专利名称：人工关节的制造方法
技术领域：
本发明涉及人工关节的制作方法。具体来说，涉及在任意的曲面上加载具有适当厚度的细胞层，在关节面全部范围内修复软骨层的基础技术。
背景技术：
软骨是由软骨细胞和软骨基质构成的结缔组织，关节骨是被有足够厚度的软骨覆盖的组织。关节由软骨支撑，因此可以顺滑活动。但是，一旦软骨受到损伤或破坏，极少可以自然治愈。因此，对于因变形性关节病、关节风湿病等使得关节的功能极度降低的病例，选择采用了含有金属或陶瓷、聚乙烯的人工关节置换术。该方法是将损伤的关节软骨切除，用金属、陶瓷或聚乙烯等人造物质覆盖关节面的手术方法，在世界范围得到广泛的普及，目前是主要的治疗方法。并且经过长期的材质的改良或设计的改良等，其有效性可达到10年或以上这样的长时间。
但是，金属、陶瓷或聚乙烯对于机体来讲是异物，是没有自身修复能力的材料。并且，源自材料的各种问题例如会产生摩擦、腐蚀疲劳、人工关节与骨界面的松动、嵌入、感染等。实际上有很多因人工关节磨损和损伤而不得不重新手术的病例。
因此，人们希望开发出新的治疗方法，以代替现有的使用人造物质作为材料的人工关节的治疗方法。
近年来，以ES细胞或来自自身的细胞为基础的组织或器官的再生研究日益活跃。针对关节软骨中的部分缺损开发出了利用各种组织工程学的技术。例如开发了将来自自身的细胞移植到缺损部位，诱导周围的健康部位分泌再生因子，以治愈缺损的方法(Treatment of deepcartilage defects in the knee with autologous chondrocytetransplantation.N Engl J Med.1994 oct 6；331(14)889-95)。但是，该技术不过是包埋缺损部位的方法，难以作为大范围的关节破坏的治疗方法应用。
另一方面，Vacanti等人发表了关于缺损的耳廓或手指的再生方法的研究(Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cellconstruct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a humanear.Plast Reconster Surg.1997 Aug；100(2)297-302)。该方法是将患者的细胞附着于预先成型为耳或手指形状的聚合物等载体上，将其移植到裸小鼠的皮下，使用由小鼠提供的营养，促进胶原等胞外基质的产生，以获得移植组织的形状的方法。裸小鼠是免疫系统缺损的小鼠。使来自患者的细胞在小鼠体内增生，然后重新移植给患者，具有无排斥反应的特征，因而利用价值高。
但是，小鼠的大小是有限度的，因此，可由该方法制备的组织的大小依赖于小鼠的大小。另外，该方法在宗教上或动物保护方面存在问题。并且，还必须时常考虑到对动物的排斥感、以疯牛病为代表的传染病的风险等。也进行了使比小鼠大型的动物例如猪的免疫机能缺损，应用于再生医疗的尝试，但这种情况下，对于将经由其它种动物的体内的组织移植到人的行为，人们会产生厌恶感或有未知的传染病的风险等，这些问题尚未见任何解决办法。
还有公开了以凝胶作为模具，在模具的周围附着细胞悬浮液，并使细胞附着于聚合物等上面的方法(日本特开2003-144139号公报)。该方法的目的是附着细胞悬浮液，因此，实际上不过是制备了膜状细胞层，难以制备具有象关节软骨那样厚度的组织。
因此，为了使相当于关节软骨的部分具有厚度，还有人发表了使软骨细胞附着于预先用分解性聚合物制备的棉状支撑物上，使其具有厚度的方法。但是，该方法中，聚合物残留在关节软骨部分上，可能会在分解过程中转变为有毒物质，对细胞产生不良的影响(Chondrogenesis in a cell-polymer-bioreactor system.Exp Cell Res.1998Apr 10；240(1)58-65.)。
另一方面，人们还尝试了将细胞包埋于胶原凝胶内进行软骨再生，但胶原来自牛等其它动物，与移植受体可能有亲和性的问题(Transplantation of cartilage-like tissue made by tissue engineering inthe treatment of cartilage defects od knee.J Bone Joint Surg Br.2002May；84(4)571-8)。
