一种有抗癌活性的杨属植物芽或芽鳞提取物的制作方法

专利名称：一种有抗癌活性的杨属植物芽或芽鳞提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于治疗或辅助治疗癌症等恶性肿瘤、或用于预防高危人群肿瘤发生的提取物及其制备方法，即以青杨组或黑杨组杨属植物的叶芽、花芽、芽鳞或这些部位的组合为原料，通过粉碎、水浸去除无活性或有潜在副作用的物质、有机溶剂抽提等步骤，获取有抗癌活性的有效成分，并制备抗癌药品或防癌保健品。
背景技术：
目前所用并经临床实践证明有效的各类抗癌药中，超过半数最初来自于天然产物、尤其是植物成分。近年来的统计表明，植物来源的抗癌药可占我国大医院抗癌药使用金额的50％以上，其中紫杉醇高居各类抗癌药的榜首(王佩、李玉珍、齐有利植物类抗肿瘤药成为市场主导，《临床资讯》2003年3月，第5期)。然而，现有来自天然产物的抗癌药，例如紫杉醇、三尖杉碱、喜树碱、长春花(新)碱、秋水仙碱、斑蝥素等，往往与合成抗癌药一样，亦有严重的毒副作用。从无毒或低毒天然产物中寻找和制备抗癌药、或现有抗癌方案的辅助增效与降毒制剂，具有重要的临床意义。由于以往的抗癌物质筛选策略本着“以毒攻毒”的理念，常常片面强调对癌细胞的杀伤力或细胞毒的强度，有可能漏失许多极有开发潜力的天然产物资源。本发明公布的抗癌植物提取物除了经实验证明对癌细胞具有足够强的杀伤力以外，还着重考虑到当应用于人体时，对肿瘤患者不至于产生严重毒副作用。故此发明人选取了具有悠久安全药用历史的杨属植物，用新颖方法制备了有效抗癌组分。
以杨柳目(Salicales)杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus L.)植物的不同部位入药，在中医药典籍，如《唐本草》、《本草纲目》、《千金方》、《雷公炮炙论》等内，均有大量记载。中医药文献所涉及的具体杨属植物名称(包括同种异名者)主要有白杨、山杨、毛白杨、响叶杨、团叶杨、大叶杨、明杨、移杨、白背杨、银白杨、小青杨、胡杨、胡桐等；入药部位一般为枝、叶、树皮、根皮、花序；而胡杨若以树脂入药，则特称为“胡桐泪”；“杨枸花”则为杨树花的别名。作为一种有悠久药用历史的传统中草药，杨树制剂的疗效和对人体无严重毒副作用的特点均得到过反复验证，如《本草纲目》中就有“苦，寒，无毒”的记载。此外，杨属植物的枝叶亦普遍用做牲畜饲料，证明有足够的生物安全性。在中医药典籍中，不同名称或种类的杨属植物制剂之主治范围大致相似，主要包括祛风、行瘀、排脓、解毒、治龋齿和顽癣疮毒、止咳化痰、镇痛、止痢、利水、治淋病、驱蛔等(参见《中医药大辞典》，江苏新医学院编，上海科学技术出版社，1986年5月第1版，第254页0508条、第440页0888条、第709页1413-1415条、第732页1451条、第745页1485条、第753页1513条、第1544页3223条、第1649页3398条等)。
在现代医药文献中也记载了某些杨属植物的药用方法。《中华人民共和国药典》(中华人民共和国卫生部药典委员会编，1977年版，一部，p287页)载有“杨树花”1条，并注明其功能与主治为“化湿止痢”。在《中药制剂汇编》(曹春林主编，人民卫生出版社，1983年，第一版)一书中，记载有多条以杨树花和杨树皮提取物制备医用药品的方法在第776页有“白杨树皮注射液”1条，用于治疗慢性气管炎；在第1287和1288页，有“杨树花片(I)”和“杨树花片(II)”2条，均用于治疗痢疾；在第1487页有“杨枸花合剂”1条，主治亦为“消炎止痢”。在《植物有效成分手册》(江纪武、肖庆祥主编，人民卫生出版社，1986年，第1版，第1261页)一书中，载有“颤杨甙”(即特里杨甙，tremulacin)1条，该成分是从颤杨(P.tremuloides)树皮中提取制得，可以解热利尿和治疗气管炎。
杨属植物在西方亦有悠久的药用历史。据《莫斯比草药和天然添加物手册》一书记载(Mosby’s Handbook of Herbs & Natural Supplements.Ed.by Linda Skidmore-Roth.Mosby Inc.，St.Louis.2001，p698-700)，以杨树皮粉末或杨树皮提取物入药，可以治疗关节炎、腹泻、尿道感染、感冒等多种疾病，与中医所述主治范围基本一致。但该书也同时指出，由于上述杨树制剂中含有水杨酸类物质，长期服用、尤其是与肝素或法华令等抗凝剂同时使用，有可能引起胃肠道出血等因凝血障碍所致副作用；此外，也偶有引起过敏反应者。
然而，从上述参考文献以及其他中医药文献和国外草药与天然物质文献中可知，杨树制剂能否用于抗癌尚无明确记载和可靠的实验数据。例如，在《抗癌动、植、矿物彩色图鉴及其应用》(夏光成、李德华主编，天津科技翻译出版公司，2001年1月第1版)、《现代中药临床手册》(丁安伟主编，江苏科学技术出版社，2000年8月第1版)等著述中，均无涉及杨属(Populus L.)植物的条款。而在《中药抗肿瘤有效成分药理与应用》(季宇斌、张广美主编，黑龙江科学技术出版社，1998年5月第1版，第119页)一书中，虽然列有“白杨素”(chrysin)这一词条，但对其来源植物的描述仅涉及木蝴蝶、山白松、乔桧和芒松。
杨属植物的生物活性组分主要包括黄酮类、多酚或单宁、水杨酸类、糖苷(甙类)、多糖、脂肪酸、酯类、木脂素等类型。近年来，来自药用或食用植物的黄酮与多酚类化合物的生物学作用尤其引人注目。某些杨属植物品种的花芽(floral bud)、叶芽(leaf bud)、芽鳞(bud scale)常常含有大量粘性物质(即所谓“芽脂”)。杨属植物的芽脂是由腺样表皮分泌的。黄酮与多酚类物质是许多杨属植物芽脂的主要成分。并非所有杨属植物都有芽脂的明显积累。而且，不同组(section)的杨属植物，芽脂成分可以出现很大差异。
