专利名称：抗癌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌剂，尤其是涉及含有索烃化合物作为其活性成分的抗癌剂。
背景技术：
在日本，平均寿命与30年前相比延长了10岁以上，据认为其主要原因是由于开发出了大量的用于治疗脑卒中和心脏疾病的药物，其中脑卒中和心脏疾病以往一直是导致死亡的主要因素。然而，随着作为死亡的主要因素的脑卒中和心脏疾病的减少，癌症(恶性肿瘤)所致的死亡则逐年增加。在日本，癌症目前是死亡的主要原因，因此目前有大量的研究人员从事抗癌剂的研究。
由于大多数抗癌剂只有在被癌细胞吸收后才起作用，因此过去一直认为具有低分子量且结构稳定的药物易于经受体介导而被吸收，因而该类药物是有效的。
发明内容
然而，易于经受体介导而被吸收的抗癌剂也经常容易从细胞中排出，因此其具有在癌细胞中保留欠佳的缺点。一旦抗癌剂从癌细胞中排出，该细胞就对该抗癌剂产生抗性，所述抗癌剂就会失效。
因为易于经受体介导而被吸收的抗癌剂也容易进入到正常细胞中，因此难以进行局部治疗，而且容易产生副作用。
因此，本发明的一个目的是提供一种新抗癌剂，该抗癌剂难以从癌细胞中排出。
本发明的另一个目的是提供一种新的抗癌剂，该抗癌剂适于针对癌细胞进行局部治疗。
本发明人致力于将一种独特的高分子化合物作为不易被癌细胞排出的化合物，该类高分子化合物中不存在通过共价键进行键合的部分，其示例例如索烃或轮烷(见日本特开平No.11-80136号公报)。这种独特的高分子化合物具有相对较大的分子量且其分子易于变形，因此据信，这种聚合物一旦进入至癌细胞中就难以被排出。由于这种独特的高分子化合物实质上难以被细胞所吸收，因此如果对癌细胞局部施用该化合物，则可以显著减少该化合物对正常细胞的影响。
本发明人从这一观点出发进行了集中研究，结果发现一部分索烃化合物具有抗癌作用。
具体地，本发明抗癌剂的特征在于，该抗癌剂含有下述化学式(I)所示的索烃化合物作为活性成分。
这种索烃化合物是一类被称为酰胺型[2]索烃的化合物，该化合物的正式名称为3，11，18，26-四氮杂五环[26.2.2.213，16.15，9.120，24]三十六烷-5，7，9(36)，13，15，20，22，24(33)，28，30，34-十二烯-4，10，19，25-四酮(9Cl)，(十二烯dodecaene)。如上述化学式(I)所示，这种索烃化合物具有两个分子环连接成链状的结构，这两个分子环并未通过共价键相互键合。因此该分子的形状易于变化，并且使其比较难以通过受体的介导而引入至细胞中，但是已经知道该分子一旦被导入到癌细胞中，就会抑制癌细胞的增殖。
用于将所述索烃化合物导入至癌细胞中的一种优选方法为在癌细胞的细胞膜上开孔，通过所述孔将该化合物导入至细胞内。可以采用电穿孔法作为在细胞膜上开孔的方法。若采用电穿孔法，则可以局部地导入上述索烃化合物，因此可将导入至正常细胞中的该化合物的量保持为极低，由此可以减轻患者的副作用和其它痛苦。
目前，已经被本发明人确认具有抗癌作用的索烃化合物仅包括上述化学式(I)所示的索烃化合物。然而，考虑到索烃化合物一般都具有难以被引入至细胞内并且一旦进入细胞内就难以被排出的特性，因而预计除上述化学式(I)所示的索烃化合物以外，还存在其它具有抗癌作用的索烃化合物，并且还存在具有抗癌作用的轮烷化合物。
如上所述，通过本发明可以提供难以被癌细胞排出且适合于局部治疗的抗癌剂。
图1是显示样品1至4的评价结果的图。
具体实施例方式
下文将描述本发明的优选实施方式。
本发明的抗癌剂含有下述化学式(I)所示的索烃化合物作为活性成分。
对用于合成所述索烃化合物的方法没有特别的限制，可以通过使间苯二酰二氯与对亚二甲苯基二胺进行反应来合成。
将如此得到的索烃化合物溶于二甲亚砜(DMSO)等溶剂中，所得到的溶液可以用作抗癌剂。对于溶液中所述索烃的浓度没有特别的限制，但是优选为300μg/ml以上。这是因为，尽管溶液中的索烃浓度即使低于300μg/ml也可以获得抑制癌细胞增殖的效果，但是在浓度为300μg/ml以上时，其效果更加显著。
构成所述索烃化合物的两个分子环未通过共价键进行键合，因而其形状易于变化，使其相对难以通过受体的介导而引入细胞中。因此，为了将该索烃化合物导入至癌细胞内，优选采用电穿孔法在癌细胞的细胞膜上开孔。在这种情况中，电压波形优选为直流(DC)脉冲的电压波形，脉冲电压优选为约100V，并且脉冲周期优选约为10毫秒(msec)。
