专利名称：鸡干扰素γ及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域中功能基因的克隆、重组表达和纯化等技术，特别是鸡干扰素γ及其制备方法和用途。
背景技术：
目前，禽类养殖业已成为我国畜牧业养殖的第一大产业，养殖方式从传统的粗放经营向高密度、集约化养殖高速发展。但是伴随高成本、集约化的养殖的高速发展，病害问题不可避免的成为限制畜禽产业快速发展的第一大瓶颈和不可逾越的障碍。据不完全统计，我国每年因各类禽病引起的死亡率高达15-20％，经济损失达数十亿元。同时，我国加入WTO后，市场对畜禽产品的需求也逐渐从数量型转向质量型，对畜禽产品的质量要求达到了前所未有的程度，因禽类病害、药物残留、以及不符合卫生标准的禽类食品不仅影响我国禽类养殖产业发展、产品的出口创汇，甚至威胁到了人的身体健康。近来爆发的禽流感、非典型性新城疫以及其它有关病害，几乎使禽类养殖遭受灭顶之灾。
对禽类养殖危害最大的是传染病，尤其是病毒病，约占病害总量的70％。对禽类传染病的预防与治疗途径主要为疫苗和抗生素。但是，由于养殖环境恶劣，病原变异，药物的残留以及机体抵抗力下降等原因，使得传统的免疫和预防途径受到了巨大挑战。大部分抗生素类药物和传统的口服化药，由于药物残留问题，给人体健康带来的负面影响，已面临全面停药并即将退出历史舞台的危险；而传统的疫苗，由于它的高特异性，无法抵挡病原的变异和新型病害的出现给禽类养殖业带来新的冲击，禽类养殖即将面临孤立无援的窘境。
干扰素(Interferon)是一类由病毒诱导机体产生的，具有干扰病毒在感染和非感染组织中复制的一类小分子蛋白。干扰素分为I型和II型干扰素两大类，其中I型干扰素(IFNα和IFNβ)的主要作用为干扰病毒在体内复制，保护非感染组织免受病毒侵扰的能力。II型干扰素又称为干扰素γ(IFNγ)，它除可用于抑制病毒的自我复制外，更具有很强的免疫调节能力，包括活化B细胞，增强抗体的免疫保护力；刺激T细胞产生相关的细胞因子，调节机体的免疫进程；诱导巨噬细胞的吞噬和趋化能力；促进吞噬细胞脱颗粒，诱导呼吸代谢爆发以及修复损伤等多种功能，它对机体的免疫保护和对病毒病的防治效果明显优于I型干扰素。
但是，干扰素与其它细胞因子一样，在体内的表达量低，在体内的浓度约10-12mol/L；半衰期短，经病毒感染或诱导后约6h达到高峰，24h后浓度即显著下降。因此，采用生化分离的方法，由细胞或机体直接获得的干扰素成本极其昂贵，极大地限制了它的开发和临床上应用。
发明内容
本发明的目的在于采用基因重组技术，对鸡干扰素γ基因进行克隆，将获得的基因在体外进行重组与表达，实现鸡的IFNγ在体外的批量生产与纯化制备，以克服现有技术中干扰素生产成本昂贵的缺点，充分利用重组鸡干扰素γ为工业服务。
本发明的整体构思是鸡干扰素γ的cDNA序列为1 CTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGT1 L N L V Q L Q D D I D K L K A D F N S S61 CATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAG21 H S D V A D G G P I I V E K L K N W T E121 AGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAA41 R N E K R I I L S Q I V S M Y L E M L E181 AACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAA61 N T D K S K P H I K H I S E E L Y T L K241 AACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCCCCCG81 N N L P D G V K K V K D I M D L A K P P301 ATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAG
101 M N D L R I Q R K A A N E L F S I L Q K361 CTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGC121 L V D P P S F K R K R S Q S Q R R C N C以上序列为鸡干扰素γ的核苷酸序列和氨基酸序列，其中第1、3、5、7、9、11、13行为核苷酸序列，第2、4、6、8、10、12、14行为氨基酸序列。
