专利名称：用于治疗多发性硬化的包含透明质酸锌复合物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗多发性硬化的药物组合物，它包含作为活性成分的锌-透明质酸复合物，和药学可接受的载体和/或添加剂。制备所述药物组合物的方法及其治疗多发性硬化的治疗应用也包括在本发明范围内。
透明质酸(HA)是由重复的式(I)N-乙酰葡糖胺-葡糖醛酸二糖单元构成的葡糖胺聚糖型均聚物。
在HA中，单糖是β(1→3)连接的，而二糖单元是β(1→4)连接的，从而形成了具有交替β(1→3)和β(1→4)连接的线性多糖。
活体内的HA是以盐的形式存在的，它与阳离子、通常是钠离子成盐，它的分子量可从10-20kDa到数千kDa。HA的葡糖醛酸部分中的羧基和葡糖胺的N-乙酰基中的羰基和氨基的存在，以及存在的羟基促进了数个氢桥的形成。由于这些分子内氢键和经由HA和存在于生物体系中的水之间相互作用形成的氢桥，HA具有复杂的三维结构(C.L.Hew等人，Eur.J.Biochem.203，33-42.(1992)；Q.Liu等人，J.Am.Chem.Soc 118，12276-12286.(1996))。作为它优越的水结合能力的结果，即使相对较稀的HA水溶液也显示出了高粘度。在水溶液中，它的流变性高度取决于分子大小，例如，1000kDa分子大小的HA在1％水溶液中具有3000mPa的粘度，而4000kDa分子大小的HA在近似浓度的溶液中则具有400000mPa的粘度(H.B.Wik和O.WikRheology of Hialuronan，The Chemistry，Biology and MedicalApplications of Hialuronan and its Derivatives(T.C.Laurent编辑)，第25-32页。Portland出版社，伦敦，(1998))。因此，HA的两个最重要的物理特征是它的粘度和分子大小。
作为细胞外基质的主要成分，HA存在于全身的所有部位。某些器官和组织(结缔组织、皮肤、滑膜液、玻璃体液和血管壁)包含较多量的HA。长期以来认为，HA的生物学作用源于它的物理性质。例如，由于它的流变学特性，它可以为关节提供机械保护。由于它优越的水结合能力，HA可以通过它的渗透压和对流动提供阻力而控制水平衡。HA也在填满间隙方面发挥了重要作用，从而保护细胞免受不同的物理碰撞。最近的研究显示，HA和体内存在的某些大分子之间的相互作用可能与多个生理过程有关。这些大分子的例子是蛋白聚糖(聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和brevican等)，它们位于细胞外基质内，主要任务是占据细胞之间的空隙，和促进物质转运。参与与HA的相互作用的大分子可以是细胞内跨膜蛋白(CD44，RHAMM)，以及存在于细胞质内的受体蛋白(Clq、P-32和TSG-6等)。通过上述蛋白，HA在发生于细胞或身体水平的多个控制过程中发挥着重要作用。
水溶液中HA的分子大小和浓度——正如物理性质的情形——对它的生物效应具有重要影响。因此，根据分子大小，HA可对相同的细胞过程发挥正面或负面效应。当溶液HA浓度改变的时候，可以观察到相似的效应变化。当这两个参数被同时加以考虑的时候，明显可以获得想要的最佳效应(E.A.Balázs，The Chemistry，Biology andMedical Applications of Hialuronan and its Derivatives(T.C.Laurent编辑)，第185-204页.Portland出版社，伦敦(1998))。
由于HA参与上述生理过程，因此它可以被成功地用于多个治疗领域(创伤愈合、慢性炎症的治疗、眼外科)。