从分类学上看，青杨组和黑杨组的物种或变种富含芽脂。研究发现，来自青杨组和黑杨组的芽脂化学成分相近，一般均含下列成分黄烷酮(flavanones)，如乔松素(pinocermbin)和乔松酮(pinostrobin)及其相应的查耳酮(chalcones)；黄烷酮醇(flavanonoles)，如短叶松素(pinobanksin)及其衍生物；黄酮(flavones)，如白杨素(chrysin)和7-甲氧基白杨素(tectochrysin，即柚木柯因)及其查耳酮；黄酮醇(favonols)，如高良姜素(galangin)、槲皮素(quercetin)、山柰醇(kaempferol)及其衍生物等。参见下列文献①The handbook of natural flavonoids.Ed.by Harborne，J.B.and Baxter H.Hohn Wiley & Sons，New York.1999，vol.I，p8；vol II，P118，p220，p222.
②English S.et al.，analysis of phenolics in the bud exudates of Populus deltoides，P.fremontii，P.sargentii and P.wislizenii by GC-MS.Phytochem.1992，31(4)，1255-1260.
③Greenaway W.& Whatley F.R.，Analysis of phenolics of bud exudate of Populus ciliata byGC-MS.Phytochem.1991，30(6)，1887-1889.
④Greenaway W.et al.Series of novel flavanones identified by gas chromatography-massspectrometry in bud exudate of Populus fremontii and Populus maximowiczii.J.chromatogr.1989，481，352-357.)。
上述多种化合物已从不同植物中提纯或人工合成，并已被证明具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、镇静和抗焦虑、对肿瘤细胞的细胞毒作用、抑制致癌物的致癌效应、抗紫外线辐射、抑制肿瘤细胞膜上的多药耐药蛋白和提高抗癌药疗效等多种有益的生物学作用。参见以下文献①Falvonoids in cell function.Ed.by Buslig B.S.& Manthey J.A.，in“Advances in experimentalmedicine and biology，vol.505”.Kluwer Academic/Plenum Publishers，New York.2002.
②Flavonoids and other polyphenols.Ed.by Packer L.，in“Methods in enzymology，vol.335”.Academic Press.2001.
③Zheng X.et al.，Synthesis and anticancer effect of chrysin derivatives.Bioorg.Med.Chem.Lett.，2003，13，881-884.
④Comte G.et al.C-Isoprenylation of flavonoids enhances binding affinity toward P-glycoproteinand modulation of cancer cell chemoresistance.J.Med.Chem.200l Mar 1；44(5)763-8.
⑤Galijatovic A.et al.Induction of UDP-glucuronosyltransferase UGT1A1 by the flavonoidchrysin in Caco-2 cells--potential role in carcinogen bioinactivation.Pharm.Res.2001 Mar；l8(3)374-9.
⑥Eaton E.A.et al.Flavonoids，potent inhibitors of the human P-form phenolsulfotransferase.Potential role in drug metabolism and chemoprevention.Drug Metab.Dispos.1996 Feb；24(2)232-7.
根据以上分析，发明人认为，青杨组和黑杨组芽脂中的以上多种组分、以及有可能存在的其他未知活性组分的综合效应，对于肿瘤治疗和预防是有价值的。本发明公布了一种从杨芽脂或芽鳞脂中以低成本获取高活性抗癌防癌提取物的方法，并在细胞和动物实验中证明了其有效性。
与本发明有一定相似点的专利文献如下①TURETSKOVA V F，KRYLOVA S G，ZUEVA E P“Obtaining an extract having anti-tumouractivity-by ethanol extn.of aspen bark in a battery of 5-6 diffusers in a complete or incompletecycle”.专利号RU2067451-C1.
公开日1996年10月10日。该发明报道，从杨树皮制备的提取物治疗恶性肿瘤的效果优于或相当于长春花碱。但发明所用的原料和制备方法与本发明都有明显不同。
②POPRAVKO S A“Natural medicinal-prophylactic food additive-contains specifiedbiologically active substance，ascorbic acid and monosaccharide(s)”.专利号RU2090099-C1.
