专利名称：替普瑞酮在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物的新用途，特别是涉及替普瑞酮(Geranylgeranylacetone，GGA)在制备青光眼预防和/(“/”表示或)或治疗性药物中的应用。
背景技术：
青光眼是一组由于绝对性或相对性眼压升高所致的视神经损伤性疾病。随着感染性致盲眼病的有效控制，角膜移植、白内障复明手术的广泛开展，青光眼已成为全球范围内最常见的不可逆致盲眼病(Foster PJ，Johnson GJ.Glaucoma in Chinahowbig is the problem？Br.J.Ophthalmol 2001；851277-82.)。
目前，针对青光眼眼压升高的治疗手段主要包括药物、激光、手术等，且在临床实践中获得了良好的疗效。但是，经研究发现即便青光眼患者的眼压得到了良好的控制，仍有约40％的患者发生进行性视功能损害(Caprioli J.Neuroprotection of theoptic nerve in glaucoma.Acta Ophthalmol Scand.1997；75364-67.)。
研究表明，青光眼视神经损害是指由压力或低血流灌注压所致的缺血、缺氧等使视神经纤维轴浆流中断，导致靶源性神经营养因子的供给中断直接受到损伤的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)死亡。同时由于产生较多的兴奋性毒素，通过胞内信号转导，激活了某些诱导凋亡基因，激发一系列级联式反应，最终导致DNA断裂，引起损伤周围原来完整的RGCs发生凋亡。因此，治疗青光眼的关键是预防视神经的损害和RGCs的凋亡。在控制眼压的基础上给予视神经保护被认为是青光眼理想的治疗方式。
目前的策略主要集中在阻断启动凋亡通路和补充抗凋亡因子方面。由于凋亡的启动是一个复杂的过程，存在众多的已知通路和未知通路，所以单纯阻断任何一个通路或几个通路并不能完全阻止青光眼患者由于多种因素引起的视网膜细胞的凋亡。所以这一策略虽然在各种单一因素的实验动物模型和体外实验取得了成功，但是在临床应用方面未能取得明显的能有说服力的效果。抗凋亡因子的补给治疗措施包括神经生长因子补给疗法，应用基因工程方法减弱凋亡基因，增强抗凋亡基因的策略在动物实验获得了一定的成功。但如何能长期持续、安全的将这些因子供给视网膜和视神经仍是一个未解决的问题。然而，在青光眼视神经病变的治疗研究领域中目前存在着另外非常重要且被忽视了的问题。青光眼所造成的视神经损害不但包括视网膜节细胞，也包括视网膜其它细胞，更为重要的问题是视网膜节细胞的死亡最终会导致上位神经元细胞代谢活性降低、萎缩，甚至凋亡等继发损害，包括LGN(Lateral geniculate nucleus，外侧膝状体)，枕叶皮层神经元(Gupta，Neeru MD，Yucel YH.Glaucoma and the Brain.Journal of Glaucoma 2001；Supplement 1S28-S29.)。有证据表明，减少营养支持，诱导RGCs胞变性，可导致初级视皮质和LGN的损伤(Dandona L，Hendrickson A，Quigley HA.Selective effects of experimental glaucoma on axonal transportby retinal ganglion cells to the dorsal lateral geniculate nucleus.InvestOphthalmol.Vis.Sci.1991；321593-99；Anderson DR，Hendrickson A.Effect ofintraocular pressure on rapid axoplasmic transport in monkey optic nerve.Invest Ophthalmol 1974；13771-83.)。可见，视神经纤维损失后，LGN和视皮质继发性的神经元损伤可直接导致青光眼的病情进展，并加重存活的RGCs对进行性伤害的易感性。
RGCs的死亡对靶神经元的影响，损伤的靶神经元对存活的视网膜神经节的影响，这一相互的病理作用可加重业已存在的损伤，在青光眼的病情恶化中起重要作用，这提示我们应该从整个视路的总体水平重新审视青光眼视功能伤的发生、发展机制，为临床青光眼的防治提供新思路。因此，寻找一种能够作用于整个视觉通路，启动其内源性神经元抗损伤，抗凋亡作用的新治疗策略，成为青光眼视神经病变治疗研究的方向。