通过化学修饰结构，可以扩宽HA应用于人类治疗的范围——在上述那些治疗以外。在这方面，已知两个主要趋势。根据其中之一，通过使用脂肪族化合物(通常是二酰肼)形成水凝胶，在HA分子的两个远离位置之间建立了交联。交联引起了化学修饰HA粘弹性的增加，导致对体内出现的降解作用的更大抵抗。这对于进行治疗恢复滑膜液的类风湿性关节炎患者或手术后粘连患者是有利的。在另一个重要策略中，难以吸收的或要特异地通过以到达作用部位的活性剂(例如泰素、毛果芸香碱、胰岛素)与HA化学结合。在这些案例中，HA分别改善了与HA结合的活性剂的吸收，和帮助了活性剂特异到达目标位置。
EP 413016(Burger等人，1989)中描述了HA与锌和钴形成的复合物，在这两者中，锌-HA在组合物中用作活性剂，用于创伤的治疗。活性剂的其它研究显示，由于锌的存在，治疗应用的可能性可以被拓宽，因为相对于HA钠盐，锌复合物具有新的或更多的表达效应(J.Illes等人，Acta Pharm.Hung.72，15-24(2002))。其中，这些效应是锌-HA的增强的抗氧化活性(Gy.T.Balogh等人，Arch.Biochem.Biophys.410，76-82.(2003))；对由侵入细胞以增加量产生的组织损伤酶(基质金属蛋白酶，尤其是MMP-9)的抑制作用，而HA钠盐并没有显示出后一个效应(WO 00/53194，Illés等人1999)。在公布的WO98/48815国际专利申请中公开了锌-HA的胃保护作用(治疗消化性溃疡)，在公布的WO 98/10773国际专利申请中描述了锌-HA活性剂的抗微生物作用。
多发性硬化(MS)是中枢神经系统的慢性自身免疫疾病。该疾病最先出现在15到40岁之间，妇女的患病率加倍(Duquette等人，Can.J.Neurol.Sci.19，466-71.(1992))。该疾病的病理学是复杂的，在很多方面是不清楚的。尽管存在遗传易感性和免疫过程紊乱的明显的证据，环境因素的作用(例如某些病毒感染)是不确定的(Stipindonk等人，J.Neuroimmunol.105，46-57.(2000))。该疾病的临床形式变化很大，大多数病例仍然是复发-缓解型的。MS，-表现为感觉和运动器官以及自主系统紊乱的神经变性疾病-缓慢发展，逐渐破坏心理和感情能力，最终导致严重残疾。组织病理学显示，最初的炎症病灶集中点位于中枢神经系统，后来出现了轴突脱髓鞘作用和衰弱(Ewing等人，Immunol.Cell Biol.76，47-54.(1998))。导致大量神经损伤的髓鞘的降解和少突胶质细胞的衰退诱导了持久的临床症状(Fu等人，Brain121，103-113.(1998))。根据医学知识的现状，MS是不治之症。在日常实践中使用非特异性免疫抑制物质(皮质激素类、细胞生长抑制剂)或调节疾病过程的较特异的组合物(β-干扰素、醋酸格拉默)。然而，所述药物的应用受低效力和严重副作用的限制。
到目前为止，11种可以调节疾病过程的药物已经投放市场，24种组合物正在进行临床试验。两种最先进的组合物，即Copaxone(共聚物-1或醋酸格拉默)和Rebif或Avonex(干扰素β-1a)，以及干扰素β-1b只对该疾病的一种型(所谓的良性型、或复发-缓解型)有益——该疾病的其它型是原发和继发进行型以及恶性MS——(Otten等人，Comparsion of drug treatments for multiple sclerosis.OttawaCanadian Coordinating Office for Health Technology Assessment(1998)；Parkin等人，Health Technol.Assess.2(4)(1998))，它们只可以降低复发频率约20-30％(Khan等人，CNS Drugs 16(8)，563-578.(2002))。而且，这两种组合物具有多种不希望的副作用。关于包含干扰素β-1的组合物，可出现流感样症状、皮肤反应和局部疼痛(作为皮下给药的后果)，还可出现血象紊乱、增加的肝酶水平以及人格障碍(Eber等人，Lancet 352，1498-1504，(1998)；Jacobs等人，Mult.Scler.1，118-135.(1995))。关于共聚物-1，最独特的副作用也是皮肤反应和局部疼痛——作为皮下给药的后果，此外，还可出现脸潮红、胸腔内压力、心悸和呼吸困难(Johnson等人，Neurology 45，1268-1276，(1995)；Bornstein等人，N.Engl.J.Med.317，408-414.(1987))。虽然这些药物或多或少地减少了CNS中出现的炎症(在该疾病的原发型中)，但它们并不影响疾病的进程(Clegg，Health Technol.Assess.4(9)(2000))。
