治疗肥胖、胰岛素相关的疾病和高胆固醇血症的方法和组合物的制作方法

专利名称：：治疗肥胖、胰岛素相关的疾病和高胆固醇血症的方法和组合物的制作方法相关申请的交叉参考本申请请求享有2004年7月29日提交的临时专利申请系列第60/591,806号的优先权。政府权利本申请由USDA补助金第2003-35504-13618号资助。美国政府对本发明拥有一定权益。
背景技术：
：(1)发明领域本发明涉及胰岛素相关的疾病、肥胖、糖尿病、高血糖症、脂质紊乱、高脂血症、或低HDL、高胆固醇血症、高甘油酯血症、血脂异常和动脉粥样硬化的治疗。本发明尤其涉及使用花色素苷、花色素、乌索酸和桦木酸的方法。本发明尤其涉及梾木属(cornusspp.)果实提取物和包含这些化合物的其它果实例如樱桃和浆果提取物或其混合物来增加体内细胞胰岛素生产。本发明还特别涉及用于使体内胰岛素生成增加的方法中的组合物在相关疾病中的治疗。本发明还特别涉及用于预防肥胖和降低胆固醇和体重的组合物。(2)相关技术的说明胰岛素的功能是通过抑制肝脏排出葡萄糖或通过刺激葡萄糖吸收和代谢而维持正常的血糖水平(Ross，S.A.；Gulve，E.A.；Wang，M.ChemistryandBiochemistryofdiabetes.Chem.Rev.2004，104，1255-1282)。在目标组织中胰岛素释放不足或胰岛素作用损失导致异常的葡萄糖和脂质代谢。这引起血液中葡萄糖水平升高，后者是糖尿病的标志(Jovanovic，L.；Gondos，B.Type-2diabetesTheepidemicofnewmillennium.Ann.Clin.Lab.Sci.1999，29，33-42)。存在两种类型的糖尿病，1型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和2型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病)。1型糖尿病由自身免疫破坏或分泌胰岛素的胰腺β-细胞的抑制引起，这导致胰岛素不足。2型糖尿病更加流行，它是由β-细胞不能分泌足量胰岛素来克服由遗传和环境因素造成的胰岛素抗性而引起的(Henquin，J.C.Triggeringandamplifyingpathwaysofregulationofinsulinsecretionbyglucose.Diabetes2000，49，1751-1760)。胰岛素抗性是一种病症，其中，胰岛素不足以刺激骨骼肌和脂肪中的葡萄糖转换和不足以抑制肝葡萄糖生成。阻止β-细胞分泌足量胰岛素来克服外周胰岛素抗性中所包含的机制还有待确定。口服降血糖药直接刺激β-细胞释放胰岛素(例如授予Jones等人的美国专利第6,852,738号所举例说明的磺酰脲类药物，该专利引入本文以作参考)，然而，已经显示2型糖尿病患者胰岛的胰岛素分泌可以被充分提高以克服外周胰岛素抗性和使血糖水平正常化。使用磺酰脲类药物的一个缺点是它们不能控制正常的血糖水平(Pfeiffer，A.F.H.OralhypoglycemicagentsSulfonylureasandmeglitinides.InB.J.Goldstein，D.Müller-Wieland(编辑)，TextbookofType-2Diabetes.MartinDunitzLtd.，London，2003，第77-85页)。这些药物还不利地影响β-细胞分泌胰岛素的能力和导致体重增加(Pfeiffer，A.F.H.OralhypoglycemicagentsSulfonylureasandmeglitinides.InB.J.Goldstein，D.Müller-Wieland编辑)，TextbookofType-2Diabetes.MartinDunitzLtd.，London，2003，第77-85页)。因此，除了传统的处方药物疗法以外，可以调节血糖水平或诱导胰腺β-细胞生成胰岛素的饮食组成起着作用。报导表明，食用水果和蔬菜，尤其是富含多酚的水果和蔬菜，降低了2型糖尿病的发生率(Anderson，R.A.；Polansky，M.M.，TeaEnhancedInsulinActivity.J.Agric.FoodChem.2002，50，7182-7186；Anderson，R.A.；Broadhurst，C.L.；Polansky，M.M.；Schmidt，W.F.；Khan，A.；Flanagan，V.P.；Schoene，N.W.；Graves，D.J.IsolationandCharacterizationofPolyphenolType-APolymersfromCinnamonwithInsulin-likeBiologicalActivity.J.Agric.FoodChem.2004，52，65-70；Landrault，N.；Poucheret，P.；Azay，J.；Krosniak，M.；Gasc，F.；Jenin，C.；Cros，G.；Teissedre，P.EffectofaPolyphenols-EnrichedChardonnayWhiteWineinDiabeticRats.J.Agric.FoodChem.2003，51，311-318)。而且，众所周知的是，食用抗氧化剂防止胰腺β-细胞产生葡萄糖诱导的氧化应力。水果、蔬菜和诸如葡萄酒、苹果酒和茶等处理过的食物产品富含花色素苷。然而却不知道其降低或预防糖尿病的能力。而且，花色素苷是无毒的，且据报导具有抗氧化、抗炎和抗癌活性(Wang，H.，Nair，M.G.，Strasburg，G.M.，Chang，Y.，Booren，A.M.Gray，J.I.，andDeWitt，D.L.(1999)Antioxidantandanti-inflammatoryactivitiesofanthocyaninsandtheiraglycon，cyanidin，fromtartcherries.J.Nat.Prod.62，294-296；Tall，J.M.，Seeram，N.P.，Zhao，C，Nair，M.G.，Meyer，R.A.，andRaja，S.N.(2004)Tartcherryanthocyaninssuppressinflammation-inducedpainbehaviorinrat.Behav.BrainRes.153，181-188；Kang，S.，Seeram，N.P.，Nair，M.G.，andBourquin，L.D.(2003)TartcherryanthocyaninsinhibittumordevelopmentinApcMinmiceandreduceproliferationofhumancoloncancercells.Cane.Lett.194，13-19；Zhang，Y.，Vareed，S.K.，andNair，M.G.(2005)Humantumorcellgrowthinhibitionbynontoxicanthocyanins，thepigmentsinfruitsandvegetables.LifeSci.76，1465-1472.)。蔬菜、水果和草药中存在的生物活性天然产物已经在预防和治疗人退行性病症如癌症、糖尿病和心血管疾病中使人们产生了相当大的兴趣。例如，坚果、所有的谷物、水果和蔬菜是诸如多酚、萜类化合物和色素抗氧化剂的丰富来源，这些化合物与改善一些疾病症状有关。类似地，已知大蒜、大豆、卷心菜、姜、甘草和伞形花科蔬菜中存在的植物化学物质具有抗癌活性(Rui，H.L.(2004)Potentialsynergyofphytochemicalsincancerpreventionmechanismofaction.J.Nutr.134，3479S-3485S)。而且据报导茶叶中存在的多酚具有抗糖尿病性质(Vanessa，C.，和Gary，W.(2004)Areviewofthehealtheffectsofgreenteacatechinsinin-vivoanimalmodels.J.Nutr.134，3431S-3440S和MaryE.WW.，-Xiaohui，L.W.，Brian，K.L.，RobertK.H.，Masao，N.，andDarylK.G.(2002)Epigallocatechingallate，aconstituentofgreentea，represseshepaticglucoseproduction.J.Biol.Chem.277，34933-34940.)