公开日1997年9月20日。该发明旨在用蜂胶、白桦树芽、杨树芽、以及其他多种植物的提取物，配制一种性质与天然蜂蜜相似的食品添加物，用作医疗保健。这与本发明的目的和技术方案不同。
③FABRE B，TEYSSEYRE V，ARIES M，ARIES M F“Antiinflammatory association of squalaneand a non-allergenic extract of poplar buds”.专利号WO200067767-A；WO200067767-A1；FR2793141-A1.
公开日WO200067767-A1为2000年11月16日；FR2793141-A1为2000年11月10日。该发明从黑杨(Populus nigra L.)芽制备含有多酚、酚酸、但不含酚酯的提取物后，与角鲨烷(squalane)混合，制得一种抗炎药。这与本发明的目的和技术方案不同。
④KURKIN V A，BRASLAVSKII V B，ZAPESOCHNAYA G G“Method of preparing poplartincture for treatment of suppurative-inflammatory soft tissue diseases”.专利号RU2135201-C1.
公开日1999年8月27日。该发明公开了一种从杨属植物制备杨芽酊剂，以治疗化脓性炎症等软组织疾病的方法。这与本发明的目的和技术方案不同。

发明内容
本发明的目的在于提供一种对肿瘤细胞有高效杀伤力，而对正常细胞没有、或仅有很小毒性的抗癌活性物质提取物，该提取物或用于制备抗癌药物，或用于防癌保健品的添加剂。
本发明的技术方案和内容包括原料植物和植物部位的选择、有抗癌活性的提取物制备、提取物的性质、用提取物制备抗癌药或防癌保健品的方法、提取物的抗癌效果等部分，现分述如下1，原料植物和植物部位的选择如在“背景技术”中所述，黄酮类和多酚类是杨属植物生物活性的重要体现物质。杨属植物的黄酮类和多酚类物质常常呈现从黄色到褐色的颜色变化范围。故此，本发明强调在取材上应选择具有明显亮黄色、桔黄色、黄红色、黄褐色、赤褐色、或紫褐色粘性物质(即芽脂)积累的花芽(floral bud)、叶芽(leaf bud)、或花芽与叶芽的芽鳞(bud scale)。取材植物应是隶属于青杨组和黑杨组的富含芽脂的物种、变种、变型、杂交种。这些品种在我国广泛栽培，资源极其丰富。具体如下(1)青杨组(Sect.Tacamahaca Spach)包括小叶杨(P.simonii)、小青杨(P.pseudo-simonniKitag.)、青杨(P.cathayana)、哈青杨(P.charbinensis)、东北杨(P.girinensis)、玉泉杨(P.nakaii)、冬瓜杨(P.purdomii)、甜杨(P.suaveolens)、兴安杨(P.hsinganica)、香杨(P.koreana)、辽杨(P.maximowiczii)、大青杨(P.ussuriensis)、欧洲大叶杨(P.candicans)、苦杨(P.laurifolia)、川杨(P.szechuanica)、滇杨(P.yunnanensis)、小钻杨(P.×xiaozhuanica)等。
(2)黑杨组(Sect.Aigeiros Duby)包括黑杨(P.nigra)、钻天杨(P.italica)、箭杆杨(P.thevestina)、加杨(Populus×canadensis)、小黑杨(P.×xiaohei)、北京杨(P.×beijingensis)等。
以上各品种的命名和描述均以《中国植物志第二十卷第二分册》为准(中国科学院中国植物志编辑委员会，科学出版社，1984)。
虽然亦可从杨树的树皮、木心或花序中提取具有抗癌活性的黄酮类和多酚类物质，如白杨素等，但这些部位的抗癌有效成分含量低，从而使得制备工艺繁琐、成本高；更有甚者，这些部位由于富含水杨酸和甙类等物质，如不设法去除，长期服用有可能导致胃肠道反应和凝血障碍等副作用。本发明在原料的选材上可以避免上述缺点。本发明的最佳原料选材为某些杨属植物的花芽在开花后脱落于地面的芽鳞，因为量大、易于采集，并且不会对植株有任何损害。