可用于多发性硬化临床前研究的唯一适当和广泛应用的模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(Mokhatarian等人，Nature 309，356-358.(1984)；Raine等人，Lab.Invest.31，369-380.(1974))，一种由CD4+T-淋巴细胞传递的中枢神经系统炎症性疾病。虽然与所研究的疾病相比，该模型的临床复杂性是适度的，然而，在针对MS的研究中它的使用是不可避免的。已经批准用于人类治疗的共聚物-1(Copaxone)和干扰素β-1的临床前试验，以及正在开发的新药的那些临床前试验都使用该模型进行(Popovic等人，Ann.Neurol.51，215-223.(2001)；Stanislaus等人，Neurosci.Lett.333，167-170.(2002))。在数种EAE模型中，慢性复发-缓解型(CR EAE)被证明最适合用于测试脱髓鞘作用(MS的特征)，和用于研究免疫过程。就疾病的临床过程来说，CR EAE最能与MS比较(Wekerle等人，Ann.Neurol.36，47-50.(1994))。这就是为何在我们的实验中研究小鼠由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)引起的CR EAE的原因(Amor等人，J.Immunol.153，4349-4356.(1994))。在20世纪60年代中叶，罗马尼亚研究者研究了透明质酸钠盐对EAE模型的效果。他们发现，肌内注射给药的Na-HA盐没有抑制、而是在某些病例中加速了兔EAE的发展(Szabó等人，(1966)Patol.Fiziol.Eksp.Ter.10(5)，41-44.；Miskolczy等人，(1965)Stud.Cercet.Neurol.10(5)，493-497.)。在用腹膜内给药或口服给药的不同锌盐进行的EAE模型中的研究都没有成功(Schiffer等人，(1996)J.Trace Elem.Exp.Med.9(1)，1-9.；Penkowa and Hidalgo(2000)Glia 32(3)，247-263.)。
在公布的WO 97/11710国际专利申请中公开了对免疫过程影响的试验；所述试验利用了具有不同分子量的Na-透明质酸、透明质酸及其轭合物。特别是，证明了小鼠T-细胞的增殖以及在移植物抗宿主反应中的抑制作用，其中使用了采自另一种小鼠供体的心肌组织移植物。虽然在说明书中提到了透明质酸和透明质酸钠盐分别在多发性硬化中的可能的应用，但是没有实验证据支持该假说。我们也测试了在透明质酸和钠之间形成的结合物(Na-透明质酸)以检查以上陈述，但其对专门用于MS的EAE模型没有发挥任何影响，如本说明书的表4中所示。
一方面考虑到现有技术药物具有有害的副作用和Na-HA盐无效，另一方面考虑到Zn-HA复合物在不同的治疗领域中给出了有希望的结果，我们的目标是使用最有可比性的EAE动物模型测试Zn-HA复合物对MS的效果。
我们已经惊奇地发现当Na-HA和Zn2+单独无效时，各种剂量不同分子量的Zn-HA却抑制了模型动物中诱导的EAE。在最佳条件下，该效果是显著的。
因此，本发明涉及用于治疗多发性硬化的药物组合物，其包含作为活性成分的锌-透明质酸复合物，优选具有800-1200kDa分子量的锌-透明质酸复合物，和药学可接受的载体和/或添加剂。
本发明的另一个目的是制备药物组合物的方法，其包括形成包含锌-透明质酸复合物活性剂和方便地用于药物的载体和/或添加剂的混合物，以获得该组合物。所述药物组合物优选是溶液，合适地是用于注射或输注的溶液。