。低脂肪和富含抗氧化剂的饮食的消耗降低了患肥胖和胰岛素抗性的风险(Blakely，S.；Herbert，A.；Collins，M.；Jenkins，M.；Mitchell，G.；Grnndel，E.；O′Neill，K.R.；Khachik，F.Luteininteractswithascorbicacidmorefrequentlythanwithα-tocopheroltoalterbiomarkersofoxidativestressinfemaleZuckerobeserats.J.Nutr.2003，133，2838-2844)。花色素苷属于抗氧化剂多酚类，存在于多种食物和饮料中。花色素苷的消耗与多种退行性疾病如动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症和糖尿病的风险降低有关(Jayaprakasam，B.；Strasburg，G.A.；Nair，M.G.PotentlipidperoxidationinhibitorsfromWithaniasomnifera.Tetrahedron2004，60，3109-3121)。这些化合物是公知的自由基清除剂，且据报导是有效的化学预防剂(Duthie，G.G.；Duthie，S.J.；Kyle，J.A.M.Plantpolyphenolsincancerandheartdiseaseimplicationsasnutritionalantioxidants.Nutr.Res.Rev.2000，13，79-106)。例如，草莓、樱桃和红葡萄酒的消耗增加了血清的抗氧化容量(Kang，S.Y.；Seeram，N.P.；Nair，M.G.；Bourquin，L.D.TartcherryanthocyaninsinhibittumordevelopmentinApcMinmiceandreduceproliferationofhumancoloncancercells.Canc.Lett.2003，194，13-19；VanVelden，D.P.；Mansvelt，E.P.G.；Fourie，E.；Rossouw，M.；Marais，A.D.Thecardioprotectiveeffectofwineonhumanbloodchemistry.Ann.NewYorkAcad.Sci.2002，957，337-340；Wang，H.；Nair，M.G.；Strasburg，G.M.；Chang，Y.C；Booren，A.M.；Gray，I.J.；DeWitt，D.L.Antioxidantandanti-inflammatoryactivitiesofanthoeyaninsandtheiraglycone，cyanidin，fromtartcherries.J.Nat.Prod.1999，62，294-296)。最近的研究证明了花色素苷、花青素3-葡萄糖苷降低了小鼠高脂饮食诱导的肥胖(Espin，J.C；Soler-Rivas，C；Wichers，H.J.；Garcia-Viguera，C.anthocyanin-basednaturalcolorants.Anewsourceofantiradicalactivityforfoodstugg.J.Agri.FoodChem.2000，48，1588-1592)。因此，由于食物中存在的天然色素的安全性、营养和治疗价值而引起了消费者的注意(Millspaugh，C.F.InAmericanMedicinalPlants；DoverPublicationsNewYork，1974；第282页)。由于广泛消耗花色素苷，因此对这些化合物的另外的生物学活性很感兴趣。几项研究提出，富含脂肪和含纤维低的饮食引起肥胖。肥胖改变了脂质代谢，这接着引起胰岛素抗性。在肥胖条件下，脂肪组织产生了大量的游离脂肪酸(FFA)。然后FFA抑制葡萄糖的吸收、糖原合成和葡萄糖氧化(Saltiel，A.R.andKahn，C.R.(2001)Insulinsignalingandtheregulationofglucoseandlipidmetabolism.Nature414，799-806)，并导致高血糖症和2型糖尿病。2型糖尿病是越来越普通的疾病，世界范围内大约有1.5到3亿人患有2型糖尿病且预期在今后的25年里会翻一番(King，H.，Aubert，R.E.，andHerman，W.H.(1998)Globalburdenofdiabetes，1995-2025prevalence，numericalestimates，andprojections.DiabetesCare21，1414-1431)。近来，很多注意力集中在了可预防饮食诱导的身体脂肪积累和有可能降低糖尿病和心脏病风险的食物上。有多个生化过程参与控制食物摄取。胰高血糖素样肽-1和-2(GLP-1&-2)在内分泌细胞中合成，且响应营养素摄入而释放到血液中。GLP-2通过扩张粘膜上皮而增加营养素吸收(Ahren，B.(1998)Glucagon-likepeptide-1(GLP-I)aguthormoneofpotentialinterestinthetreatmentofdiabetes.BioEssays20，642-651andDrucker，D.J.(2002)Biologicalactionandtherapeuticpotentialofglucagonslikepeptides.Gastroenterology122，531-544)。GLP-1主要在消化道L-细胞中表达，它通过肝脏抑制胰高血糖素分泌和胃排空，这依次抑制了食物摄取，并刺激胰岛素生物合成和胰腺β-细胞分泌(Ahren，B.(1998)Glucagon-likepeptide-1(GLP-1)aguthormoneofpotentialinterestinthetreatmentofdiabetes.BioEssays20，642-651andDrucker，D.J.(2002)Biologicalactionandtherapeuticpotentialofglucagonslikepeptides.Gastroenterology122，531-544)。胰腺β-细胞的主要功能是响应营养素、激素和神经刺激分泌生物活性胰岛素以维持机体的正常生理学葡萄糖浓度(Rohit，N.K.(2004)Theisletβ-cell.TheInt.J.Biochem.CellBiol.36，365-371)。响应升高的血糖水平而发生的胰腺β-细胞功能的进行性损失引起了胰岛素缺乏，这导致了2型糖尿病。胰岛素抗性、肝脏衰竭、肌肉和脂肪组织响应生理量的胰岛素，也引起2型糖尿病(Pinget，M.，andBoullu-Sanchis，S.(2002)Physiologicalbasisofinsulinsecretionabnormalities.Diabet.Met.28(6，Suppl.)，4S21-4S32)。胰岛素缺乏和抗性都导致健康问题例如高脂血症、动脉粥样硬化和高血压(Saltiel，A.R.和Kahn，C.R.(2001)Insulinsignalingandtheregulationofglucoseandlipidmetabolism.Nature414，799-806)，且经常与受损的碳水化物和脂质代谢相关(Brosche，T.(2001)Plasmalogenlevelsinserumfrompatientswithimpairedcarbohydrateorlipidmetabolismandinelderlysubjectswithnormalmetabolicvalues.Arch.Gerontol.Geriatrics32，283-294)。这些控制系统以复杂的途径相互作用，任何由遗传、环境和社会因素引起的改变都会导致肥胖和糖尿病(Ross，S.A.，Gulve，E.A.，andWang，M.(2004)Chemistryandbiochemistryoftype2diabetes.Chem.Rev.104，1255-1282)。然而，一些由社会和环境因素引起的并发症可通过练习和正确的饮食而延迟或预防(Christian，K.R.，andBarnard，R.J.