电场在人的细胞的膜上产生持续时间为大约10分钟至大约240分钟的所述平均感应电流密度。
39.权利要求38的方法，进一步包含随后给所述人或其部分再次施加所述电场并再次产生额外持续时间为大约30分钟至大约90分钟的所述平均感应电流密度。
40.权利要求39的方法，其中所述人被置于住院病床或门诊病床上。
41.一种用于进行权利要求33的方法的装置，其中所述装置是一种电场治疗仪器，其包含(a)一个主电极和一个对置电极；(b)一个用于给所述电极施加电压的电压发生器；(c)一种感应电流发生器，其通过改变所述对置电极与所述生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；和(d)一种用于驱动所述电压发生器的电源。
42.权利要求41的装置，其中所述主电极不与所述生物体或其部分接触。
43.一种降低ACTH或皮质醇水平的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的离子流动，该方法包括给所述生物体或部分施加一外部电场，所述外部电场在细胞膜上产生大约0.03mA/m2至大约12mA/m2的平均感应电流密度。
44.权利要求43的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.035mA/m2至大约11.1mA/m2。
45.权利要求44的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.035至大约0.5mA/m2。
46.权利要求43的方法，其中所述离子包含钙离子，且所述方法进一步包含给所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
47.权利要求46的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
48.权利要求44或46的方法，其中所述生物体是人，且所述电场在人的细胞的膜上产生持续时间为大约10分钟至大约240分钟的所述平均感应电流密度。
49.权利要求48的方法，进一步包含随后给所述人或其部分再次施加所述电场并再次产生额外持续时间为大约30分钟至大约90分钟的所述平均感应电流密度。
50.权利要求49的方法，其中所述人被置于住院病床或门诊病床上。
51.一种用于进行权利要求43的方法的装置，其中所述装置是一种电场治疗仪器，其包含(a)一个主电极和一个对置电极；(b)一个用于给所述电极施加电压的电压发生器；(c)一种感应电流发生器，其通过改变所述对置电极与所述生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；和(d)一种用于驱动所述电压发生器的电源。
52.权利要求51的装置，其中所述主电极不与所述生物体或其部分接触。
53.一种治疗应激的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的离子流动，该方法包括给所述生物体或部分施加一外部电场，所述外部电场在细胞膜上产生大约0.03mA/m2至大约12mA/m2的平均感应电流密度。
54.权利要求53的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.035mA/m2至大约11.1mA/m2。
55.权利要求54的方法，其中所述离子包含钙离子。
56.权利要求53的方法，进一步包含给所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
57.权利要求56的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
58.权利要求54或56的方法，其中所述生物体是人，且所述电场在人的细胞的膜上产生持续时间为大约10分钟至大约240分钟的所述平均感应电流密度。
59.权利要求58的方法，进一步包含随后给所述人或其部分再次施加所述电场并再次产生额外持续时间为大约30分钟至大约90分钟的所述平均感应电流密度。
60.权利要求59的方法，其中所述人被置于住院病床或门诊病床上。
61.一种用于进行权利要求53的方法的装置，其中所述装置是一种电场治疗仪器，其包含(a)一个主电极和一个对置电极；(b)一个用于给所述电极施加电压的电压发生器；(c)一种感应电流发生器，其通过改变所述对置电极与所述生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；和(d)一种用于驱动所述电压发生器的电源。
62.权利要求61的装置，其中所述主电极不与所述生物体或其部分接触。
63.一种治疗关节炎的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的离子流动，该方法包括给所述生物体或部分施加一外部电场，所述外部电场在细胞膜上产生大约0.02mA/m2至大约0.4mA/m2的平均感应电流密度。
64.权利要求63的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.025mA/m2至大约0.35mA/m2。
65.权利要求64的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.026mA/m2至大约0.32mA/m2。
66.权利要求64的方法，其中所述离子包含钙离子。
67.权利要求63的方法，进一步包含给所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