本发明的再一个目的是锌-透明质酸复合物在制备治疗多发性硬化的药物中的应用。
本发明的又一个目的是治疗多发性硬化的方法，其中，将治疗有效量的锌-透明质酸复合物或包含它的组合物给予需要这种治疗的患者。所述治疗可以例如使用具有800-1200kDa分子量的锌-透明质酸复合物通过静脉给药进行。
在我们的实验中，不同剂量不同分子量的Zn-HA复合物对EAE模型皮下(s.c.)给药，对动物测试在已经诱导了EAE以后从第5天到第22天的抑制效应。也就是，研究四个不同平均分子量(10、50、200和800-1200kDa(最后的一个此后标记为HMW))以三个不同剂量(1、10和50mg/kg)的Zn-HA复合物，以测定哪个分子量和哪个剂量的Zn-HA对所选类型的EAE模型显示最佳效应。结果在下表1中显示。
表1
考虑到抑制程度和平均值偏差，10mg/kg剂量的HMW Zn-HA复合物是最有效的(41.3±7.1％抑制)。
接下来，研究HMW Zn-HA(10mg/kg的200μl生理盐水溶液，皮下)对临床症状的出现时间的可能影响。
使用两类处理对各组小鼠(n＝6-10只小鼠/组)进行试验(i)预防，其中，在接种MOG之后第5天到第22天进行给药，或在单个病例中，在那之后第9-10天到第28天进行给药(在表2和3中用#标记)；和(ii)治疗处理，其中，在已经诱导EAE之后第13天到第28天进行Zn-HA给药(在表2和3中用*标记)。
进行9次独立试验以确定有效性，结果在表2和3中显示。每日皮下给予小鼠10mg/kg HMW Zn-HA，在已经诱导EAE之后第10天到第28天和第5天到第22天分别获得其临床数据。从平均每日临床数据计算结果，得到平均概括临床数据(ASC)。
表2
表3
n＝参与实验的动物数载体生理盐水表2和3显示，通过10mg/kg皮下剂量HMW Zn-HA的给药，已经获得了对诱导的EAE的临床症状严重性的显著抑制(通过Mann-Whitney′s U检验，以p＜0.004获得了41.3±7.1％抑制和12.1ASC值)，临床症状的发生率也降低了22％(对于复合物是68.6％，对于对照是88％，p＜0.012，根据t-检验)。另一方面，处理时间(无论是预防或是治疗)对Zn-HA施用于EAE的效果没有引起显著改变。
在前面的实验中，我们发现，与HMW Zn-HA相反，包含与10mg/kgHMW Zn-HA相当量Zn2+(即0.8mg/kg Zn2+)的氯化锌对EAE模型没有显示显著的影响；Na-HA盐也没有，正如在本发明引言部分中所述及的(结果参见下表4)表4
n＝参与实验的动物数载体生理盐水本发明包含Zn-HA复合物活性剂的药物组合物可以任何传统途径给药，例如口服、胃肠外、通过口腔粘膜、舌下、通过鼻粘膜、直肠、经皮、静脉内(输注)或肌内。用于口服给药目的的药物组合物可为液体或固体形式，例如糖浆、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊和锭剂的形式。液体组合物，例如混悬剂或溶剂，在适当的液体载体中包含Zn-HA复合物活性成分，例如在水性溶剂如水、乙醇或甘油中，或在非水性溶剂如聚乙二醇或油中，或其混合物中。组合物还可包含助悬剂、防腐剂、调味剂或着色剂。当药物组合物被制成片剂形式时，可利用方便用于固体组合物制备的任何适当的载体。载体的例子是硬脂酸镁、淀粉、乳糖、蔗糖和纤维素等。
胶囊形式的固体组合物可用本身已知的方式制备。例如，包含活性剂连同已知载体的药丸可填装入硬明胶胶囊；或活性剂连同方便用于药物的任何载体(例如阿拉伯胶、纤维素、硅酸盐或油)的分散体或混悬液可以被包囊到软明胶中。
典型的胃肠外组合物是溶液或混悬液，它包含Zn-HA复合物和无菌水性载体，或胃肠外使用可接受的油例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油。根据另一种方式，所得溶液是冷冻干燥的，在使用前即刻再次溶于适当的溶剂。