(2005)Effectsofexerciseanddietonchronicdisease.J.Appl.Physiol.98，3-30)。流行病学研究显示，富含水果和蔬菜的饮食降低了癌症、心血管疾病、糖尿病、内障和炎性疾病的发生率(WorldCancerResearchFund/AmericanInstituteforCancerResearch(1997)Food，nutritionandthepreventionofcancerAglobalperspective1997，AmericanInstituteforCancerResearchWashington，DC；U.S.DepartmentofAgriculture，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices(1995)NutritionandYourHealthDietaryGuidelinesforAmericans1995，U.S.GovernmentPrintingOfficeWashington，DC；AmericanHeartAssociation(1996)DietaryguidelinesforhealthyAmericanadultsAstatementforhealthprofessionalsfromthenutritioncommittee，AmericanHeartAssociation.Circulation94，1795-1800；AmericanCancerSociety(1996)Guidelinesondiet，nutrition，andcancerpreventionreducingtheriskofcancerwithhealthyfoodchoicesandphysicalactivity.CancerJ.Clin.46，325-341；WorldHealthOrganization(1990)Diet，NutritionandthepreventionofchronicdiseasesReportofaWHOstudygroup，TechnicalReportSeries797，WHOGeneva，Switzerland；Willett，W.C.(1999)Goalsfornutritionintheyear2000.CancerJ.Clin.49，331-352andWillett，W.C.(1998)NutritionalEpidemiology1998，PressOxfordUniversity，NewYork，NY，USA)。近来，增加了对源自公认为安全的(GRAS)植物、水果和蔬菜的天然降血糖化合物的兴趣，因为它们被认为是低毒性的，具有更少的副作用。食物中存在的这些生物活性化合物可以改变基因表达和细胞活动(Milner，J.A.(2004)Moleculartargetsforbioactivefoodcomponents.J.Nutr.134，2492S-2498S)，导致了蛋白质和它们的功能的改变。尽管多项研究提示，水果和蔬菜中存在的植物化学物质对改善不利的健康风险有益，但是还没有完全了解它们未加证明的保护作用。梾木属果实是用于抗糖尿病的传统处方中药，例如″Hachimi-Gan″(Yamahara，J.；Mibu，H.；Sawada，T.；Fujimura，H.；Takino，S.；Yoshikawa，M.；Kitagawa，I.Biologicallyactiveprinciplesofcrudedrugs.Anti-diabeticprinciplesofcornifructusinexperimentaldiabetesinducedbystreptozotocin.YakugakuZasshi1981，101，86-90)。我们近来报导了梾木属果实中的花色素苷的定量(Seeram，N.P.；Schutzki，R.；Chandra，A.；Nair，M.G.Characterization，Quantification，andBioactivitiesofAnthocyaninsinCornusSpecies.J.Agri.FoodChem.2002，50，2519-2523)。山茱萸物种的果实是花色素苷的丰富来源。欧亚山茱萸(CornusmasL.)的果实也称作欧亚山茱萸，在欧洲用于制备饮料(Kim，D.K.；Kwak，J.H.AFuranderivativefromCornusofficinalis.Arch.Pharm.Res.1998，21，787-789)。在传统药物中，山茱萸(Cornusofficinalis)果实的止痛和利尿活性是已知的(Yamahara，J.；Mibu，H.；Sawada，T.；Fujimura，H.；Takino，S.；Yoshikawa，M.；Kitagawa，I.Biologicallyactiveprinciplesofcrudedrugs.Anti-diabeticprinciplesofcornifructusinexperimentaldiabetesinducedbystreptozotocin.YakugakuZasshi1981，101，86-90)。山茱萸果实也是亚洲国家中的几种抗糖尿病草药制剂的主要成分之一(Seeram，N.P.；Schutzki，R.；Chandra，A.；Nair，M.G.Characterization，Quantification，andBioactivitiesofAnthocyaninsinCornusSpecies.J.Agri.FoodChem.2002，50，2519-2523)。对欧亚山茱萸和山茱萸的果实的早期研究显示它们都含有高水平的花色素苷(Beckwith，A.G.；Zhang，Y.；Seeram，N.P.；Cameron，A.C；Nair，M.G.RelationshipofLightQuantityandAnthocyaninProductioninPennisetumsetaceumCvs.RubrumandRedRidingHood.J.Agric.FoodChem.2004，52，456-461)。欧亚山茱萸植物的果实产率类似于酸樱桃(P.cerasus)。其属于山茱萸科家族，是产于欧洲和西亚的落叶树(Millspaugh，C.F.AmericanMedicinalPlants；DoverPublicationsNewYork，1974；第282页)。该物种的果实已经在土耳其用来制备一些调合物。早期研究证明山茱萸的乙醇提取物增加了非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)大鼠的GLUT4mRNA(一种葡萄糖转运子)表达(Qian，D.，Zhu，Y.，andZhu，Q.(2001)EffectofalcoholextractofCornusofficinalisSieb.etZucconGLUT4expressioninskeletalmuscleintype2(non-insulin-dependent)diabetesrats.ZhongguoZhongyaoZazhi26，859-862)。山茱萸果实在中药中是公知的，该物种的果实在中国用于治疗糖尿病。然而，还没有表征出起抗糖尿病活性作用的活性化合物。对生长在密西根州的数种株木属果实的早期研究显示，欧亚山茱萸包含高水平的花色素苷(Seeram，N.P.，Schutzki，R.，Chandra，A.，andNair，M.G.(2002)Characterization，quantification，andbioactivitiesofanthocyaninsinCornusspecies.J.Agric.FoodChem.50，2519-2523)。发明目的本发明的目的是提供在治疗与胰岛素生成、高胆固醇和体重相关的病症中有用的组合物和方法。特别地，本发明的目的是提供增加体内胰岛素生成的方法和组合物。进一步的目的在下列说明书和附图中将变得显而易见。发明概述本发明涉及在有此治疗需求的哺乳动物患者中控制肥胖的方法，包括给该患者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含选自花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物及其混合物。本发明特别涉及源自株木属和其它水果的补充剂，其基本上不含水果中天然存在的酸和糖。