2，有抗癌活性提取物的制备按上文技术方案的第1部分所述，采集正确植物的正确部位，亦即来自于青杨组或黑杨组杨属植物的叶芽、花芽、芽鳞，或叶芽、花芽、芽鳞的混合物，做为提取抗癌物质的原料。该原料可以来自于青杨组或黑杨组中的某一个单一杨树品种、变种、杂交种；也可以是混杂性的，即来自于两个或两个以上青杨组或黑杨组中的不同品种、变种或杂交种。也就是说，该原料的正确植物来源和正确部位来源都既可以是单一性的，也可以是混杂性的。该原料可以在新鲜状态下直接进行下述操作；亦可先经自然晾干或晒干，或先于烤箱或烘箱中于35℃至80℃的条件下烘干，或经远红外辐射、干燥气流吹拂、真空冷冻等方法和装置干燥。称取上述新鲜或干燥原料适量，按下述步骤操作(1)去除水溶性无活性或有副作用的物质对于称重后的新鲜原料，先以自来水或类似的洁净水漂洗或淋洗，去除泥土等杂质。加入是原料鲜重的0.5倍到10倍的去离子水或蒸馏水。具体加水量以有利于后述粉碎操作为度。用一种能对水中的植物性材料进行粉碎的装置将原料粉碎，例如，用具有旋转桨叶的机械装置，如匀浆机进行粉碎。粉碎后的状态可以是颗粒、纤维或薄片。颗粒或纤维的直径能够达到2毫米即可；薄片的厚度在2毫米即可。滤除水分，收集粉碎后的原料。收集方法可以是用筛子截留，也可以是用纱布或尼龙布等有网孔的布截留。筛子或有网孔的布类的选择指标是网孔的大小能够保证将原料碎片或碎末全部截留。将截留的原料碎片或碎末转移到一个容器中，加入是原料鲜重的2倍到20倍的去离子水或蒸馏水，于4℃至100℃搅拌5分钟至24小时。搅拌温度以20℃至50℃为佳；若在室温搅拌，搅拌时间以0.5至4小时为佳。滤除水溶液，重复加水搅拌1至3次。以上过程亦可按连续淋洗的方法操作。滤除水分，亦可对截留的原料碎片或碎末进行适当的压榨或减压抽滤，以尽量除去水分，得到去除了水溶性物质的粉末，用于进行后述步骤(2)的操作。
新鲜原料亦可经低温冷冻粉碎后，加入是原料鲜重的2倍到10倍的去离子水或蒸馏水，按上文所述方法去除水溶性无活性或有副作用的物质，从而得到去除了水溶性物质的粉末。
由于来自某些品种的新鲜原料含有大量粘性的芽脂，不利于粉碎操作，故需要先将原料干燥。原料干燥后，先于粉碎或研磨器械中制成粉末。粉末的粒径在0.01至2毫米之间即可。将研碎的原料称重。先以自来水或类似的洁净水漂洗或淋洗，去除泥土等杂质。滤除水分，加入是原料重量的2倍至20倍的去离子水或蒸馏水，在适宜容器中于4℃至100℃搅拌10分钟至24小时。搅拌温度以20℃至80℃为佳。滤除水溶液，按上述条件重复加水搅拌1至3次。以上过程亦可按连续淋洗的方法操作。滤除水分，亦可对截留的原料碎片或碎末进行适当的压榨或减压抽滤，以尽量除去水分，从而得到去除了水溶性物质的粉末。
(2)极性有机溶剂提取活性成分取按步骤(1)制备的去除了水溶性物质的原料粉末，称重后按以下步骤操作按2至10倍的重量/体积比例加入某种极性有机溶剂。此处的极性有机溶剂是指某种可以与水混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙二醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈、吡啶、乙二醇独甲醚、二甲亚砜、二氧六环、二甲基甲酰胺等，其中又以易挥发的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等为佳。所用极性有机溶剂的浓度在50％至100％之间，亦即含0％至50％体积份或重量份的水。优选含水2％至5％的乙醇，即浓度为95％至98％的乙醇。将上述原料粉末在所选有机溶剂中于室温或加热条件下搅拌10分钟至24小时，抽提有效成分；或者以回流或淋漉的方式抽提有效成分。滤去残渣，残渣可用前述方式重复抽提1次。将所得抽提液减压浓缩至干，即为有抗癌活性的杨属植物芽或芽鳞提取物。
上述步骤(1)和步骤(2)亦可按相反的顺序进行，即原料经粉碎后，先按步骤(2)的方法以有机溶剂提取有效成分；将浓缩蒸干后的有效成分研磨成粉末或颗粒状，再用前述步骤(1)的原理，加水溶解水溶性无活性或有潜在副作用的物质；滤去水分，得到水中不溶解的剩余物质，将剩余物质干燥，即为有抗癌活性的杨属植物芽或芽鳞提取物。
(3)非极性有机溶剂脱除杂质上述杨属植物芽或芽鳞提取物可进一步用非极性或弱极性有机溶剂脱除少量残留的脂类等杂质。称取一定量的上述由步骤(2)所得提取物，按2至10倍的重量/体积比例加入某种非极性或弱极性有机溶剂，如烷烃、卤化烃、醚类、酯类等，其中以环己烷、己烷等易挥发的烷烃为佳。搅拌或回流20分钟至24小时。滤除溶剂。将所余固体成分充分干燥，酌情研磨，即得脱脂后的提取物。提取物经脱脂处理后更容易研磨成粉末保存。脱脂处理并不影响提取物的下述各种性质和抗癌活性，故以下记述不再区分脱脂处理与否。由来自青杨组和黑杨组不同品种杨树的芽或芽鳞制备的提取物，下述性质和抗癌活性也无明显差异，故以下记述亦不再区分品种来源。