HSP又称应激蛋白，普遍存在于原核细胞及真核细胞中，在应激状态下，生物体细胞启动HSP基因，编码合成的一类生物进化上最保守的蛋白。根据其分子量、等电点不同，将HSP分为低分子量HSP家族、HSP60家族、HSP70家族、HSP90家族和HSP110家族等，每个家族又有多个成员组成(Gupta M，Vavasis C，Frishman WH.Heatshock proteins in cardiovascular disease a new therapeutic target.Cardiol.Rev.2004；1226-30.)。
大量实验研究表明，机体在热应激、缺氧、病原体、细胞因子及理化有害因素等刺激状态下，机体细胞将大量合成HSPs。HSPs表达增高，可使细胞在应激状态下存活，并能促进受损细胞自身的修复。目前认为热应激状态下HSPs细胞保护机制可与HSPs多种生物学功能有关，如帮助蛋白折叠、装配、向内质网易位及分解错装的蛋白等“分子伴侣”功能、提高细胞耐热能力及参与受体功能等。HSPs通过参与细胞骨架构建而起到稳定细胞的作用，应激状态下能够维持细胞中间丝蛋白完整性，防止细胞蛋白的展开，因此可以预防细胞凋亡的发生。另外，HSPs还可以通过参与凋亡途径的多个层面，抑制凋亡的发生，例如(1)通过抑制凋亡前Bcl-2蛋白活化，阻止线粒体外膜的渗漏和致凋亡因子的释放，从而阻断线粒体依赖的内源性凋亡的发生。
(2)阻断由死亡受体介导的外源性凋亡途径。(3)通过抑制caspase的活性和对凋亡的诱导作用，阻断凋亡小体的形成。(4)调控参与调节凋亡级联反应中的关键成分的一些信号级联反应过程，包括JNK，NF-κB和AKT等(Rokutan K.Role of heatshock proteins in gastric mucosal protection.J.Gastroenterol.Hepatol.2000；15 SupplD12-D19.)。在众多HSP家族成员中研究最多的是HSP70家族(ParkKH，Cozier F，Ong OC，Caprioli J.Induction of heat shock protein 72protectsretinal ganglion cells in a rat glaucoma model.Invest Ophthalmol.Vis.Sci.2001；421522-30.)。
1988年，Barber等报道热刺激时视网膜内可观察到HSP的表达，使感受器免受光线的损伤，并首次提出了HSPs的神经保护作用(Barbe MF，Tytell M，Gower DJ，Welch WJ.Hyperthermia protects against light damage in the rat retina.Science1988；2411817-20.)。随后人们进行了大量的相关研究，结果发现诱导HSP70表达增加或整合了含有HSP70基因的大鼠神经元对缺血和损伤显示出更高的耐受性(Kelly S，Yenari MA.Neuroprotectionheat shock proteins.Curr.Med.Res Opin.2002；18Suppl 2s55-s60.)。对培养大鼠RGC进行热(42℃)处理及亚致死剂量低氧处理后，发现二者均可诱导HSP72的合成，且GRC的存活率远高于正常对照组，提示高温及亚致死剂量低氧可能是通过诱导的内源性HSP产生提高了RGC对缺氧及兴奋毒素的耐受性，从而对RGC起到保护作用，使之免于死亡(Caprioli J，Kitano S，Morgan JE.Hyperthermia and hypoxia increase tolerance of retinal ganglioncells to anoxia and excitotoxicity.Invest Ophthalmol.Vis.Sci.1996；372376-81.)。2001年，Park等应用大鼠青光眼模型，发现通过热应激和Zn剂可诱导内源性HSP70的生成，通过热应激和Zn剂预诱导HSP72在视网膜的表达可显著提高高眼压状态下RGCs的存活率(Park KH，Coz ier F，Ong OC，Caprioli J.Induction of heat shock protein 72 protects retinal ganglion cells in a ratglaucoma model.Invest Ophthalmol.Vis.Sci.2001；421522-30.)。由此可以看出，通过诱导内源性HSP可能会达到防治青光眼性视神经病变的目的。