本发明还涉及治疗人类糖尿病患者肥胖的方法，且该患者正使用处方药治疗糖尿病，包括给该患者施用有效量的包含选自花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物和其混合物的组合物和该处方药物。优选地，该组合物是补充剂或药物制剂。优选的花色素苷、花色素、乌索酸或桦木酸分离自水果、蔬菜和花。优选的花色素苷选自花青素-3-糖苷(cyanidin-3-glycoside)、飞燕草素-3-糖苷(delphinidin-3-glycoside)、花葵素-3-糖苷(pelargonidin-3-glycoside)和其混合物。“糖苷”是任何包含糖分子(糖)，尤其是植物中的任何这样天然产物，可逆地，通过水解分裂成糖和非糖成分(苷元)的化合物，特别用于包含糖的命名，如葡萄糖苷(葡萄糖)、戊糖苷(戊糖)，果糖苷(果糖)等。优选的花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自欧亚山茱萸。优选的花色素、或花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸或其混合物是经分离和纯化的。本发明还涉及治疗有此治疗需求的哺乳动物患者糖尿病以控制糖尿病的方法，其包括给予所述患者治疗有效量的包括选自花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物。优选的花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自水果、蔬菜和花。优选的花色素苷选自花青素-3-糖苷、飞燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷和其混合物。优选的花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自欧亚山茱萸。然而，花色素苷可以源自其它水果例如樱桃和浆果。本发明还涉及治疗或控制有此治疗需求的哺乳动物患者高血糖症的方法，包括给予治疗有效量的包括选自花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物，尤其是作为补充剂。优选的花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自水果、蔬菜和花。优选的花色素苷选自花青素-3-糖苷、飞燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷和其混合物。优选的花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自欧亚山茱萸。优选花色素、花色素苷、乌索酸、桦木酸或其混合物经分离和纯化。本发明还涉及用于治疗作为疾病的肥胖、糖尿病或高血糖症的组合物，其中包含用于在一段时期内治疗该疾病的日剂量单位的花色素苷、花色素、乌索酸或桦木酸或其混合物；和药学载体。最优选的花色素苷选自花青素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、花葵素-3-葡萄糖苷和其混合物。优选的花色素苷、花色素、乌索酸或桦木酸分离自水果、蔬菜或花。优选的花色素苷、乌索酸、或桦木酸分离自欧亚山茱萸。本发明还涉及用于治疗或控制有此需求的哺乳动物患者脂质紊乱、高脂血症或低HDL的方法，其包括给予所述患者治疗有效量的包括选自花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物，尤其是作为补充剂。本发明还涉及用于治疗或控制有此需求的哺乳动物患者高胆固醇血症的方法，其包括给予所述患者治疗有效量的包括选自分离的花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物，尤其是作为补充剂。本发明还涉及用于治疗或控制有此治疗需求的哺乳动物患者高甘油酯血症的方法，其包括给予所述患者治疗有效量的包括选自分离的花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物，尤其是作为补充剂。本发明还涉及用于治疗或控制有此治疗需求的哺乳动物患者血脂异常和/或低HDL胆固醇的方法，其包括给予所述患者治疗有效量的包括选自分离的花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物，尤其是作为补充剂。本发明还涉及用于治疗或控制有此治疗需求的哺乳动物患者动脉粥样硬化的方法，其包括给予所述患者治疗有效量的包括选自分离的花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物，尤其是作为补充剂。最优选的化合物来自欧亚山茱萸。优选的花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸或其混合物是从该水果或其它水果中分离和纯化的。有治疗活性的本发明化合物的代谢产物都在要求保护的母体化合物的范围之内。前药，是给予患者时或者给予患者后转变为所要求化合物的化合物，也在所要求保护的活性化合物的范围之内。给药和剂量范围任何合适的给药途径都可用于给哺乳动物，尤其是人，提供有效量的本发明化合物。例如，可使用口服、直肠、局部、肠胃外、眼睛、肺、鼻腔等途径给药。剂型包括片剂、锭剂、分散剂、混悬剂、溶液剂、胶囊、霜剂、膏剂、气雾剂等。优选化合物口服给药。使用的活性成分的有效剂量可根据所使用的具体化合物、给药模式、所治疗的病症和所治疗病症的严重性而变化。该剂量可容易地被本领域技术人员确定。当治疗或预防肥胖、糖尿病和/或高血糖症或高甘油三酯血症或其它疾病时，本发明化合物以约0.1毫克到约100毫克每千克动物体重的日剂量给药时获得普遍满意的结果，优选以单一日剂量或一天2到6次的分份剂量给予，或者以持续释放形式给予。对于大多数哺乳动物来说，总的日剂量为约1.0毫克到约1000毫克，优选约1毫克到约50毫克。对于70Kg的成年人，总的日剂量通常为约7毫克到350毫克。该剂量方案可调整为提供最佳的治疗响应。本发明的另一方面提供了药物组合物和药学可接受的载体。本发明的药物组合物包括所要求的化合物或其药学可接受的盐或其前药作为活性成分，和药学可接受的载体和任选其它的治疗成分。术语“药学可接受的盐”是指由药学可接受的无毒碱或酸制备的盐，包括无机碱或酸和有机碱或酸。该组合物包括适于口服、直肠、局部、肠胃外(包括皮下、肌内和静脉内)、眼睛(眼)、肺部(鼻腔或口腔吸入)、或经鼻给药的组合物，然而在任何给定情况下，最适合的途径将取决于被治疗病症的性质和严重性和活性成分的性质。它们可方便地存在于单位剂型中，且可通过任何药学领域公知的方法制备。在实际使用中，可以根据常规药物组合技术将该化合物作为活性成分与药学载体充分混合。载体可根据给药所需的制剂形式而采用多种形式，例如口服或肠胃外(包括静脉内)。在制备口服剂型组合物中，可采用任何常用的药学介质，例如，水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等，对于口服液体制剂的情况，可采用例如混悬剂、酏剂和溶液剂，或诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等，对于口服固体制剂的情况，可采用例如粉剂、硬和软胶囊和片剂，固体口服制剂比液体制剂优选。因为它们的给药，片剂和胶囊代表了最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下，明显采用的是固体药物载体。如果需要的话，可通过标准的含水或无水技术将片剂包衣。这些组合物和制剂应当包含至少0.1％的活性化合物。当然，这些组合物中活性化合物的百分数可以变化，方便地是单位重量的约2％到约60％。这些治疗有用的组合物中活性化合物的量是可获得有效剂量的量。活性化合物也可以鼻内给药，例如液体滴剂或喷雾剂。片剂、丸剂、胶囊等也可包含粘合剂例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁；和甜味剂例如糊精-麦芽糖复合剂、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型物质外可包含液体载体例如脂肪油。