3，提取物的性质经充分干燥的杨属植物芽或芽鳞提取物外观上呈褐色的蜡状固体，常结成无定型团块。可将经充分干燥的提取物研磨成浅黄色至黄褐色的粉末。若未经充分干燥，则呈褐色浸膏状。提取物有杨树芽的特殊香味，尝之微苦并有轻微麻舌感觉。提取物较难溶解于水和甘油，亦难溶于己烷和环己烷等非极性溶剂；易溶于乙醇、四氢呋喃等极性有机溶剂，并且溶液随浓度的不同，呈现黄色至褐色的变化范围。提取物在不同溶剂或溶液中的溶解量见表1。
表1，有抗癌活性的杨属植物芽或芽鳞提取物在24℃的溶解量

注①在此浓度下呈乳浊状。②PBS的组成为含0.123M NaCl的0.01M Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液。
将加杨芽鳞提取物溶解于光谱纯乙腈中，浓度为16μg/ml，扫描测定紫外和可见光吸收曲线，结果见

图1。图中可见在波长190nm至700nm的范围内有两个紫外吸收峰，分别位于198和290nm附近，并在251nm处有一峰谷。
经高压液相检测(方法参见Tomas-Barberan，FA；Garcia-Viguera，C；Vit-Olivier，P；Ferreres，F；Tomas-Lorente，F.Phytochemical evidence for the botanical origin of tropical propolis fromVenezuela.Phytochemistry，vol.34，no.1，pp.191-196，1993)，提取物中含有乔松素和白杨素等黄酮类物质，同时含有多个尚未鉴定的洗脱峰。根据提取物富含黄酮类的特点，提取物宜密封避光储存，以防氧化。
4，用提取物制备抗癌药或防癌保健品的方法(1)将提取物以0.01％至8％的浓度溶解于乙醇中，制成酊剂。可供外用、口服，亦可按肿瘤介入治疗方案将酊剂导入肿瘤组织，直接杀死肿瘤细胞。或将提取物以0.01％至5％的含量溶解于或混悬于饮用酒类中，制成药酒饮用。
(2)在助溶剂如乙醇、乙二醇、丙二醇的辅助下，将提取物以0.1％至20％的浓度配制成糖浆或口服液，饮用。
(3)将提取物单独或与辅料配伍，制成丸剂、粒剂、粉剂、片剂，口服。
(4)将提取物填充胶囊，口服。
(5)将提取物与一定比例的乙二醇、丙二醇、乙醇等助溶剂配伍，经过滤除菌或高压灭菌后制成注射液。
(6)将提取物与辅料配伍，制成膏剂。涂抹皮肤，用于防治皮肤癌。
5，提取物的抗癌效果(1)提取物对多种癌细胞的杀伤作用人肝癌细胞BEL-7402、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、小鼠肉瘤细胞S180等细胞系，均由本实验室保存。人鼻咽癌细胞系CNE购自中科院上海细胞生物研究所。所用细胞培养基为含10％小牛血清的RPMI-1640培养基(Gibico公司)。各类细胞于37℃在通入5％CO2的孵育箱中培养。有关操作在超净台中进行。实验时取对数生长期的细胞，接种于96孔细胞培养板(Nunc公司)，培养并进行下述实验
将人肝癌BEL-7402细胞以5×103/的密度接种于96孔板，培养24小时后加入药物，方法如下先将提取物以无水乙醇溶解，再经75％乙醇与灭菌蒸馏水依次分级稀释后，加入培养孔，使培养孔中提取物的浓度为16μg/ml。向阴性对照孔加入经按同样方式稀释的溶剂(培养孔含终浓度为1.5％的乙醇)。向阳性对照孔加入顺铂，使其终浓度为1μg/ml。细胞在加药后继续培养，并每隔24小时用酸性磷酸酶法测定细胞相对数目(参见陈学清，杨晓鸥，潘国宗等酸性磷酸酶法在体外化疗药物筛选中的应用，癌症，1998，17(6)477-478)。实验中每组设平行孔3个，细胞相对数目用平均值表示。绘制细胞生长曲线(图2)。
图2可见，杨芽和芽鳞提取物对人肝癌细胞BEL-7402细胞的增殖有明显的抑制作用，一次给予16μg/ml的提取物即可显著抑制癌细胞的增殖，效果接近于1μg/ml的顺铂。
另将四种不同的肿瘤细胞分别按1×103/孔的密度接种于96孔板，培养24小时后加入药物，方法如下先将提取物以无水乙醇溶解，再经75％乙醇与灭菌蒸馏水分级稀释，使培养孔中提取物的终浓度范围在0.32-32μg/ml。向阴性对照孔加入经同样方式稀释的溶剂(根据稀释度的不同，相应地含0.03-3％乙醇)。细胞在药物作用下培养60小时后，用酸性磷酸酶法测定细胞相对数目，计算提取物对细胞增殖的抑制率(图3)。从图3可见，提取物对人肝癌细胞、人肺癌细胞、小鼠S180肉瘤细胞的增殖有明显抑制作用，抑制程度随给药剂量的增加而明显增强，但对正常细胞的抑制作用非常弱。提取物对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50值见表2表2，杨属植物芽或芽鳞提取物对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50