鸡干扰素γ的制备方法由如下工艺步骤组成A、鸡重组干扰素的重组载体构建、转化与筛选，其中包括a、重组载体的构建根据鸡干扰素基因成熟肽的cDNA序列，利用一对特异性引物rCIFF 5’CAG CAT GCC TAA ATC TTG TTC AAC TTC 3’和rCIFR 5’CCA AGC TTA GCA ATT GCA TCT CCT CT 3’，在这对引物的两端引入两个不同的限制性内切酶位点如SphI和HindIII，在经聚肌胞(polyIC)或病毒感染的鸡内脏cDNA文库中进行PCR扩增反应，扩增产物经两个不同的限制性内切酶SphI和HindIII消化后，亚克隆到含6个组氨酸(6His)标记的表达质粒载体，表达质粒载体选用pQE系列(Qiagen)、pET系列或pMET系列；b、转化和筛选利用化学转化或电转化的方法，将a步骤中已构建的表达载体，转化或转染到原核或真核宿主体内，分别以载体引物和基因特异性引物进行PCR双向筛选；获得的阳性克隆进行质粒纯化，限制性内切酶消化验证；并经序列测定等鉴定后，所筛选得到的阳性克隆作为工程菌株；B、表达产物的诱导表达与分离纯化，其中采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或甲醇等试剂为诱导剂对b步骤中所获得的工程菌种进行诱导与表达，经裂解液裂解后用金属亲和层析和单克隆抗体纯化；C、终止和保存。
1鸡干扰素γ的用途是制备疫苗的免疫增强剂、病害防治药物、饲料添加剂、医药制剂。
本发明制备方法中具体工艺条件和工艺步骤是PCR扩增反应的反应液应包括如下单位体积的组份
cDNA 1-5ul10x PCR buffer2.5ul25mM Mg2+1.5ul2.5mM DNTP1ul10pM rCIFF/rCIFR 1ulTaq polymerase 5u/ul 0.2ul加水至25ulPCR扩增反应包括25-35个循环，每个循环包括cDNA变性，退火和延伸三个反应过程，其中cDNA变性的反应条件是反应温度92-98℃，孵育时间0.5-1分钟；退火降低温度，使引物与模板退火结合，反应温度为55-64℃、反应时间为0.5-1分钟；延伸当模板与引物退火后，提高温度使退火引物延模板方向延伸，使目的基因充分扩增，反应温度为68℃-72℃，反应时间为45秒-3分钟；终止和保存步骤中，终止是反应完成后，将新合成样品暂时保存于4-10℃的低温环境下；长期保存是将扩增产物保存于-20℃--80℃备用。
亚克隆是用限制性内切酶SphI和HindIII对获得的PCR产物或克隆的质粒及表达载体进行限制性消化，将消化后的含特异性限制性内切酶位点的基因扩增产物和表达载体经纯化后，用T4DNA连接酶连接，并转化到原核或真核表达载体中。
扩增产物经两个不同的限制性内切酶SphI和HindIII消化反应中，反应液包括如下组份PCR产物或质粒DNA 0.1ug-2ug10X buffer 2ul限制性内切酶Sph I1ul限制性内切酶Hind III 1ul将上述组份加水至20ul，于37℃孵育0.5-6小时。
连接是将消化后的目的基因和表达载体纯化后，按照1-8至8-1的比例混合，加入T4DNA连接酶，于温度为4-16℃、时间为0.5-24小时进行连接，连接反应中各组份的用量为2X含T4DNA连接酶快速连接缓冲液 5μl经消化后的表达载体150ng经消化后的目的基因片断50ng将上述组份加水至10μlB步骤中金属亲和层析选用Ni-NTA(Qiagen)金属亲和纯化胶体，单克隆抗体选用6His单克隆抗体或纯化后鸡干扰素的单克隆抗体。
本发明取得的实质性特点和显著的技术进步在于本发明将鸡干扰素γ基因克隆到原核表达载体，并在体外进行纯化，该技术包括重组表达载体的构建、表达产物的分离纯化等技术环节，能获得高纯度体外表达的鸡干扰素γ基因；采用该方法制备的产品可用于制备病害防治药物、免疫增强剂、饵料添加剂等，也可用于禽类免疫机制的理论研究。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述鸡干扰素γ的cDNA序列如前述。
鸡干扰素γ的制备方法由如下工艺步骤组成A、鸡重组干扰素的重组载体构建、转化与筛选，其中包括a、重组载体的构建根据鸡干扰素基因成熟肽的cDNA序列，利用一对特异性引物rCIFF 5’CAG CAT GCC TAA ATC TTG TTC AAC TTC 3’和rCIFR 5’CCA AGC TTA GCA ATT GCA TCT CCT CT 3’，在这对引物的两端引入两个不同的限制性内切酶位点SphI和HindIII，在经聚肌胞(polyIC)进行PCR扩增反应，扩增产物经两个不同的限制性内切酶SphI和HindIII消化后，亚克隆到含6个组氨酸(6His)标记的表达质粒载体，表达质粒载体选用pQE系列(Qiagen)、pET系列或pMET系列；b、转化和筛选利用传统氯化钙法，将a步骤中已构建的表达载体，转化到原核宿主体内，原核宿主选用大肠杆菌，分别以载体引物和基因特异性引物进行PCR双向筛选；获得的阳性克隆进行质粒纯化，限制性内切酶消化验证；并经序列测定等鉴定后，所筛选得到的阳性克隆作为工程菌株；B、表达产物的分离纯化，其中采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂对b步骤中所获得的工程菌种进行诱导与表达，经裂解液裂解后用金属亲和层析和单克隆抗体纯化；C、终止和保存。