各种其它材料可作为包衣材料存在或用于修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂可用虫胶、糖或者二者包衣。除了活性成分外，糖浆或酏剂可包含蔗糖作为甜味剂，对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂、染料和调味剂例如樱桃或桔子香料。化合物还可以肠胃外给予。这些活性化合物的溶液剂或混悬剂可以在水中与表面活性剂例如羟基-丙基纤维素适当地混合而制备。分散剂也可以在甘油、液态聚乙二醇和其混合物的油中制备。在普通的贮藏和使用条件下，这些制剂包含有防腐剂以防止微生物的生长。适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂或用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况中，剂型必须是无菌的且必须是流动的到易于注射的程度。必须在制备和贮藏条件下稳定，其必须受到对诸如细菌和真菌的微生物的污染作用的防护。载体可以是溶剂或分散介质包含，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们适当的混合物，和植物油。化合物可以与在治疗、预防、抑制或改善这些疾病或病症中也有用的其它药物联合使用。通过其通常使用途径和量，这些其它的药物可与化合物同时或相继施用。当化合物同时与一种或多种其它药物施用时，优选包含这些其它药物和该化合物的单位剂量形式的药物组合物。然而，联合治疗还包括式I化合物与一种或多种其它的药物在不同重叠时间施用的治疗。还应当注意的是，当与一种或多种其它活性成分联合使用时，本发明的化合物和其它的活性成分可以比各自单独使用更低的剂量使用。因此，本发明的药物组合物包括那些除了化合物之外包含一种或多种其它活性成分的药物组合物。图1显示了花色素苷1-4和花色素5-9的结构。图2A是显示在4和10mM葡萄糖存在下化合物1和2使得每毫克蛋白分泌胰岛素的量，和图2B是显示在4和10mM葡萄糖存在下化合物5和6使得每毫克蛋白分泌胰岛素的量。测定孔中DMSO的最终浓度是0.1％。结果代表3次或5次独立试验且每一试样测定两次的平均数。使用t试验通过LSD测定的化合物1、2、5和6的胰岛素分泌在*(95％或p≤0.05)或**(99％或p≤0.01)处是显著的。图3显示了在4和10mM葡萄糖浓度下化合物3、7-9分泌的胰岛素。分泌胰岛素的量标准化为毫克蛋白。测定孔中DMSO的最终浓度是0.1％。结果代表3次独立试验且每一试样测定两次的平均数。使用t试验通过LSD测定的化合物3、7-9的胰岛素分泌在*(95％或p≤0.05)是显著的。图4显示了12周研究肥胖的时期内动物的食物摄取(g)。数值是平均±SEM，n＝8。每天测量食物摄取，计算每周的平均数。高脂肪(HF，60％K.Caloffat)对照和治疗组之间不存在显著差异。治疗组接受4周高脂饮食，之后它们转换为混合了试验化合物的饮食，花色素苷(1.0g/Kg)、桦木酸和乌索酸(0.5g/Kg)的高脂饮食。正常的饮食包含10％千卡。图5A、5B和5C显示了在喂养12周期间肥胖研究中C57BL/6J鼠的体重变化。整个试验中，在正常和高脂饮食对照组中各自在它们的饮食中加入10％和60％千卡。分别以1.0、0.5和0.5g每千克食物的量分别将花色素苷、桦木酸和乌索酸混合到高脂饮食中。化合物治疗组最初用高脂饮食(60％千卡)喂养4周，然后转换为包含适当治疗的饮食。数据表示平均±SEM，n＝8。图6显示了葡萄糖负荷后90分钟时期肥胖研究中葡萄糖耐受试验的结果。在第11个喂养周中进行该试验。向腹膜内给与葡萄糖(2g/Kg体重)的水溶液，在0、5、15、30、60和90分钟测量血糖水平。从尾静脉收集血液。竖线代表每一点的S.E.n＝5。图7显示了在喂养试验结束时测定的C57BL/6J鼠的血浆胰岛素水平。低和高脂肪喂养对照组测定的血浆胰岛素浓度分别是0.47±0.14和0.41±0.1ng/mL。通过放射免疫测定法(RIA)完成血浆中胰岛素的定量。每一试样测定两次，数值表示平均±SEMn＝8。图8显示了在喂养研究结束时收集的小鼠血浆中的血浆胆固醇水平，表示为mg/dL。由于血浆试样的量不够没有测试乌索酸治疗组动物的胆固醇水平。数值表示平均±SEMn＝4或5。图9显示了从10到12欧亚山茱萸分离的化合物。优选实施方案的描述本发明公开并证实了花色素苷、花青素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、花青素-3-半乳糖苷和花葵素-3-半乳糖苷；和花色素、花青素、飞燕草素、花葵素、锦葵花素(malvidin)和矮牵牛素(petunidin)通过体外啮齿动物胰腺β细胞(INS-I813/32)刺激胰岛素分泌的能力。这些化合物是在4和10mM葡萄糖浓度的存在下进行试验的。在4和10mM葡萄糖浓度下进行试验的花色素苷和花色素中，花青素-3-葡萄糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷是最有效的胰岛素促分泌剂。花葵素-3-半乳糖苷是主要的花色素苷中的一种，它的苷元、花葵素在4mM葡萄糖浓度下导致胰岛素分泌增加了1.4倍。所测试的其余花色素苷和花色素在4和10mM葡萄糖浓度下对胰岛素只具有微弱的作用。胰岛素刺激的实施例材料和方法化学药品。胎牛血清(FBS)和RPMI-1640培养基获自Invitrogen(GrandIsland，NY)。所用的所有有机溶剂都是ACS试剂等级的。用于制备缓冲液的HEPES、青霉素-链霉素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、胰蛋白酶-EDTA、BSA(牛白蛋白；RIA级)、Folin-Ciolatues试剂和化学药品都购自Sigma-AldrichChemicalCo.(St.Louis，MO)。在该测定中所用的花色素、花青素、飞燕草素、花葵素、锦葵花素和矮牵牛素都购自Chromadex(LagunaHills，CA)。花色素苷。飞燕草素-3-葡萄糖苷是从山茱萸果实提纯的。花青素-3-半乳糖苷和花葵素-3-半乳糖苷是从欧亚山茱萸果实分离的。在该研究中所用的纯花青素-3-葡萄糖苷来自我们在-20℃下的贮存。花色素苷的分离和纯化。将梾木属果实与水混合(pH＝3)并过滤。使滤液通过柱内的XAD-16AMBERLITE树脂，并用水反复洗涤吸附了花色素苷的树脂。然后用酸性MeOH(pH＝3)洗脱XAD-16树脂，并将所得的溶液减压浓缩，得到粗花色素苷部分。在梯度条件下使用MeOH∶H2O(pH＝3)，通过MPLC柱(C18硅胶)纯化该部分。用MeOH∶H2O(65∶35，v/v)溶剂系统洗脱花色素苷。在梯度条件下使用CapcellC18分析柱，通过HPLC(WatersCorp.)检查化合物的纯度。所用的溶剂是ATFA∶H2O(99.9∶0.1；v/v)和BH2O∶CH3CN∶CH3COOH∶TFA(50.4∶48.5∶1.0∶0.1；v/v/v/v)。梯度是在26分钟内从20％B到60％B，和在30分钟内到20％B，流速为0.8ml/min。使用PDA检测520nm处的峰值。胰岛素分泌研究。在5％CO2/空气中，在37℃下，在含11.1mM葡萄糖并且添加了10％FBS(胎牛血清)、10mMHEPES、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、4mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和50μM2-巯基乙醇的RPMI-1640培养基中常规培养INS-1832/13细胞(由DrChristopherNewgard，DukeUniversity，NC友情提供)。在胰蛋白酶-EDTA分离以后，每周传送细胞。为了进行静态分泌研究，将细胞以0.64×106细胞每孔的密度平铺在24孔板上，并生长24h。然后在含4mM葡萄糖和上述补充物的RPMI-1640中再培养细胞24h。然后在含4mM葡萄糖和0.1％BSA的KrebsRinger碳酸氢盐缓冲液(KRBB)中培养细胞两次，共进行30分钟。用KRBB快速洗涤细胞，并在含或不含所示花色素苷或花色素的包含4或10mM葡萄糖的KRBB中培养细胞60分钟。然后取出培养基用于测定胰岛素释放。