(2)提取物对癌细胞的选择性细胞毒作用为观察提取物对癌细胞的选择性细胞毒作用是否优于已知化疗抗癌药，我们以人肝癌BEL-7402细胞和人正常肝细胞系L02为对比实验对象，比较了顺铂和提取物的作用特点。从图4A可见，顺铂的抗癌活性高于提取物，即在更低的浓度下便可显著抑制人肝癌BEL-7402细胞的增殖。然而，顺铂对人正常肝细胞的杀伤力亦极大，对肝癌细胞和正常肝细胞的抑制率曲线非常接近，表明其细胞毒作用的选择性低。我们在小鼠肿瘤模型上也观察到顺铂的化疗治疗剂量与致死剂量非常接近，给予顺铂的小鼠虽然肿瘤生长受到了抑制，但在顺铂的毒副作用下，小鼠的生存质量极度恶化，体重大幅度下降。相反，从图4B可见，提取物不仅对肝癌细胞的增殖有显著抑制作用，而且对正常肝细胞的毒性非常低，对这两种细胞的抑制率曲线相差极大。表明提取物对癌细胞的选择性细胞毒作用大大优于顺铂。
(3)提取物的体内抗癌活性实验动物为BALB/c小鼠，雄性，6-8周，体重18-22g。按每组6只小鼠，分为实验组和对照组两组，以每只鼠0.5×105个肿瘤细胞的数量接种小鼠腹水型肝癌细胞H22。实验组每天1次，向每只鼠腹腔注射提取物1.5μg。对照组按同样方式注射空白溶剂。连续注射17天后停止给药，观察并绘制生存曲线(图5)。实验结果显示，提取物可以显著延长荷瘤小鼠的存活时间。在肿瘤接种后的第21天，对照组已有一半小鼠死亡，而给药组只有一只鼠死亡。在肿瘤接种后的第30天，对照组只有一只鼠存活，而给药组仍有一半小鼠存活。
(4)提取物对癌细胞形态结构和增殖能力的影响细胞按104/ml接种于24孔板，孔中预先放入圆形盖玻片，使细胞贴在盖玻片上生长。分别向有关孔中加入提取物和溶剂对照。经培养后，取出玻片，经固定、脱水、临界点干燥、镀膜(金)等标准扫描电镜制片程序后，用扫描电镜(JEOL-5600LV)观察并照像(图6)。另将给药和对照组细胞经一定时间培养后取出，以结晶紫染色，于光镜(Nikon Optiphot)下观察，并用美国ImageProPlus图像分析系统记录。
从放大1000倍的扫描电镜图像上看，以溶剂为对照的人肝癌细胞(图6A)表面光滑，细胞铺展成片，彼此汇合，表明存在细胞连接等完整超微结构。视野内同时可见叠生在铺展细胞上的一些球状细胞，并常常成对排列成花生状，表明不久前发生过细胞分裂。这种重叠生长和接触性抑制丧失的现象是恶性细胞的典型表型。而在给予提取物的实验组(图6B)，癌细胞出现皱缩，细胞间距显著加大，细胞表面微绒毛样突起明显增多，重叠生长现象基本消失，细胞分裂相减少或缺如。这些变化表明，癌细胞的超微结构已经严重破环，丧失了增殖能力，并出现高分化细胞样的表型。在视野的左下角和右上角，还可看到一些死亡细胞的碎片。将癌细胞继续培养，并经光镜和图像分析系统观察和记录，则进一步发现在提取物的作用下，癌细胞内部有大量液泡积累，视野内癌细胞数明显减少，并有许多死细胞碎片，证明提取物可明显抑制癌细胞增殖，并导致癌细胞大量死亡崩解。
(5)提取物的毒性实验将体重18至22g的昆明小鼠分为两组，实验组有雌、雄鼠各5只，对照组有雌、雄鼠各2只。实验组每只鼠腹腔注射含提取物的注射液0.1ml，对照组注射0.1ml不含提取物的空白溶剂。空白溶剂的组成(体积百分比)为65％丙二醇、20％无水乙醇、15％生理盐水。取空白溶剂，加入提取物，配成10mg/ml的浓度，即为实验组注射液，按每只鼠0.4mg/kg的量注射。注射后观察7天，各组鼠状态均无异常。第7天解剖各鼠，与对照组相比，给药组小鼠各脏器未见异常，表明提取物在该剂量下未见明显毒性。该剂量显著高于有效抗癌剂量。
总之，发明人用多种癌细胞证明，按本发明所述方法制备的青杨属或黑杨属植物的芽或芽鳞提取物具有显著的抗肿瘤活性，可严重破环肿瘤细胞的超微结构，使肿瘤细胞皱缩、内部积累大量液泡、并出现高分化细胞样的表型，最终导致肿瘤细胞大量死亡。而在同样浓度下，提取物对正常细胞的毒性却非常低。由于本发明所涉植物资源极其丰富，制备过程简便易行、产率高、成本极低，所以本发明具有显著的实用性。本发明的完成得到了国家自然科学基金项目(30070184)和国家自然科学基金重点项目(30330690)的支持。
具体实施例方式