发明内容
如上所述，人们希望开发出可代替目前的金属、陶瓷、聚乙烯的人工关节，对于大范围的关节破坏有效，并且不会有对于使用其它种动物的厌恶感或未知的传染病风险的新型的人工关节。
本发明人为解决上述课题进行了深入地研究，结果发现使细胞团附着于任意载体的表面，在规定条件下进行培养，可形成目标软骨，从而完成了本发明。
即，本发明提供软骨的制作方法，其特征在于使细胞团附着于加工成目标形状的载体的表面，在诱导向软骨组织分化的条件下培养上述细胞团。本发明还提供人工关节的制作方法，其特征在于使细胞团附着于加工成目标形状的载体的表面，在诱导向软骨组织分化的条件下培养上述细胞团。
关节面是由细胞、细胞所产生的基质或它们的组合所形成的。
本发明的方法中，载体可以例举三磷酸钙制的作为载体，优选其表面具有微孔。细胞可以例举间充质干细胞或软骨细胞。上述培养例如在机体外且在生长因子或增生因子存在下进行。
附图简述
图1是表示只由细胞构成的球状关节面的图。
图2是基于兔股骨远侧部分的三维数据而设计的载体的图。
图3是表示使细胞团附着于载体的图。
图4是表示使细胞团再次附着于载体的图。
图5是表示兔股骨远侧关节面的全体成像的图。
实施发明的最佳方式以下详细说明本发明。
本发明提供细胞层具有必要足够的厚度、并可附着于任意的曲面上的来自自身细胞的软骨和人工关节的制作方法，其特征在于使细胞团附着于预先加工成目标形状的载体的表面，将其在可分化为软骨组织的条件下进行培养。由此，细胞团沿着载体的形状增生，细胞团之间融合，关节面得以再生，发挥人工关节的功能。其特征还在于通过添加生长因子或施加力学负荷，增进了胞外基质的生成，可以在机体外制备在强度方面理想的关节软骨。
1.细胞作为培养对象的细胞为干细胞(ES细胞、来自脐带血的细胞、未分化间充质干细胞等)等未分化细胞或其分化型细胞。特别优选未分化间充质干细胞。
成骨细胞、软骨细胞可容易地从未分化间充质干细胞诱导分化，因此也可以使用这些诱导分化的细胞(关节软骨细胞、骨细胞等)。还可以使用成熟间充质干细胞。
干细胞可以将多种细胞例如骨细胞和软骨细胞组合，在任意的部位混合进行培养。例如可以是下述的2层组合上层为只含有由软骨细胞得到的细胞团，下层是来自骨细胞的细胞团。为股骨时，可以是关节部分与软骨系细胞团粘附，骨的部分与骨系的细胞团粘附。这样的混合培养可以应用于包括关节面的所有骨的再生。
上述细胞可以通过Dexter法、磁珠法、细胞分选法等公知的方法从小鼠、兔、大鼠、豚鼠、狗、猪、山羊、牛等实验动物或患者的骨髓中采集。
细胞大致分为悬浮细胞和支持物依赖性细胞，血液系统或免疫系统的细胞属于前者，皮肤或骨骼等的细胞属于后者。皮肤或骨骼等的细胞在培养液中如果是悬浮状态则会死亡，要通过附着于玻璃等的培养皿等来增生。因此，在特氟隆(注册商标)中，细胞会汇集于一处，这样细胞寻求支持点，互相粘附，形成细胞团块即球状体。并且，球状体之间粘附、融合，形成大的形状。
如Molecular Biology of the cell第三版中的记载，已知通过酶处理等而分散开的细胞会自然凝聚，并已知该现象在从海胆等低等动物到哺乳类细胞中均可见。该自然凝聚是由含有钙黏着蛋白的被称为细胞黏着分子(CAM)的胞外黏着因子引起的，可认为是与生物发生初期形成四肢时发生的间充质干细胞凝聚几乎相同的现象在成熟个体中的再现(Gerisch，G.Curr.Top.Dev.Biol.14243-270.1980.；Hennings，H.Exp.Cell Res.143127-142.1983.；Moscona，A.A.；Hausman，R.E.Biological and biochemical studies on embryonic cell-cell recognition.InCell and Tissue Interactions，Society of General Physiologists Series(J.W.Lash，M.M.Burger，eds.)，Vol.32，173-185页.New YorkRavenPress，1977.；Roth，S.；Weston，J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 58974-980.1967.)。