68.权利要求67的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
69.权利要求64或67的方法，其中所述生物体是人，且所述电场在人的细胞的膜上产生持续时间为大约10分钟至大约240分钟的所述平均感应电流密度。
70.权利要求69的方法，进一步包含随后给所述人或其部分再次施加所述电场并再次产生额外持续时间为大约30分钟至大约90分钟的所述平均感应电流密度。
71.权利要求70的方法，其中所述人被置于住院病床或门诊病床上。
72.一种用于进行权利要求63的方法的装置，其中所述装置是一种电场治疗仪器，其包含(a)一个主电极和一个对置电极；(b)一个用于给所述电极施加电压的电压发生器；(c)一种感应电流发生器，其通过改变所述对置电极与所述生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；和(d)一种用于驱动所述电压发生器的电源。
73.权利要求72的装置，其中所述主电极不与所述生物体或其部分接触。
74.一种治疗体重超重的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的离子流动，该方法包括给所述生物体或部分施加一外部电场，所述外部电场在细胞膜上产生大约0.02mA/m2至大约1.5mA/m2的平均感应电流密度。
75.权利要74求的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.02mA/m2至大约1.2mA/m2。
76.权利要求75的方法，其中所述平均感应电流密度是大约0.024mA/m2至大约1.12mA/m2。
77.权利要求75的方法，其中所述离子包含钙离子。
78.权利要求74的方法，进一步包含给所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
79.权利要求78的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
80.权利要求74或78的方法，其中所述生物体是人，且所述电场在人的细胞的膜上产生持续时间为大约10分钟至大约240分钟的所述平均感应电流密度。
81.权利要求80的方法，进一步包含随后给所述人或其部分再次施加所述电场并再次产生额外持续时间为大约30分钟至大约90分钟的所述平均感应电流密度。
82.权利要求81的方法，其中所述人被置于住院病床或门诊病床上。
83.一种用于进行权利要求73的方法的装置，其中所述装置是一种电场治疗仪器，其包含(a)一个主电极和一个对置电极；(b)一个用于给所述电极施加电压的电压发生器；(c)一种感应电流发生器，其通过改变所述对置电极与所述生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；和(d)一种用于驱动所述电压发生器的电源。
84.权利要求83的装置，其中所述主电极不与所述生物体或其部分接触。
85.一种确定用于治疗疾病的外部电场暴露的最佳参数的方法，其包含(i)鉴别一种要在活的生物体中引发的所需的生物学反应；(ii)选择或测量该生物体中或来自该生物体的组织样品或培养物中的细胞膜上的平均感应电流密度；(iii)选择或测量在与所述生物体、样品或培养物相距为一特定距离时产生该选定的或测得的感应电流密度的外部电场；(iv)选择或测量一段持续时间以在膜上产生该选定的或测得的感应电流密度；(v)给所述生物体、样品或培养物施加该选定的或测得的电场以便在细胞膜上产生该选定的或测得的感应电流密度并达到该选定的或测得的持续时间；(vi)确定该所需的生物学反应发生的程度；(vii)任选地重复进行步骤(ii)至(vi)中的任何步骤；和(viii)鉴别以最佳方式引发所需的生物学反应的所述选定的或测得的感应电流密度的值、所述选定的或测得的外部电场的值、或所述选定的或测得的持续时间的值。
86.权利要求85的方法，进一步包含，在步骤(viii)之前，产生一剂量-反应曲线作为所述选定的或测得的感应电流密度、所述选定的或测得的外部电场、或所述选定的或测得的持续时间的函数。
87.权利要求85的方法，进一步包含，在步骤(viii)之前，选择或测量以下各项步骤(v)被重复进行的次数，步骤(v)被重复进行的时间间隔，和在膜上产生所述选定的或测得的感应电流密度的总的持续时间。
88.权利要求85的方法，其中所述选定的或测得的感应电流密度是大约0.001mA/m2至大约15mA/m2。
89.权利要求85的方法，其中所述细胞是培养细胞。
90.权利要求89的方法，其中所述培养细胞是人的细胞。
91.权利要求85的方法，其中所述细胞存在于活的生物体或其部分中。
92.权利要求91的方法，其中所述活的生物体是人。
93.权利要求85的方法，其中所述感应电流密度是通过测量通过所述活的生物体或其部分的一个特定截面的所述感应电流，通过将测得的电流转换成电压信号，通过将所述电压信号转换成光学信号，然后通过将所述光学信号重新转换成电压信号，并分析波形和频率而选定或测得的。
94.权利要求85的方法，其中所述感应电流密度以J代表，且J表示为J＝I/B。
95.权利要求85的方法，进一步包含给所述生物体、样品或培养物提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
96.权利要求95的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