然后用PBS洗涤细胞两次，并将细胞溶于1MNaOH中。然后用Lowry测定法测定细胞蛋白质浓度。将花色素苷和花色素溶于DMSO至得到想要的浓度。DMSO的终浓度是0.1％。用放射免疫测定法测定细胞分泌到培养基中的胰岛素，并标准化至总细胞蛋白质。放射免疫测定法(RIA)。RIA试剂盒购自LINCOResearchInc.(StCharles，MO)，根据厂商的说明进行测定。简单说来，将0.1-10ng胰岛素标准品(100μl)加到12×75mm试管中。类似地，将来自胰岛素分泌研究的样品(25μl)也加到试管中。至此，加入一份测定缓冲液(75μl)。然后将125I标记的胰岛素(100μl)加到各个试管中。将一份100μL抗大鼠胰岛素抗体加到该试管中，混合，并在4℃下培养24h，在4℃下用1ml份的沉淀试剂进一步培养20分钟，沉淀出与抗体结合的胰岛素。然后离心分离试管，用γ计数器测量放射性。Lowry蛋白质测定。用Lowry法测定分析孔中的蛋白质的量。通过将Lowry溶液，CuSO4·5H2O(1％)与酒石酸钠(1％)混合制备Lowry测定液。简单说来，将蛋白质样品(100μl)与Lowry混合物(1mL)在试管(12×75)中混合。将Folin-Ciolatues试剂(100μl)加到这些试管中，混合，并在室温下培养30分钟。使用UV分光光度计读取所得溶液在700nm处的光密度。结果和讨论对梾木属果实的研究表明，它们中的主要生物活性成分是花青素、飞燕草素和花葵素糖苷。因此，注意力主要集中在这些花色素苷及其苷元使用胰腺β细胞分泌胰岛素的能力上，以证实梾木属果实在抗糖尿病制剂中的传说中的(anecdotal)应用。矮牵牛素、锦葵花素和芍药花青素苷元包括在该测定中，因为它们在其它果实中很丰富。花色素苷是水溶性化合物。因此，通过XAD-16树脂可分开包含糖、生物类黄酮和花色素苷的欧亚山茱萸果实的水性提取物。用MPLC纯化从树脂洗脱的所得的花色素苷部分，得到纯花色素苷。在4、10和16mM葡萄糖浓度下测定由INS-I832/13细胞产生的葡萄糖诱导的胰岛素产生，发现在10mM葡萄糖浓度下胰岛素分泌达到了延滞期(数据未给出)。4mM水平的葡萄糖浓度是典型的人正常葡萄糖水平。与4mM葡萄糖浓度下的胰岛素分泌相比，在10mM葡萄糖下，细胞每mg蛋白质的胰岛素分泌是前者的3倍。在细胞生长培养基中测试4和10mM葡萄糖负载下的花色素苷和花色素。刚开始以50μg/mL的浓度测定花色素苷和花色素。在4mM葡萄糖下通过9ng/mg蛋白质，花色素苷、花青素3-葡萄糖苷显示出了胰岛素分泌增加(1.3倍)，而在10mM葡萄糖浓度下，它增强了胰岛素分泌1.43倍(119ng/mg蛋白质)(图2A)。飞燕草素-3-葡萄糖苷是所测试的最有效的花色素苷，它在4mM葡萄糖浓度下显示出胰岛素分泌增加了1.8倍(49ng/mg蛋白质)。然而，在10mM葡萄糖下，它显示出胰岛素产生只增加了1.4倍(113ng)(图2A)。在该测定中，在4和10mM葡萄糖浓度下，细胞分泌的胰岛素分别是27和83ng胰岛素/mg蛋白质。在4mM葡萄糖浓度下，花色素苷、花青素-3-半乳糖苷和花葵素-3-半乳糖苷没有增加胰岛素分泌。然而，在10mM葡萄糖浓度下，花青素-3-半乳糖苷显示出了17ng/mg胰岛素蛋白质的增加(1.2倍)(图3)。由于样品的限制，花葵素-3-半乳糖苷只测试了一次。在5、10、50、100和250μg/mL浓度下评价花色素苷花青素-3-葡萄糖苷的剂量依赖性胰岛素分泌。用于该测试中的葡萄糖浓度是4mM水平，它是典型的人正常葡萄糖水平。在该浓度下，未经处理的细胞分泌33ng胰岛素/mg蛋白质。在5μg/mL下，由花青素-3-葡萄糖苷处理过的细胞分泌的胰岛素是46ng胰岛素每mg蛋白质。然而，在化合物1的10、50、100和250μg/mL浓度下，胰岛素分泌没有显著区别。没有提供足够的飞燕草素-3-葡萄糖苷来进行剂量依赖性测定。在50μg/mL浓度下测定花色素。在4mM葡萄糖下，花青素-3-葡萄糖苷的苷元，花青素，增加了胰岛素分泌1.5倍(29ng/mg蛋白质)，而在10mM葡萄糖下，它分泌了88ng/mg蛋白质(图2B)。在这组测定中，未经处理的细胞在4和10mM葡萄糖下分别分泌了19和83ng胰岛素/mg蛋白质。在4mM葡萄糖浓度下，苷元飞燕草素显示出6ng/mg蛋白质的胰岛素分泌增加，且不显著。在10mM葡萄糖下，飞燕草素没有显示出葡萄糖诱导的胰岛素分泌(图2B)。花葵素是最有活性的花色素，它在4和10mM葡萄糖下分别分泌49(1.4倍)和91(1.2倍)ng的胰岛素/mg蛋白质(图3)。在4mM葡萄糖浓度下，苷元矮牵牛素增加了4ng胰岛素/mg蛋白质的胰岛素分泌。然而，对于未经处理的细胞，锦葵花素没有显示出胰岛素分泌增加。结果表明，花色素苷和花色素都是胰岛素促分泌剂。它们中最有效的是飞燕草素-3-葡萄糖苷，在4和10mM葡萄糖浓度下，与未经处理的细胞相比，它显著诱导了胰岛素分泌。尽管在较低的葡萄糖浓度下，花青素-3-糖苷比飞燕草素-3-葡萄糖苷活性低，但是在较高的葡萄糖浓度下，它更有效。在所研究的4和10mM葡萄糖浓度下，在半乳糖苷中，花葵素-3-半乳糖苷没有诱导胰岛素分泌，然而花青素-3-半乳糖苷显示出胰岛素分泌显著增加。所研究的花色素苷分泌胰岛素的能力按照递增顺序是飞燕草素-3-葡萄糖苷＞花青素-3-葡萄糖苷＞花葵素-3-半乳糖苷。这表明花色素苷B环内的羟基数目在分泌胰岛素能力方面起着重要作用。在4mM葡萄糖下，在所测试的花色素中，花葵素是最有效的。在所研究的4或10mM葡萄糖浓度下，其它苷元没有显著增强胰岛素分泌。结果表明，从果实和蔬菜中分离和提纯的花色素苷和花色素对于治疗糖尿病是有用的。治疗肥胖的实施例纯化来自欧亚山茱萸果实的花色素苷(图9)、乌索酸和桦木酸，并使用C57BL/6J转基因小鼠评价它们作为药物预防由高脂饮食消耗所引起的肥胖和胰岛素抗性的效力。刚开始用高脂饮食喂养小鼠4周，然后用包含试验化合物的高脂饮食再喂养8周。葡萄糖耐量试验(GTT)显示，高脂饮食对照的小鼠是胰岛素抗性的，用花色素苷和乌索酸治疗的小鼠克服了胰岛素抗性。在治疗过程中用高脂饮食(60％千卡)喂养的对照小鼠的平均体重增加是9.76±0.55g，而用花色素苷、桦木酸和乌索酸处理的小鼠分别是7.41±0.93、7.73±0.44和8.78±0.96g。花色素苷和桦木酸处理的小鼠的胆固醇水平显著低于对照动物。花色素苷和桦木酸处理的动物的血浆胰岛素水平分别是567±32.36和460.86±93.68ng/mL，而与对照动物相比，用乌索酸处理的动物显示出了52.25±8.84ng/mL的胰岛素。该体内研究证实了花色素苷是极好的胰岛素促分泌剂，除了降低总胆固醇以外，它在预防肥胖和胰岛素抗性方面也可能是有益的。实验操作花色素苷的纯化如前所公开，从欧亚山茱萸果实中分离花青素半乳糖苷、花葵素半乳糖苷和飞燕草素半乳糖苷作为花色素苷的纯混合物。简单地说，分离出籽，并将所得的果肉与水混合(pH＝3)和过滤。将滤液吸附到XAD-16AMBERLITE树脂上，用水反复洗涤，除去糖和其它有机酸。然后用酸性MeOH(pH＝3)洗脱所吸附的花色素苷。在梯度条件下用MeOH∶H2O(pH＝3)通过中压液相色谱(MPLC)柱(C18硅胶)纯化如此获得的花色素苷混合物。收集溶剂系统MeOH∶H2O(65∶35，v/v)洗脱的部分，并真空蒸发至干燥。用CapcellC18分析柱通过HPLC(WatersCorp.)证实花色素苷的纯度，并在520nm(PDA，WatersCorp.)下检测。桦木酸的分离分离欧亚山茱萸果实(5Kg)的籽(700g)，冻干，用正己烷(3×1L)、乙酸乙酯(3×1L)和甲醇(3×1L)连续萃取。在梯度条件下，用正己烷和EtOAc作为流动相，通过硅胶MPLC纯化EtOAc提取物(3.0g)。将从己烷-EtOAc(7∶3)洗脱收集的部分干燥，并从MeOH中结晶，得到桦木酸(2.5g)。乌索酸的分离用正己烷(3×1L)、EtOAc(3×1L)和MeOH(3×1L)连续萃取冻干的果肉和果皮。使用正己烷和EtOAc梯度通柱色谱纯化EtOAc(3.5g)提取物。真空蒸发己烷-EtOAc(7∶3)提取物至干燥，并从MeOH中使所得的剩余物结晶，得到乌索酸(2.2g)。通过1H和13CNMR光谱实验表征乌索酸和桦木酸(Werner，S.，Nebojsa，S.，Robert，W.，Robert，S.，和Olaf，K.