近年来，有报告指出由间充质干细胞分化为软骨细胞时，显示经由钙黏着蛋白的细胞之间的粘附作为开关，可以起始胶原的表达(Yoon YM，J Cell Biochem 2002；87(3)342-59)。
本发明中，优选先制成球状体，然后再形成所需的形状。本发明中，将上述间充质干细胞等单层培养，然后转移至疏水性或细胞非粘附性的圆底多孔或U字型孔中孵育。结果，细胞自然凝聚，产生细胞团(细胞团块)。至产生细胞团所需的孵育时间为6-48小时，优选24-48小时。制备细胞团的方法除上述方法之外，还可采用向旋转的溶液中加入细胞悬浮液的旋转培养法、向试管中加入细胞悬浮液并用离心器沉淀的方法、精氨酸珠法等，并没有特别限定。从可大量处理均匀的细胞团考虑，向疏水性或细胞非粘附性的多孔中加入细胞悬浮液的方法效率高，因此优选。
通过形成上述球体状，细胞进入细胞周期的静止期，可认为此时蛋白质的生产增加。将细胞诱导至静止期后进行分化，将其称为“脱离细胞增生周期，转入细胞分化”。
2.细胞团的培养接着，使上述制备的细胞团附着于预先成型为任意形状的载体上并进行培养。细胞团的个数没有特别限定，可以任意设定。并且，如果需要，可以在附着后进一步追加细胞团，这也可与现有细胞团融合。
本发明中，使细胞团附着的载体可以根据人或兔的关节结构设计成任意的形状。为了获得耳廓、鼻等立体形状的目标物，可以预先设计基于三维数据的模具，制作载体。
“载体”是指细胞团可粘附的材料，构成人工关节的全部或部分，发挥细胞团支撑物的功能。该载体是机体适合性材料，优选可在机体内吸收、置换为自身的组织的材料。优选载体的表面具有微孔。所述载体的例子有三磷酸钙制的载体，也可采用高分子乳酸聚合物等生物体分解性的聚合物。
载体中无需附着细胞团的区域也可以用疏水性或细胞非粘附性的材料覆盖。
附着于载体上的细胞团之间基于与机体本身具备的愈伤大致相同的机理分别融合，结果形成具有目标大小和细胞结构的结构体。
本发明中，为了使细胞团附着于具有立体结构的载体上，需要使纵向(高度或厚度)加长。结果，细胞存在于距液面很深之处，气体交换效率降低。
因此，本发明中，将培养液调节至细胞团的一部分稍接触气相的程度(接触气相但不干燥的程度)的量。这样，培养液可从载体的微孔中出入，与细胞团接触。“微孔”是指细胞团不能通过、但培养液可通过的大小的孔(直径10-500μm)。微孔可以在载体本身的成型过程中产生，也可以用细针刺载体而形成。
培养液可以自由通过载体的微孔，因此可以总是向细胞供给培养液，足以进行细胞团分化、成熟、细胞团之间的融合、成熟。这种情况下，成熟是指细胞所产生的各种胶原或蛋白聚糖等胞外基质的增加，本来，机体内的细胞大多是被丰富的胞外基质包围的。
培养液的量只要可以使细胞增生、分化即可，没有特别限定，但每个细胞团必须有总量至少为0.5ml的培养液。
培养所使用的培养液有含10％FBS的DMEM培养基、无血清DMEM高糖培养液等。
培养在可诱导细胞团分化为软骨的条件下进行。由细胞团向软骨的分化诱导可在生长因子或细胞增生因子存在下培养。生长因子或细胞增生因子可以使用骨形成蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等。
上述因子根据增生的大小、胞外基质的产生量单独或适当组合，调节种类或量来添加。例如，由间充质干细胞分化成软骨细胞时要添加TGF-β，并且通过追加BMP、FGF、IGF等，更可以获得胶原丰富的软骨样组织。
这里，已知对细胞施加一些刺激，则通常mRNA量增加，之后蛋白质的产生增加。基于该点，本发明中，可改变培养条件(培养时间、其它条件)，调节细胞的成熟度。“成熟度”是指适合将细胞团移植到骨或关节等缺损部位的程度。关于该移植时期，可以探讨在(1)mRNA增加时移植；(2)在蛋白质(这种情况下是指胶原等胞外基质)增加的过程中移植；或者(3)蛋白质产生足够量(＝成熟)时移植。
如果是人工关节型，则最好在蛋白质充分产生时进行移植，培养期间优选1个月或以上。因此，使用在体外长期不变性的载体是很重要的。
通常，在诱导培养开始2周时RNA的产生达到峰值，之后可见胶原产生的上升，在5-6周达到稳定。
并且通过添加各种生长因子或增生因子，可以调节胞外基质的量。通过施加流体静力压或剪切弹力等机械刺激、超声波或冲击波等，可以使胞外基质增加。因此通过施加上述生长因子或流体静力压、超声波等机械刺激，可以将RNA的产生达到峰值的时间提前。