但是无论是采用提高机体体温还是造成亚致死剂量缺氧状态以诱发这一保护性蛋白产生的手段均不适用于人类，也有人提出经瞳孔采用激光温热刺激诱导视网膜生产上述保护性蛋白的策略(Mainster MA，Reichel E.Transpupi llary thermotherapyfor age-related macular degenerationlong-pulse photocoagulation，apoptosis，and heat shock proteins.Ophthalmic Surg.Lasers 2000；31359-73.)，但是，这一方法只能诱导视网膜局部这类保护性蛋白的产生，对整个视觉通路神经元的保护未起到作用。
LGN中包含中继神经元和中间神经元两大类神经元。中继神经元的轴突投射至初级视皮质，中间神经元的轴突局限在LGN之中。一个中继LGN神经元可以接受多个神经节细胞的输入，也通过中间神经元接受邻近神经元的影响。微清白蛋白是标记中继神经元的特异性标记蛋白，可选择性地标记传递视觉信息至视皮质的中继神经元。微清白蛋白是一种具有水溶性的钙结合蛋白，酸性，分子量大约为12kD。
替普瑞酮(Geranylgeranylacetone，GGA)是一种非环状类异戊二烯复合物，现已被广泛用于消化道溃疡的治疗中。
发明内容
本发明的目的是提供替普瑞酮(Geranylgeranylacetone，GGA)的新用途，即在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。
本发明所述的应用是以GGA为活性成分在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。
需要的时候，在本发明所述应用中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等，必要时还可加入香味剂、甜味剂及色素等。
本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成片剂、粉剂、粒剂、口服液、注射液、等多种药物形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
该药物的成人口服用量一般为50mg/次，3次/天。
本发明提供了一种GGA的新用途，即在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。动物实验结果(1)口服GGA后6小时即可见大鼠LGN部位HSP 70表达升高，24小时时达高峰，48小时时明显降低。HSP70的表达量随着给予GGA剂量的增加而增加，以400mg/kg和800mg/kg两组最显著。GGA诱导大鼠LGN部位HSP 70表达升高的最佳给药剂量为400mg/kg/d。(2)视神经切断加GGA治疗组和视神经切断加热休克处理组双侧dLGN中的PV阳性细胞数量和面积较视神经切断组、视神经切断加赋形剂治疗组显著增高。(3)视神经切断加GGA治疗组和视神经切断加热休克处理组双侧vLGN中的PV阳性细胞数量和面积较视神经切断组、视神经切断加赋形剂治疗组显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。(4)视神经切断加GGA治疗组和视神经切断加热休克处理组双侧LGN中的CCX活性较视神经切断组、视神经切断加赋形剂治疗组显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。(5)口服GGA或视热休克处理后24小时可见视网膜HSP70表达显著升高。(6)视神经切断加GGA治疗组和视神经切断加热休克处理组RGCs胞数量较视神经切断组、视神经切断加赋形剂治疗组显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。(7)视神经切断加GGA治疗组和视神经切断加热休克处理组RGCs胞凋亡数量较视神经切断组、视神经切断加赋形剂治疗组显著减少，差异具有显著性意义(p＜0.01)。上述实验结果表明口服GGA可有效诱导外侧膝状体和视网膜中HSP70表达，并对大鼠视神经切断后LGN神经元和RGCs胞具有保护作用，因此可以GGA为活性成分制备成预防和/或治疗青光眼的药物。与目前临床上常用的青光眼治疗性药物相比，本发明的药物具有以下优点1)疗效明显，总有效率可达92.5％以上；2)安全性高；3)主要用药途径为口服，用药方便；4)GGA价格低廉，制备该药物的成本较低，从而可减轻病人的经济负担。