其中，PCR扩增反应的反应液应包括如下单位体积的组份cDNA 1-5ul10x PCR buffer 2.5ul25mM Mg2+1.5ul2.5mM DNTP 1ul10pM rCIFF/rCIFR 1ulTaq polymerase 5u/ul 0.2ul加水至 25ulPCR扩增反应包括30个循环，每个循环包括cDNA变性，退火和延伸三个反应过程，其中cDNA变性的反应条件是反应温度94℃，孵育时间0.5分钟；退火降低温度，使引物与模板退火结合，反应温度为60℃、反应时间为30秒；延伸当模板与引物退火后，提高温度使退火引物延模板方向延伸，使目的基因充分扩增，反应温度为70℃，反应时间为60秒；终止和保存步骤中，终止是反应完成后，将新合成样品保存于4℃的低温环境下；保存是将扩增产物保存于-20℃备用。
亚克隆是用限制性内切酶SphI和HindIII对获得的PCR产物或克隆的质粒及表达载体进行限制性消化，将消化后的含特异性限制性内切酶位点的基因扩增产物和表达载体经纯化后，用T4DNA连接酶连接，并转化到原核表达载体中。
扩增产物经两个不同的限制性内切酶SphI和HindIII消化反应中，反应液包括如下组份PCR产物或质粒DNA 0.15ug10X buffer 2ul限制性内切酶Sph I1ul限制性内切酶Hind III 1ul将上述组份加水至20ul，于37℃孵育3小时进行消化。。
连接是将消化后的目的基因和表达载体纯化后，加入T4DNA连接酶，按照如下要求配制，于温度为16℃、连接过夜，连接反应中各组份的用量为含T4DNA连接酶快速连接缓冲液2X 5μl经消化后的表达载体 150ng经消化后的目的基因片断 50ng将上述组份加水至10μlB步骤中金属亲和层析选用Ni-NTA(Qiagen)金属亲和纯化胶体，单克隆抗体选用6His单克隆抗体或纯化后鸡干扰素的单克隆抗体。
鸡干扰素γ用于制备疫苗的免疫增强剂。
权利要求
1.鸡干扰素γ，其特征在于它的cDNA序列为1 CTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGT1 L N L V Q L Q D D I D K L K A D F N S S61 CATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAG21 H S D V A D G G P I I V E K L K N W T E121 AGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAA41 R N E K R I I L S Q I V S M Y L E M L E181 AACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAA61 N T D K S K P H I K H I S E E L Y T L K241 AACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCCCCCG81 N N L P D G V K K V K D I M D L A K P P301 ATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAG101 M N D L R I Q R K A A N E L F S I L Q K361 CTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGC121 L V D P P S F K R K R S Q S Q R R C N C以上序列为鸡干扰素γ的核苷酸序列和氨基酸序列，其中第1、3、5、7、9、11、13行为核苷酸序列，第2、4、6、8、10、12、14行为氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的鸡干扰素γ的制备方法，其特征在于它由如下工艺步骤组成A、鸡重组干扰素的重组载体构建、转化与筛选，其中包括a、重组载体的构建根据鸡干扰素基因成熟肽的cDNA序列，利用一对特异性引物，并在这对引物的两端引入两个不同的限制性内切酶位点如(SphI，KpnI，PstI，XhoI)和(KpnI，PstI，HindIII)，以下以SphI和HindIII为例进行说明，引物rCIFF 