实施例1采集加杨芽鳞，晾干后称取50g，经自来水清洗后，置于食品匀浆机(北京三和机电有限责任公司)中，加去离子水200ml，以14000转匀浆10分钟。将匀浆物转移到烧杯中，加去离子水至400ml，用电子恒速搅拌机(杭州仪表电机厂)在室温下以200rpm/min搅拌过夜。在加滤纸的布氏漏斗上减压抽滤，弃滤液。所得滤渣转移至1000ml无水乙醇中，50℃水浴搅拌1小时。按上述方式过滤后，收集乙醇提取液，减压加热蒸发至干。共得提取物11.97g，产率23.9％。
实施例2称取干燥加杨叶芽100g，在研钵中研成粉末。将粉末转移到容器中，加入500ml去离子水，于70℃搅拌20分钟。用衬有滤纸的布氏漏斗减压抽滤，弃去滤出的水溶液。将滤纸截留的粉末按上述条件重复用水搅拌漂洗2次，滤除水溶液。所得粉末湿重为264g。将粉术转移到容器中，加入500ml 95％乙醇，搅拌加热到70℃后继续搅拌加热20分钟。用衬有滤纸的布氏漏斗减压抽滤，收集滤出的乙醇溶液。滤渣按上述方式用500ml 95％乙醇重复抽提一次，过滤并收集滤出的乙醇溶液。合并两次抽提所得乙醇溶液，减压加热蒸干，回收乙醇。共得提取物16.44g，产率16.4％。
实施例3采集干燥加杨芽鳞，在粉碎机(FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司)中切成粉末。称取粉末100g，转移到容器中，加入500ml 98％乙醇，于24℃搅拌4小时。用衬有滤纸的布氏漏斗减压抽滤，收集滤出的乙醇溶液。滤渣按上述方式用300ml 98％乙醇重复抽提一次，过滤，收集滤出的乙醇溶液。合并两次抽提所得乙醇溶液，减压加热蒸发至浓稠浸膏状。在剧烈搅拌下将浸膏加入500ml蒸馏水，于24℃搅拌1小时。用衬有滤纸的布氏漏斗减压抽滤，弃去滤出的水溶液。用蒸馏水淋洗滤纸上的粉末。将粉末转移到容器中，加入100ml环己烷，于24℃搅拌1小时。过滤去除环己烷，将所得粉末晾干，研磨成细粉，过筛。共得经环己烷脱脂后的提取物21.55g，产率21.6％。
实施例4采集钻天杨花芽和叶芽，自然晒干后，在粉碎机(FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司)中切成粉术。称取45g粉末，转移到容器中，加入450ml去离子水，于24℃搅拌2.5小时。用衬有滤纸的布氏漏斗减压抽滤，弃去滤出的水溶液。将截留的粉末转移到容器中，加水225ml，于24℃搅拌1.5小时。减压抽滤，弃去滤出的水溶液。将截留的粉末转移到容器中，加入225ml 95％乙醇，于24℃搅拌过夜(约15小时)。减压抽滤，收集滤出的乙醇溶液，在旋转蒸发仪上减压加热蒸干，得提取物3.63g(产率8.1％)。将上述初次乙醇抽提后的滤渣用225ml 95％乙醇于24℃搅拌1小时，过滤并收集滤出的乙醇溶液，蒸干后得到二次乙醇抽提物1.29g(产率2.9％)。经两次乙醇抽提共得钻天杨芽提取物4.92g，产率10.9％。
实施例5采集青杨叶芽，在45℃烘箱中烤干。用粉碎机切成粉末。称取50g粉末，转移到圆底烧瓶中，加入250ml 98％乙醇，加热回流0.5小时。减压抽滤，收集滤出的乙醇溶液，在旋转蒸发仪上减压加热蒸干。将所得固体研磨成粉末，加入100ml去离子水，室温搅拌1小时。滤去水分，得到水中不溶解的剩余物质，于45℃烘箱中烤干，共得青杨芽提取物4.20g，产率8.4％。
实施例6称取提取物20g，加入400ml无水乙醇溶解，过滤除菌并除去悬浮物后，得到含5％提取物的酊剂。可直接涂抹于患处，亦可按肿瘤介入治疗方案将酊剂导入肿瘤组织，直接杀死肿瘤细胞。若用于口服，临用前需用水冲兑稀释2至10倍，或按下述方法配成药酒取上述含5％提取物的酊剂100ml，缓缓加入处于剧烈搅拌条件下的300ml市售红星二锅头酒中，继续在搅拌条件下加入100ml饮用水，制成含提取物1％的药酒。提取物在该药酒中处于混悬状态，饮用前摇匀。
实施例7按下述方法将提取物制成糖浆或口服液饮用(1)称取提取物10g，加入85ml无水乙醇，40ml乙二醇，加热搅拌溶解，是为溶液A。
(2)取500ml蒸馏水，加入蔗糖75g，果胶2.5g，维生素C 1.0g。加热搅拌溶解。加入香精适量，是为溶液B。
(3)将溶液A缓慢加入剧烈搅拌的溶液B中，即为含提取物1.6％的抗癌糖浆。可进一步将糖浆按每瓶10ml的量分装于安培瓶中，经充氮、密封和高压灭菌处理后，制成口服液。
实施例8将提取物整粒后与药典所载辅料如淀粉、硬脂酸镁等配伍，制成丸剂、粒剂、粉剂、片剂(包括糖衣片)。口服。
实施例9取整粒后的提取物0.25g填充胶囊，口服。