本发明不仅为青光眼的防治提供一条新的途径，也对神经系统疾病及进行性神经系统损伤性疾病的治疗及研究具有借鉴作用，在医药学领域的应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为BCA法测蛋白定量的标准曲线图2为口服赋形剂、GGA和热休克处理后大鼠LGN部位HSP70表达时间效应的蛋白印迹及半定量分析结果图3为口服GGA后大鼠LGN部位HSP70表达剂量效应的蛋白印迹及半定量分析结果图4为口服赋形剂、GGA或热休克处理后大鼠LGN部位HSP70分布情况的免疫组织化学检测结果图5为正常及视神经切断后大鼠眼底图6为大鼠双侧dLGN部位PV阳性细胞分布情况的免疫组化染色结果图7为大鼠双侧vLGN部位PV阳性细胞分布情况的免疫组化染色结果图8为大鼠外侧膝状体位置示意9A为手术同侧dLGN中PV阳性细胞表达数量的定量分析结果图9B为手术同侧dLGN中PV阳性细胞面积的定量分析结果图10A为手术对侧dLGN中PV阳性细胞表达数量的定量分析结果图10B为手术对侧dLGN中PV阳性细胞面积的定量分析结果图11A为手术同侧vLGN中PV阳性细胞表达数量的定量分析结果图11B为手术同侧vLGN中PV阳性细胞面积的定量分析结果图12A为手术对侧vLGN中PV阳性细胞表达数量的定量分析结果图12B为手术对侧vLGN中PV阳性细胞面积的定量分析结果图13为线粒体蛋白浓度标准曲线图14A为大鼠手术同侧LGN线粒体CCX表达水平图14B为大鼠手术对侧LGN线粒体CCX表达水平图15为口服GGA后大鼠视网膜HSP70表达水平的蛋白印迹及半定量分析结果图16A为大鼠视神经切断后RGCs的FG逆行标记结果图16B为大鼠视神经切断后RGCs计数及统计学分析结果图17A为大鼠视神经切断后用dUTP缺口末段标记法检测视网膜神经节细胞的凋亡情况图17B为大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞凋亡数的统计学分析结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实验动物健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体重200-250g，购自北京维通利华试验动物技术有限公司，动物合格证编号为SCXK(京)2002-0003。12小时光照/12小时黑暗条件下饲养。
GGA购自日本卫材株式会社。
实施例1、检测口服GGA对大鼠外侧膝状体部位HSP70表达的影响一、蛋白印迹检测口服GGA对大鼠外侧膝状体(Lateral geniculate nucleus，LGN)部位HSP70表达的影响1、蛋白印迹检测口服赋形剂、GGA和热休克处理后大鼠LGN部位HSP70表达的时间曲线将实验大鼠随机分为2组N组(正常对照组，n＝6)和T组(处理组)；T组又分为VT组(赋形剂给药组)、GT组(GGA给药组)和HT组(热休克处理组)。给药方法为将GGA(400mg/kg)或赋形剂(含5％乳糖和0.008％维生素E)溶于5mL/kg生理盐水后灌胃，正常对照组用生理盐水灌胃(5mL/kg)。热休克处理方法为水合氯醛(40mg/100g体重)腹腔麻醉，5分钟后将大鼠置于20×15×8(cm)的无盖铝制饭盒中，然后将装有大鼠的饭盒放在42℃水浴箱中，测量大鼠直肠温度达到40-42℃时计时15min取出，常温下待大鼠清醒。
分别对大鼠进行上述处理，于处理后6h、12h、24h、48h(各时间点n＝6)迅速断头处死，取脑，分离双侧LGN核，液氮内冻存，用蛋白印迹检测口服赋形剂、GGA和热休克处理后大鼠LGN部位HSP70表达的时间曲线。蛋白印迹检测方法包括以下步骤(1)全细胞蛋白的提取将上述冻存的大鼠LGN组织转移至Eppendorf管中，按每mg组织10μl的比例加入全细胞裂解液(50mM Tris·Cl(pH 7.5)，150mM NaCl，5mM EDTA，5mM EGTA，1％SDS)，用手持式匀浆器匀浆，超声破碎，使组织细胞完全溶解，制备成蛋白含量为5g/L的电泳样品，-20℃保存备用。
(2)BCA法蛋白定量采用BCA法进行蛋白定量，反应基本原理为在37℃、碱性环境条件下，蛋白质分子内的肽键与Cu2+形成一价铜离子的四聚体，一价铜离子又与双金鸡宁酸(BCA)形成一紫色复合物，此复合物在波长562nm处有最大吸收波峰。具体方法为取eppendorf管17个，按表1进行编号和配液。配好后，置于37℃水浴箱中温浴30分钟，利用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce公司)和紫外分光光度计内蛋白定量程序，用于测定总蛋白含量的标准曲线见图1。