(2003)Completeassignmentsof1Hand13CNMRresonancesofoleanolicacid，18α-oleanolicacid，ursolicacidandtheir11-oxoderivatives.Mag.Res.Chem.41，635-638.)。动物和饮食4周龄的雄性C57BL/6J小鼠购自JacksonLaboratories(BarHarbor，Maine，USA)。在控制温度(70)下和12h光照-黑暗循环下单独圈养小鼠。小鼠(n＝40)能自由接近水和实验室未纯化的食物5天。适应以后，将小鼠随机分成1-5组(n＝8)进行研究。根据密西根州立大学(MichiganStateUniversity，EastLansing，MI)的大学实验动物资源(ULAR)伦理指南(theethicalguidelinesofUniversityLaboratoryAnimalResources)进行实验。10％千卡(正常)饮食和60％千卡(高脂肪)饮食购自ResearchDiets(NewBrunswick，NJ)。饮食的组成在表1中表示。表1.正常(105千卡)饮食和高脂肪(60％千卡)饮食的组成对照是第1组和第2组，它们在整个研究过程中分别接受正常(10％千卡)饮食和高脂肪(60％千卡)饮食。将1g纯花色素苷混合物、500mg各个桦木酸和乌索酸每千克高脂饮食混合，分别制备各个处理组的食物。刚开始用高脂饮食喂养第3-5治疗组4周，然后变成用含花色素苷、桦木酸或乌索酸的食物喂养。以3天为间隔更换食物，以避免脂肪或化合物氧化。在整个研究过程中测量每只动物的每日食物摄入(图1)和每周体重(图2A-C)。血清、肝和脂肪组织的收集。12周后停止喂养。然后使用异氟烷麻醉动物，处死，通过心脏穿刺收集血样在肝素化试管中。在4℃下以1600×g离心分离血浆10分钟，迅速冷冻，并在-20℃下保存直至使用。根据解剖学标志收集肝和附睾的白脂肪组织(WAT)，称重，并在液氮中迅速冷冻。还收集四肢肌肉，并在液氮中冷冻。收集胰腺，在最适切割温度(O.C.T)(SakuraFinetek，Inc.，CA)下保存，并在液氮中冷冻。然后从液氮中转移出所有组织，并在-80℃下保存直至用来分析。葡萄糖耐量试验(GTT)。补充疗法6周以后，在每组(n＝5)5只动物身上进行葡萄糖耐量试验。在0(min)时，使用试验带(FreeStyle，TheraSense，Inc.，CA)，用FreeStyleFlash(TheraSense，Inc.，CA)手提式血糖测定仪测量血糖水平。为了进行GTT，将包含2g葡萄糖每kg体重的无菌溶液向腹膜内注射(i.p.)。分别在5、10、15、30、60和90min收集尾静脉血液和测量葡萄糖水平。相对于时间标绘血糖水平(图3)。放射免疫测定法(RIA)。用购自LINCOResearchInc.(StCharles，MO)的大鼠胰岛素RIA试剂盒测量血浆胰岛素水平。将胰岛素标准品(100μl每份)移液至12×75mm的试管中。总共10个浓度的胰岛素，范围从0.1到10ng/mL，用于测定表征曲线。将血浆样品(1-25μl每份)加入试管中，并加入测定缓冲液，以达到100μl的样品总体积。将125I标记的胰岛素和抗大鼠胰岛素抗体(100μL每份)加到试管中，并在4℃下培养。24h后加入沉淀试剂(1mL)，并在4℃下再次培养20分钟，以沉淀出与抗体结合的胰岛素。然后在3000g下将试管离心分离20分钟，缓慢倒出液体，用γ计数器测量放射性。血浆胆固醇的测定根据总胆固醇的既定标准分析方案，在密西根州立大学兽医学院的人和动物健康诊断中心，由临床病理学实验室分析总血浆胆固醇。结果和讨论欧亚山茱萸果实，也称为欧亚山茱萸(corneliancherry)，与酸樱桃(P.cerasus)相似。该植物的植物化学检查得到花葵素半乳糖苷、花青素半乳糖苷和飞燕草素半乳糖苷作为主要的花色素苷(Seeram，N.P.，Schutzki，R.，Chandra，A.，和Nair，M.G.(2002)Characterization，quantification，andbioactivitiesofanthocyaninsinCornusspecies.J.Agric.FoodChem.50，2519-2523)和三萜类如乌索酸和桦木酸。转基因小鼠模型经常用作研究代谢和内分泌病症的模型。所用的C57BL/6J模型小鼠是来普汀受体突变纯合的，并发展成饮食过量、肥胖、高胰岛素血症和高血糖症(Coleman，D.(1978)Obeseanddiabetestwomutantgenescausingdiabetes-obesitysyndromesinmice.Diabetologia14，141-148)。因此，用来自欧亚山茱萸的提纯的花色素苷、桦木酸和乌索酸喂养小鼠，评价其在预防食物引起的肥胖和胰岛素抗性中的效力。在用掺在高脂饮食中的化合物处理8周以前，以高脂饮食喂养动物4周。对照组动物接受正常饮食或高脂饮食。体重和食物摄入。在前3周内，第1组动物的食物摄入大约≌4.5g，然后减小至≌3.5g每天(图1)，并在整个实验过程中保持不变。在整个实验过程中，第2组动物的食物摄入保持不变，为≌2.8g每天(图1)。从结果中显而易见的是，试验化合物没有影响动物的食物摄入。在整个实验过程中，第3-5组动物的食物摄入量也是大约2.8g每天(图1)。第1组动物(正常饮食)和第2组动物(高脂饮食)的体重有显著差别，平均体重分别是31.5和36.91g。用化合物1(第3组)、化合物2(第4组)和化合物3(第5组)处理的高脂饮食动物分别重34.19、33.54和34.89g(图2A-2C)。在实验过程中(12周)，第1组和第2组的全部体重增加分别是13.94和18.98g。类似地，第3、4和5组动物分别增加了15.91、15.16和17.45g体重。在处理过程中，这些动物增加的体重分别是7.41、7.73和8.78g，而第1组和第2组对照则分别显示出了6.63和9.76g的体重增加。葡萄糖耐量试验。腹膜内(i.p.)注射葡萄糖溶液(2g/kg)进行葡萄糖耐量试验(GTT)。以5、10、15、30、60和90min间隔，通过尾静脉取血测量注射了葡萄糖的动物的血糖水平。各组之间0时的血糖水平几乎完全相同。低脂肪对照组和高脂肪对照组(第1组和第2组)的最初葡萄糖水平分别是133.8±15.37和119.8±7.24mg/dL(图3)。在用化合物10-13处理的动物中所测得的血糖水平分别是123.4±4.65、123.4±6.0和113.5±15.5.16mg/dL。除了乌索酸处理的动物以外，所有组在注射葡萄糖30分钟以后血糖浓度都达到了最大。而且，该组的葡萄糖吸收很慢，在60分钟时血糖浓度达到了最大值。葡萄糖负载90分钟以后，用正常饮食和高脂饮食喂养的动物的血糖水平分别是190±6.31和363±19.76mg/dL。类似地，第3-5组动物的血糖水平分别是221±31.5、317.8±21.9和227±22.982。血浆胰岛素水平使用放射免疫测定法(RIA)测量血浆胰岛素(Qian，D.，Zhu，Y.，andZhu，Q.(2001)EffectofalcoholextractofCornusofficinalisSieb.etZucconGLUT4expressioninskeletalmuscleintype2(non-insulin-dependent)diabetesmellitusrats.ZhongguoZhongyaoZazhi26，859-862)。测量的对照动物胰岛素水平，第1组和第2组，分别是0.47±0.14和0.41±0.1ng/mL(图4)，而当用花色素苷、华木酸和乌索酸治疗时分别显示的是567.98±32.36、460±93.68和52.25+8.84ng/mL的胰岛素。空腹血糖测量正常和高脂饮食对照组的空腹血糖以确定使用高脂饮食的动物是否是糖尿病。停止喂养动物6小时，测定从尾静脉收集血液的葡萄糖水平。正常(n＝8)和高脂饮食(n＝8)喂养动物的葡萄糖水平分别是126.6±4.6和125±5.19mg/dL。血浆胆固醇正常和高脂饮食对照的血浆胆固醇水平分别是120.5±10.61和156.4±8.26mg/dL。花色素苷和桦木酸治疗动物的胆固醇分别是134.2±15.5和126.5±14.01mg/dL(图5)。单一高脂饮食动物和包含试验化合物的高脂饮食动物的食物摄取在研究过程中不变。有趣地注意到正常饮食的对照动物比高脂饮食的动物消耗更多的食物。