实施例10以下操作在超净台中进行。有关器皿经高压灭菌。称取提取物1g，加入无水乙醇20ml，溶解后以0.2μm的微孔滤器(PULL公司提供)过滤。向滤出液中加入经高压灭菌后的丙二醇65ml，混匀。在搅拌下加入15ml含0.01mol/L Na2HPO4/NaH2PO4和0.123mol/LNaCl的PBS缓冲液(pH7.7)。以每支1ml的量密封分装于灭菌后的安培瓶中，即成含1％提取物的注射液。为进一步确保无菌，可在安培瓶密封前充氮，密封后进行高压灭菌。
实施例11
将提取物与辅料配伍，制成膏剂。涂抹皮肤，用于防治皮肤癌等。可按下述配方制备(1)提取物10g，加丙二醇100g，加热至70℃混匀，即为混合组分A。
(2)硬脂醇80g，凡士林80g，羊毛脂50g，加热至70℃混匀，即为混合组分B。
(3)蒸馏水120g，甘油63g，硼砂2g，香精适量，加热至70℃混匀，即为混合组分C。
将上述三种预热至70℃的混合组分A、B、C在剧烈搅拌下混匀，即为含2％提取物的膏剂。
权利要求
1，一种可用于治疗、辅助治疗或预防癌症等恶性肿瘤的提取物，其特征在于它是由取自杨属植物(Populus L.)的叶芽、花芽、或芽鳞的原料经溶剂提取制成。
2，根据权利要求1所述的提取物，其原料的取材特征是植物应隶属于青杨组(Sect.Tacamahaca Spach)或黑杨组(Sect.Aigeiros Duby)的物种、变种、变型、杂交种，例如青杨、小叶杨、黑杨、钻天杨、加杨等；植株的取材部位应是叶芽、花芽、叶芽的芽鳞、花芽的芽鳞，或前述取材部位以任意方式的组合。
3，根据权利要求1所述的提取物，其理化特征在于它是一种呈褐色的蜡状固体、或呈褐色浸膏状、或为浅黄色至黄褐色的粉末；该提取物难溶于水和甘油，易溶于乙醇、四氢呋喃、丙二醇等极性有机溶剂，难溶于己烷和环己烷等非极性溶剂；该提取物溶解于极性有机溶剂中后呈黄褐色溶液，在紫外光区有两个吸收峰，其中一个位于长波区的最大吸收峰在290nm附近，两个吸收峰的峰谷位于251nm附近。
4，根据权利要求1所述的提取物，单独或与其他成分加工制成抗癌药或防癌保健品，其剂型特征属于酊剂、药酒、混悬液、丸剂、粒剂、粉剂、片剂、胶囊、注射液、膏剂中的任何一种，并且在其中含有0.01％至100％重量份的杨属植物芽或芽鳞提取物。
5，一种有抗癌活性的杨属植物芽或芽鳞提取物，其特征在于按以下方法制备(1)将原料粉碎，加水处理去除水溶性无活性或有副作用的物质；(2)滤除水分后，所得固体用含水或不含水的极性有机溶剂提取。
6，在权利要求5所述提取物的制备方法中，制备过程的操作顺序亦可以是(1)先将粉碎后的原料用含水或不含水的极性有机溶剂提取，(2)脱除提取液中的有机溶剂后，再加水处理去除水溶性无活性或有副作用的物质。
7，在权利要求5和6所述提取物的制备方法中，所述含水或不含水的极性有机溶剂可以是以下任何一种、或一种以上溶剂的混合物甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙二醇、丙酮、四氢呋喃、乙二醇独甲醚、乙腈、吡啶；其中优选乙醇。
8，在权利要求5和6所述提取物的制备方法中，所述极性有机溶剂可以含0％至50％体积份或重量份的水；其中优选含水2％至5％的乙醇，即浓度为95％至98％的乙醇。
9，在权利要求5和6所述提取物的制备方法中，步骤(1)和步骤(2)的操作过程在0℃至100℃之间进行；其中优选20℃至80℃的温度范围。
10，根据权利要求5和6所述方法制备的提取物，经干燥后，可进一步用非极性或弱极性有机溶剂抽提去除脂类等无活性物质，所用非极性或弱极性有机溶剂包括烷烃、卤化烃、醚类、酯类；其中以环己烷、己烷、或石油醚为佳。
全文摘要
本发明公开了一种从杨属植物制备的有抗癌作用的提取物，并公开了该提取物的制备方法和将该提取物加工成抗癌药或防癌保健品的方法。该提取物的原料取材于资源极其丰富的青杨组或黑杨组杨树的花芽、叶芽或芽鳞。提取物的制备方法包括粉碎、去除水溶性物质、加入极性有机溶剂如乙醇抽提活性成分、并进一步用非极性或弱极性有机溶剂抽提去除脂类等步骤。实验证明该提取物对多种人和鼠的癌细胞有显著杀伤作用，可使肿瘤细胞皱缩、分裂相减少、出现高分化细胞样的表型、直至肿瘤细胞死亡崩解。在同样浓度下提取物对正常人细胞的毒性极小。在活体实验中，提取物能显著延长荷瘤小鼠的生存时间。
文档编号A61P35/00GK1666753SQ200410007509
公开日2005年9月14日 申请日期2004年3月12日 优先权日2004年3月12日
发明者张页, 陈希, 赵翔 申请人:北京大学