5’-CAG CAT GCC TAA ATC TTG TTC AAC TTC-3’和引物rCIFR 5’-CCA AGC TTA GCA ATT GCA TCT CCT CT-3’的两端分别含有SphI和HindIII限制性内切酶识别位点为G CAT GC和A AGC TT，在经聚肌胞(polyIC)或病毒感染的鸡内脏cDNA文库中进行PCR扩增反应，扩增产物经两个不同的限制性内切酶SphI和HindIII消化后，亚克隆到含6个组氨酸(6His)标记的表达质粒载体，表达质粒载体选用pQE系列(Qiagen)、pET系列或pMET系列等；b、转化和筛选利用化学转化或电转化的方法，将a步骤中已构建的原核或真核表达载体，转化或转染到原核或真核宿主体内，分别以载体引物和基因特异性引物进行PCR双向筛选；获得的阳性克隆进行质粒纯化，限制性内切酶消化验证；并经序列测定等鉴定后，所筛选得到的阳性克隆作为工程菌株；B、表达产物的分离纯化，其中采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或甲醇为诱导剂对b步骤中所获得的工程菌种进行诱导与表达，经裂解液裂解后用金属亲和层析和单克隆抗体纯化；C、终止和保存。
3.根据权利要求2所述的鸡干扰素γ的制备方法，其特征在于PCR扩增反应的反应液应包括如下单位体积的组份cDNA 1-5ul10×PCR buffer 2.5ul25mM Mg2+1.5ul2.5mM DNTP 1ul10pM rCIFF/rCIFR 各1ulTaq polymerase 5u/ul 0.2ul加水至 25ul
4.根据权利要求2或3所述的鸡干扰素γ的制备方法，其特征在于PCR扩增反应包括25-35个循环，每个循环包括cDNA变性，退火和延伸三个反应过程，其中cDNA变性的反应条件是反应温度92-98℃，孵育时间0.5-1分钟；退火降低温度，使引物与模板退火结合，反应温度为55-64℃、反应时间为0.5-1分钟；延伸当模板与引物退火后，提高温度使退火引物延模板方向延伸，使目的基因充分扩增，反应温度为68℃-72℃，反应时间为45秒-3分钟。
5.根据权利要求2所述的鸡干扰素γ的制备方法，其特征在于所述的终止和保存步骤中，终止是反应完成后，将新合成样品暂时保存于4-10℃的低温环境下；长期保存是将扩增产物保存于-20℃--80℃备用。
6.根据权利要求2所述的鸡干扰素γ的制备方法，其特征在于所述的亚克隆是用限制性内切酶SphI和HindIII对获得的PCR产物或克隆的质粒及表达载体进行限制性消化，将消化后的含特异性限制性内切酶位点的基因扩增产物和表达载体经纯化后，用T4 DNA连接酶连接，并转化到原核或真核表达载体中。
7.根据权利要求2或6所述的鸡干扰素γ的制备方法，其特征在于所述的扩增产物经两个特定的限制性内切酶SphI和HindIII消化反应中，反应液包括如下组份PCR产物或质粒DNA 0.1ug-2ug10X buffer 2ul限制性内切酶Sph I 1ul限制性内切酶Hind III 1ul将上述组份加水至20ul，于37℃孵育0.5-6小时。
8.根据权利要求6所述的鸡干扰素γ的制备方法，其特征在于所述的连接是将消化后的目的基因和表达载体纯化后，按照1-8∶1-8的比例混合，加T4 DNA连接酶，于温度为4-16℃、时间为0.5-24小时进行连接，连接反应中各组份的用量为2X含T4 DNA连接酶快速连接缓冲液 5μl经消化后的表达载体 150ng经消化后的目的基因片断 50ng将上述组份加水至10μl
9.根据权利要求2所述的鸡干扰素γ的制备方法，其特征在于所述的B步骤中金属亲和层析选用Ni-NTA(Qiagen)金属亲和纯化胶体，单克隆抗体选用6His单克隆抗体或纯化后鸡干扰素的单克隆抗体。
10.根据权利要求1所述的鸡干扰素γ的用途，其特征在于它用于制备疫苗的免疫增强剂、病害防治药物、饲料添加剂、医药制剂等。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域中功能基因的克隆、重组表达和纯化等技术，特别是鸡干扰素γ及其制备方法和用途。它采用鸡重组干扰素的重组载体构建与筛选、表达产物的分离纯化等制备方法制备鸡干扰素γ。本发明解决了现有技术存在的鸡干扰素γ生产成本昂贵的问题，具有采用该方法能够获得高纯度体外表达的鸡干扰素γ基因，所制备的产品可用于制备病害防治药物、免疫增强剂、饵料添加剂等，也可用于禽类免疫机制的理论研究。
文档编号A61K38/21GK1752210SQ20051001270
公开日2006年3月29日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者蔡中华, 邢克智, 高春萍 申请人:蔡中华, 邢克智, 高春萍