高脂饮食对照和治疗组每天摄入的热量为约14.56千卡而正常饮食对照每天消耗13.3千卡。与高脂饮食对照相比，喂养包含花色素苷饮食的动物显示了显著的体重降低。观察到的喂养花色素苷和桦木酸的动物体重分别减轻24和21％(图5A和5B)。然而，与高脂饮食对照相比，观察到的喂养乌索酸的动物体重减轻不显著。与高脂饮食对照相比，花色素苷和桦木酸治疗的动物的血浆在总胆固醇上显示了相当大的降低(图5)。乌索酸治疗的动物的血浆不足以完成总胆固醇测定。2-5组动物的食物摄取在整个研究中相似，因此观察到的花色素苷喂养的动物的体重减轻暗示了其在预防肥胖中有效的应用。在所有动物中进行葡萄糖耐量试验(GTT)以确定胰岛素抗性(图6)。尽管乌索酸没有显著降低受治疗动物的体重，该组中所有动物与正常饮食喂养的对照组动物相似纠正了葡萄糖水平。除了血糖浓度在30分钟达到最大值外，花色素苷治疗与乌索酸治疗在GTT测定中显示了相似的作用。用乌索酸(第5组)治疗动物的血糖水平在60分钟达到最大值指示乌索酸可推迟葡萄糖吸收。因此，由于具有推迟葡萄糖吸收的能力，乌索酸可以是被2型糖尿病患者消费的有用产品。在90分钟时，花色素苷和乌索酸治疗动物的血糖水平与接受低脂肪饮食的对照组相似。然而，桦木酸治疗的动物在GTT中没有反应，结果与喂养高脂饮食的对照组相似。对于喂养高脂饮食的动物，血糖浓度在30分钟达到最大值，且持续稳定上升直到90分钟，显示了这些动物胰岛素抗性。图9化合物10-15治疗动物的血浆胰岛素浓度比接受正常和高脂饮食(图4)的对照动物高很多。在治疗组中花色素苷治疗的动物胰岛素分泌增加的最多。花色素苷治疗动物的胰岛素分泌是乌索酸治疗动物的10倍或更多(图7)。结论，从欧亚山茱萸果实分离的花色素苷是所研究的降低高脂饮食动物体重的三种化合物中最好的。它还引起大量胰岛素的分泌而不导致低血糖症。分离和生成花色素苷和花色素的方法描述在美国专利第6,194,469；6,423,365；6,623,743；6,676,978和6,656,914；和2002年2月27日提交的美国专利申请系列第10/084,575号中，它们的全部内容引入本文以作参考。前述说明仅意欲举例说明本发明，且本发明仅由下述附加的权利要求限制。权利要求1.控制有此治疗需求哺乳动物患者肥胖的方法，包括给予该患者治疗有效量的包含选自花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物和其混合物的组合物。2.治疗正在使用治疗糖尿病处方药物治疗的人类糖尿病患者肥胖的方法，包括给予该患者治疗有效量的包含选自花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物和其混合物的组合物和该处方药物。3.权利要求1或2的方法，其中，花色素苷、花色素、乌索酸或桦木酸分离自水果、蔬菜和花。4.权利要求1的方法，其中，花色素苷选自花青素-3-糖苷、飞燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷和其混合物。5.权利要求1或2的方法，其中，花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自欧亚山茱萸。6.权利要求1的组合物，其中，花色素、或花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸或其混合物是经分离和纯化的。7.权利要求1或2的组合物，其中，组合物源自天然来源，且基本上不含天然来源中存在的糖和酸。8.治疗有此治疗需求哺乳动物患者糖尿病以控制糖尿病的方法，包括给予所述患者治疗有效量的包含选自花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物和其混合物的组合物。9.权利要求8的方法，其中，花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自水果、蔬菜和花。10.权利要求8的方法，其中，花色素苷选自花青素-3-糖苷、飞燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷和其混合物。11.权利要求8的方法，其中，花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自欧亚山茱萸。12.权利要求8的方法，其中，组合物源自天然来源，且基本上不合天然来源中存在的糖和酸。13.权利要求8的方法，其中，糖尿病是1型糖尿病。14.权利要求8的方法，其中，糖尿病是2型糖尿病。15.治疗或控制有此治疗需求哺乳动物患者高血糖症的方法，包括给予治疗有效量的包含选自花色素苷、乌索酸、桦木酸的化合物和其混合物的组合物。16.权利要求15的方法，其中，花色素苷、花色素、乌索酸或桦木酸分离自水果、蔬菜和花。17.权利要求15的方法，其中，花色素苷选自花青素-3-糖苷、飞燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷和其混合物。18.权利要求15的方法，其中，花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自欧亚山茱萸。19.权利要求15的方法，其中，花色素、花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸或其混合物是经分离和纯化的。20.权利要求15的方法，其中，组合物源自天然来源，且基本上不含天然来源中存在的糖和酸。21.用于治疗肥胖、糖尿病或高血糖症作为疾病的组合物，包括(a)用于在一段时期内治疗该疾病的日剂量单位的花色素苷、花色素、乌索酸或桦木酸或其混合物，和(b)药学载体。22.权利要求21的组合物，其中，花色素苷选自花青素-3-糖苷、飞燕草素-3-糖苷、花葵素-3-糖苷和其混合物。23.权利要求21的组合物，其中，花色素苷、花色素、乌索酸或桦木酸分离自水果、蔬菜和花。24.权利要求21的组合物，其中，花色素苷、乌索酸或桦木酸分离自欧亚山茱萸。25.权利要求21的组合物，其中，组合物分离自天然来源，且基本上不含天然来源中存在的糖和酸。26.治疗或控制有此需求哺乳动物患者脂质紊乱、高脂血症或低HDL的方法，其中包括给予所述患者治疗有效量的包含选自花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物。27.治疗或控制有此治疗需求哺乳动物患者高胆固醇血症的方法，其中包括给予所述患者治疗有效量的包含选自分离的花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物。28.治疗或控制有此治疗需求哺乳动物患者高甘油酯血症的方法，其中包括给予所述患者治疗有效量的包含选自分离的花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物。29.治疗或控制有此治疗需求哺乳动物患者血脂异常和/或低HDL胆固醇的方法，其中包括给予所述患者治疗有效量的包含选自分离的花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物。30.治疗有此治疗需求哺乳动物患者动脉粥样硬化的方法，其中包括给予所述患者治疗有效量的包含选自分离的花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸的化合物或其混合物的组合物。31.权利要求26、27、28、29或30任一项的方法，其中，化合物源自欧亚山茱萸。32.权利要求26、27、28、29或30任一项的方法，其中，花色素苷、花色素、乌索酸、桦木酸或其混合物是经分离和纯化的。33.权利要求26、27、28或29任一项的方法，其中，组合物源自天然来源，且基本上不含天然来源中存在的糖和酸。全文摘要描述了使用花色素苷、花色素、乌索酸和/或桦木酸在哺乳动物中治疗肥胖、糖尿病、高胆固醇和相关疾病包括高血糖症、脂质紊乱、高甘油酯血症、血脂异常和动脉粥样硬化的方法。还描述了适合于这些治疗的组合物。文档编号A61K36/45GK1988912SQ200580025447公开日2007年6月27日申请日期2005年7月25日优先权日2004年7月29日发明者M·G·奈尔,B·亚亚普拉卡萨姆,L·K·奥尔森,R·E·舒茨基申请人:密执安州大学