97.一种用于进行权利要求85的方法的装置，其中所述装置是一种电场治疗仪器，其包含(a)一个主电极和一个对置电极；(b)一个用于给所述电极施加电压的电压发生器；(c)一种感应电流发生器，其通过改变所述对置电极与所述生物体或其部分之间的电压或者距离而控制所述外部电场；和(d)一种用于驱动所述电压发生器的电源。
98.权利要求97的装置，其中所述主电极不与所述生物体或其部分接触。
99.一种治疗增殖性细胞疾病的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的离子流动，该方法包括将所述生物体或部分与一电流相接触，所述电流在细胞膜上产生大约10mA/m2至大约100mA/m2的平均施加电流密度。
100.权利要求99的方法，其中所述离子包含钙离子，且基本上持续至少7天在细胞膜上产生所述平均施加电流密度。
101.权利要求99的方法，进一步包含给所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
102.权利要求101的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
103.权利要求99至101中任一项的方法，其中所述生物体是人。
104.用于进行权利要求99的方法的电流治疗装置。
105.一种治疗应激相关性疾病或症状的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的离子流动，该方法包括将所述生物体或部分与一电流相接触，所述电流在细胞膜上产生大约60mA/m2至大约600mA/m2的平均施加电流密度。
106.权利要求105的方法，其中所述离子包含钙离子。
107.权利要求105的方法，进一步包含给所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
108.权利要求107的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
109.权利要求105或107的方法，其中所述生物体是人。
110.用于进行权利要求105的方法的电流治疗装置。
111.一种治疗与血清钙浓度相关的疾病的方法，包含改变一种生物体或其部分的跨细胞膜的钙离子流动，该方法包括将所述生物体或部分与一电流相接触，所述电流在细胞膜上产生大约60mA/m2至大约2,000mA/m2的平均施加电流密度。
112.权利要求111的方法，其中所述离子包含钙离子。
113.权利要求111的方法，进一步包含给所述生物体或其部分提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
114.权利要求113的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
115.权利要求111或113的方法，其中所述生物体是人。
116.权利要求111的方法，其中所述电流在细胞膜上产生持续大约1分钟至大约20分钟的所述平均施加电流密度。
117.权利要求116的方法，其中所述电流在细胞膜上产生持续大约2分钟至大约10分钟的所述平均施加电流密度。
118.用于进行权利要求111的方法的电流治疗装置。
119.一种确定用于治疗疾病的电流暴露的最佳参数的方法，包含(i)鉴别一种要在活的生物体或其部分中引发的所需的生物学反应；(ii)选择或测量该生物体中或来自该生物体的组织样品或培养物中的细胞膜上的平均施加电流密度，其中所述平均施加电流密度是大约10mA/m2至大约2,000mA/m2；(iii)选择或测量可产生所述选定的或测得的施加电流密度的电流；(iv)选择或测量一段持续时间以产生所述选定的或测得的施加电流密度；(v)施加所述选定的或测得的电流以产生所述选定的或测得的施加电流密度并达到所述选定的或测得的持续时间；(vi)确定该所需的生物学反应发生的程度；(vii)重复进行步骤(ii)至(vi)中的任何步骤以产生剂量-反应曲线作为所述选定的或测得的电流、所述选定的或测得的施加电流密度、或所述选定的或测得的持续时间的函数；和(viii)鉴别以最佳方式引发所需的生物学反应的所述选定的或测得的电流的值、所述选定的或测得的施加电流密度的值、或所述选定的或测得的持续时间的值。
120.权利要求119的方法，进一步包含，在步骤(viii)之前选择或测量以下各项步骤(v)被重复进行的次数，步骤(v)被重复进行的时间间隔，和在膜上产生所述施加电流密度的总的持续时间。
121.权利要求120的方法，其中所述细胞是培养细胞。
122.权利要求121的方法，其中所述培养细胞是人的细胞。
123.权利要求120的方法，其中所述细胞存在于活的生物体或其部分中。
124.权利要求123的方法，其中所述活的生物体是人。
125.权利要求120的方法，进一步包含给所述生物体、样品或培养物提供钙添加剂、维生素D添加剂、凝集素添加剂、或所述添加剂的组合。
126.权利要求125的方法，其中提供所述凝集素添加剂且所述凝集素添加剂包含伴刀豆凝集素A或麦胚凝集素。
127.用于进行权利要求120的方法的电流治疗装置。
全文摘要
本发明涉及使用电流或电场疗法治疗疾病的方法和装置。本发明使用施加电流或由外部电场感应产生的电流来操纵跨细胞膜的离子运动并改变离子浓度。本发明可用于例如治疗过度增殖性疾病和心血管疾病以及用于减轻应激的影响。
文档编号A61N2/02GK1684736SQ03823413
公开日2005年10月19日 申请日期2003年7月30日 优先权日2002年7月30日
发明者原昭邦, 原浩之, 铃木义, 原川信二, 上中诚男, 戴维·E·马丁 申请人:株式会社白寿生科学研究所