一旦将该索烃化合物通过电穿孔法等方法引入至癌细胞内，癌细胞就不能容易地将该化合物排出，因此该索烃化合物可以长期发挥作用，并且癌细胞也很难表现出对所述索烃化合物的抗性。
实施例以下将描述本发明的实施例。
细胞采样首先，将小鼠colon-26细胞(结肠癌细胞)附着在培养瓶的内壁。
然后放置培养瓶，使得附着有癌细胞的面处于下部，使不含血清的培养基(RPMI，8mL)流入至培养瓶内，连续培养癌细胞约一周的时间，使所述细胞处于充分附着的状态(汇合状态)。然后弃掉培养瓶中的培养基，进一步以不含血清的培养基(RPMI，5mL)冲洗培养瓶的内部。由此弃掉几乎所有没有附着至培养瓶内壁的细胞，只留下增殖并附着在内壁上的那些细胞。
然后将5mL含有胰蛋白酶的EDTA(乙二胺四乙酸)溶液加入至培养瓶中，使附着在内壁上的细胞与壁分离，接着将瓶中所有的内容物转移至培养管中。进一步以含有血清的培养基(RPMI，5mL)冲洗培养瓶的内部，以中和胰蛋白酶，并将瓶中所有的内容物转移至培养管中。
然后对所述培养管进行离心分离(1000rpm，5分钟)，接着弃掉上清液，以含有血清的培养基(RPMI，10mL)重悬。由此获得作为原试样的悬浮液。
电穿孔操作制备含有720μL前述悬浮液和80μL DMSO的合计为800μL的样品(样品1)，并将该样品放入具有一对电极的小池(cuvette)中。
制备另外的含有720μL前述悬浮液和80μL DMSO溶液(该DMSO溶液含有浓度为60μg/mL的化学式(I)所示的索烃)的合计为800μL的样品(样品2)，将该样品放在另一小池中。
制备另外的含有720μL前述悬浮液和80μL DMSO溶液(该DMSO溶液含有浓度为105μg/mL的化学式(I)所示的索烃)的合计为800μL的样品(样品3)，将该样品放在另一小池中。
制备另外的含有720μL前述悬浮液和80μL DMSO溶液(该DMSO溶液含有浓度为300μg/mL的化学式(I)所示的索烃)的合计为800μL的样品(样品4)，将该样品放在另一小池中。
然后将直流脉冲(脉冲电压104V～108V；脉冲周期9毫秒～11毫秒)施加到分别含有样品1至样品4的小池的电极上，进行电穿孔操作。
电穿孔操作结束后，分别将样品1至样品4转移至15mL的培养管内，该培养管中具有含血清培养基(RPMI，5mL)，对培养管中的内容物进行离心分离(1000rpm，5分钟)，然后弃掉上清液，以含血清培养基(RPMI，3mL)进行重悬。
样品评价用不含血清的培养基(RPMI，500μL)冲洗后，准备4块加入了含血清培养基(RPMI，500μL)的24孔(培养板)，将各40μL的已经进行了电穿孔操作的样品1～4转移到相应的24孔中，将细胞培养3天。
培养后，用台盼蓝染色法对各孔中的细胞进行染色，并在显微镜下进行细胞计数。其结果显示在图1中。如图1所示，培养后的细胞计数与索烃浓度呈反比，索烃浓度越高的样品培养后的细胞数越少，因而可以证实化学式(I)所示的索烃对癌细胞增殖的抑制作用。尤其是在索烃浓度为300μg/mL的样品4中，细胞计数减少到不含索烃的样品1的1/3，由此证实了其对癌细胞增殖的显著抑制作用。
毒性评价将化学式(I)所示的索烃悬浮在0.25％CMC(羧甲基纤维素)水溶液中，并将该溶液以20mg/kg的剂量经口施用至约25g的雄性小鼠(两只)。观察一周后，两只小鼠均仍存活，并确认在观察期间没有异常表现。所述小鼠还摄入与正常小鼠大致相同量的食物，并饮用与正常小鼠大致相同量的水。因而证实式(I)所示的索烃具有足够低的毒性。
权利要求
1.一种抗癌剂，该抗癌剂含有下述化学式(I)所示的索烃化合物作为活性成分
2.如权利要求1所述的抗癌剂，其中所述索烃化合物溶解在溶液中，并且所述索烃化合物在所述溶液中的浓度为300μg/mL以上。
全文摘要
本发明提供了一种抗癌剂，该抗癌剂难以被癌细胞排出，并适用于癌细胞的局部治疗。本发明的抗癌剂含有下述化学式(I)所示的索烃化合物作为活性成分。所述索烃化合物是一类被称为酰胺型[2]索烃的化合物，这种索烃化合物具有两个分子环彼此连接成链状的结构，这两个分子环并未通过共价键相互键合。因此所述分子的形状易于改变，使其比较难以通过受体的介导而引入至细胞中，但是该分子一旦被导入到癌细胞中，就会抑制癌细胞的增殖。
文档编号A61P35/00GK1953966SQ200480042350
公开日2007年4月25日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年3月8日
发明者小野信文 申请人:万斯德胜有限公司