通过鼻粘膜给药的组合物用本身已知的方式进行配制，制成气雾剂、滴剂、凝胶剂或粉剂。气雾剂组合物在药学可接受的水性或非水性溶剂中包含溶解的或细分散形式的活性成分，然后在无菌条件下填装入容器中。所述容器可以是装配有喷嘴的盒子或容器，可包含单次剂量或多次剂量。通过口腔粘膜给药或舌下吸收的组合物可以是片剂、药丸或锭剂的形式。所述组合物包含与载体，例如糖、阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶或甘油等混合的活性成分。
直肠使用的组合物用本身已知的方式制成栓剂形式，它除了活性成分以外还包含载体，通常是可可脂。局部使用的组合物是例如软膏剂、凝胶剂和膏剂。
为了研究目的，Zn-HA活性剂溶于生理盐水，以0.1-5mg/ml浓度使用。
此外，可以使用包含生理相容浓度的Zn-HA活性成分的、pH用缓冲液维持在生理相容值的任何水溶液。也可使用生理可接受的、其中活性成分适当溶解的其它非水溶剂。这样的溶剂的例子是乙醇、丙二醇、动物和植物油等，以及其含水混合物。这样的溶液可包含0.01-100wt％浓度范围的Zn-HA。
对活性成分效力没有直接影响的添加剂也是适用的，这样的添加剂的例子是缓冲液、防腐剂和帮助吸收的添加剂。水溶性防腐剂的例子是亚硫酸氢钠、硫酸氢钠、硫代硫酸钠、苯扎氯铵、三氯叔丁醇、硫柳汞(timerosal)、尼泊金甲酯、聚乙烯醇和苯乙醇等。水溶液中所述添加剂的浓度可以是0.001-5wt％。水溶性缓冲剂的例子是碳酸钠、硼酸钠、磷酸钠、醋酸钠和碳酸氢钠等。与活性成分的浓度相比，水溶液中这些添加剂的最大浓度可以是5wt％。
实施例1在表1到4中概括的研究中，用作EAE模型的每只小鼠各接受200μl皮下注射剂；注射剂包含活性成分或载体(0.9％氯化钠水溶液)。如下制备各种浓度的以上溶液，以获得以mg/kg体重表示的剂量对于1mg/kg剂量每1000ml溶液包含0.1g活性成分(Zn-HA复合物、Na-HA或Zn-Cl2)的溶液组合物；例如0.1g Zn-HA复合物，和0.9％氯化钠的蒸馏水溶液加至1000ml。
对于10mg/kg剂量每1000ml溶液包含1.0g活性成分(Zn-HA复合物、Na-HA或Zn-Cl2)的溶液组合物；例如1.0g Zn-HA复合物，和0.9％氯化钠的蒸馏水溶液加至1000ml。
对于50mg/kg剂量每1000ml溶液包含5.0g活性成分(Zn-HA复合物、Na-HA或Zn-Cl2)的溶液组合物；例如5.0g Zn-HA复合物，和0.9％氯化钠的蒸馏水溶液加至1000ml。
权利要求
1.用于治疗多发性硬化的药物组合物，它单独包含锌-透明质酸复合物，或连同药学可接受的载体和/或添加剂。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中，锌-透明质酸复合物具有800-1200kDa分子量。
3.根据权利要求1或2的药物组合物，是溶液形式。
4.根据权利要求3的药物组合物，是注射剂形式，优选用于皮下、肌内或静脉内给药。
5.药物组合物的制备方法，其包括形成包含锌-透明质酸复合物活性剂和方便地用于药物的载体和/或添加剂的混合物，以获得该组合物。
6.根据权利要求5的方法，其中，所制备的药物组合物是溶液。
7.根据权利要求5的方法，其中，所制备的药物组合物是注射剂或输液剂。
8.锌-透明质酸复合物或包含它连同药学可接受的载体和/或添加剂的药物组合物用于治疗多发性硬化的应用。
全文摘要
本发明涉及用于治疗多发性硬化的药物组合物，它包含作为活性成分的锌－透明质酸复合物，优选具有800－1200kDa分子量的锌－透明质酸复合物，和药学可接受的载体和/或添加剂。制备所述药物组合物的方法及其治疗多发性硬化的治疗应用也包括在本发明范围内。
文档编号A61P25/28GK1882352SQ200480034039
公开日2006年12月20日 申请日期2004年11月18日 优先权日2003年11月20日
发明者G·T·鲍洛格, J·伊莱斯, A·博罗什, G·福劳伊, A·塞凯伊 申请人:匈牙利吉瑞大药厂