与前述同样，也可以使用BMP、FGF、TGF-β、IGF、PDGF、VEGF等作为生长因子或细胞增生因子。
这样，通过调节培养条件或培养期间，可以任意调节成熟度。
与以往的临时移植到裸小鼠的皮下、使再生组织成熟的方法不同，本发明的方法不需要动物。因此可以不受小鼠身体大小的限制，可得到任意的大小形状。
通过使用患者本人的未分化间充质干细胞，可以使用来自自身细胞的组织再生骨、软骨等。
以下通过实施例具体说明本发明。本发明并不受这些实施例的限定。
本实施例是模仿人股骨关节、股骨头的实施例。
单层培养来自人骨髓的间充质干细胞。最终，每个15cm皿上得到1.0×106个间充质干细胞。将该细胞用胰蛋白酶处理，制成细胞悬浮液，向Sumitomo Bakelite公司制造的球形孔板中分别接种1.0×105个细胞。然后在37℃、5％二氧化碳的条件下进行培养，第二天，每孔板可得到96个直径平均为0.5mm的细胞团。将该细胞团附着于加工成半球形的三磷酸钙上。然后添加0.01μg/ml的TGF-β，培养48小时，使细胞团分化成软骨。附着于该曲面的细胞团之间融合24-48小时左右，得到只由细胞构成的球状关节面(图1)。图1中，B为A的放大图。
本实施例是兔股骨远侧关节面的制作例。
对兔关节软骨切片进行胶原酶处理，进行所得软骨细胞的单层培养。最终每个15cm皿上得到1.0×106个软骨细胞。将该细胞用胰蛋白酶处理，制成细胞悬浮液，向Sumitomo Bakelite公司制造的球形孔板中分别接种1.0×105个细胞。然后在37℃、5％二氧化碳的条件下进行培养，第二天，每孔板可得到96个直径平均为0.5mm的细胞团。
另一方面，模仿兔股骨远侧关节面的形状，预先制作三维数据(图2)，制作该形状的三磷酸钙制载体。
将上述细胞团附着于三磷酸钙上。使该三磷酸钙的股骨远侧关节面上具有微孔。然后添加0.01μg/ml量的TGF-β，培养48小时，使细胞团分化成软骨。附着于该曲面的细胞团之间融合24-48小时左右，得到只含有细胞的关节面(图3)。图3中，稍显褐色的部分是附着有细胞团的部分。第二周(7天后)将320个细胞团再次附着于上述得到的关节面(图3)上。结果，新附着的细胞团与已附着的细胞团融合，形成了顺滑的曲面(图4A)。
再将320个细胞团附着于上述关节面，结果最终如图4B所示，可以制成目标关节。图4B中，褐色的部分是附着有细胞团的区域。周围的白色部分是用于遮盖的石蜡树脂，可使多余的部分不会附着有细胞团。
图5表示兔股骨远侧关节面的整体图像。
图5A是基于输入计算机的三维数据制作的含有三磷酸钙的兔股骨远侧关节面形状的载体(细胞附着之前)。
图5B、图5C是细胞团附着后第二天的总体视图。可知只在相当于软骨的部分形成了细胞层。图5D是细胞附着部分(图5B、C)的放大图。融合至几个细胞团的边界还可分清的程度。
产业实用性本发明提供软骨和人工关节的制作方法。本发明所提供的技术是通过大量制备细胞团块，将它们融合，这样，无需利用聚合物等载体，即可由来自自身的细胞单独制作关节软骨层。并且不需要移植到用于使关节成熟的动物体内，因此可不经由其它种动物即可制作任意形状的软骨层。
权利要求
1.软骨的制作方法，其特征在于使细胞团附着于加工成目标形状的载体的表面，在诱导分化为软骨组织的条件下培养上述细胞团。
2.人工关节的制作方法，其特征在于使细胞团附着于加工成目标关节形状的载体的表面，在诱导分化为软骨组织的条件下培养上述细胞团。
3.权利要求1或2的方法，其中关节面由细胞、细胞所产生的基质或它们的组合形成。
4.权利要求1或2的方法，其中载体具有微孔。
5.权利要求1或2的方法，其中细胞为间充质干细胞或软骨细胞。
6.权利要求1或2的方法，其中培养是在机体外且在生长因子或增生因子存在下进行的。
全文摘要
本发明涉及软骨的制作方法，其特征在于使细胞团附着于加工成目标形状的载体的表面，在可分化为软骨组织的条件下培养上述细胞团。还涉及人工关节的制作方法，其特征在于使细胞团附着于加工成目标关节形状的载体的表面，在可分化为软骨组织的条件下培养上述细胞团。
文档编号A61L27/38GK1859933SQ20048002842
公开日2006年11月8日 申请日期2004年8月2日 优先权日2003年7月31日
发明者岩本幸英, 中山功一, 田仲和宏, 松田秀一 申请人:岩本幸英, 中山功一