表1全细胞总蛋白标准曲线液体配制
(3)SDS-PAGE取10μl(50μg蛋白)蛋白电泳样品与蛋白分子量标准品共同进行10％SDS-PAGE电泳分析，电泳条件4℃，电流20-30mA。电泳结束后将蛋白从SDS-PAGE凝胶上转移至NC膜，转膜条件孔径为0.22μm的NC(Nitrocellulose filter，硝酸纤维素膜，Bio-Rad公司)、4℃，电流400mA，时间3小时。
(4)Western-blot对转移至NC膜的蛋白进行Western-blot检测，具体方法包括以下步骤①将NC膜取出，于TBS缓冲液(20mM Tris，0.5M NaCl，pH7.5)中漂洗5分钟。
②用10％脱脂牛奶封闭液(称取10g脱脂奶粉，溶于80mLTTBS(pH7.5)中，搅拌完全溶解，后加入TTBS定容至100mL，再加入10μl乙基汞硫代水杨酸钠(Thimerosal，美国Sigma公司)，混匀)封闭膜1小时，回收封闭液，以重复使用。
③用蒸馏水冲洗膜3遍后，再用TTBS液(20mM Tris，0.5M NaCl，0.05％Tween-20，pH7.5)漂洗膜三次，每次10分钟。将HSP 70单克隆小鼠抗体(加拿大Stressgen公司)按1∶1000比例稀释于20mL TTBS中，并加入0.01％Thimerosal。
④将漂洗后的NC膜放入上述抗体稀释液中，室温下孵育3小时后，回收抗体，4℃环境中保存，以备重复应用。
⑤用蒸馏水冲洗膜数遍后，用TTBS液洗膜三次，每次10分钟。将辣根过氧化物酶标记的二抗(吉泰生物科技公司)按1∶5000比例稀释于20mL TTBS液中，在杂交盒内孵育膜1小时。
⑥弃二抗溶液，用蒸馏水冲洗膜5遍，再次用TTBS液洗膜，共3次，每次10分钟。(注以上所有过程皆在摇床上进行)⑦用Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate试剂盒并按照说明书进行下述操作取发光剂和增强剂各1mL，按1∶1比例混和，倒入盛有NC膜的杂交盒内，用手轻轻摇动杂交盒，使发光剂及氧化剂混和均匀并与膜表面充分接触。
⑧5分钟后，取出膜，用保鲜膜包裹，排净气泡，将NC膜贴在暗盒上，进入暗室曝光。
⑨取一张X-光片，将感光面对准NC膜，放在膜的正上方，合上暗盒，开始计时，1分钟后取出X-光片，立即投入显影液中，显影5分钟，用水漂洗X-光片数次，然后把X-光片转移入定影液中定影10-20分钟。曝光完毕即可得到有清晰HSP70条带的X-光片，流水冲洗5分钟，悬挂晾干。
蛋白印迹检测结果见图2中的图A(N正常对照组，VT赋形剂处理组，GTGGA处理组，HT热休克处理组)，口服GGA后6小时即可见大鼠LGN部位HSP70的表达量升高，24h时达高峰，48h时明显降低；热休克处理后12h时可见大鼠LGN部位HSP70明显表达，24和48h时表达量下降，但仍显著高于正常水平；对照组和赋形剂给药组的LGN部位未见HSP70表达量改变。
对上述蛋白印迹检测结果应用Gel-Doc凝胶成像系统中的Quantity One图像分析软件进行半定量分析，得出X-光片上HSP70条带的密度值，以正常对照组的蛋白表达量为1，以与对照组HSP70条带的密度值的比值表示各实验组HSP70蛋白表达量；以β-actin为内参的蛋白印迹结果先测出X-光片上HSP70和相应的β-actin条带的密度值，以β-actin为内参，计算出各组HSP70表达量(HSP 70条带的密度值/相应的β-actin条带的密度值)，然后再以正常对照组的蛋白表达量为1，以与对照组HSP70条带的密度值的比值表示各实验组HSP70蛋白表达量。将试验数据用方差分析进行统计学处理(SPSS11.5软件)，组间比较应用q检验，结果以x±s表示，p＜0.05为差异有显著性意义。HSP70蛋白表达量见图2中的图B，与N(正常对照组1)相比VT(赋形剂处理组)、GT(GGA处理组)和HT(热休克处理组)在处理后6h、12h、24h、48h时大鼠LGN部位HSP70的蛋白表达量分别为赋形剂组(1.13±0.10)、(1.01±0.24)、(0.98±0.14)、(1.05±0.23)；GGA组(4.19±0.39)*、(7.24±0.40)*、(17.28±0.32)*、(2.53±0.37)*；热处理组(0.99±0.05)、(15.01±0.52)*、(11.18±0.47)*、(9.12±0.48)*(*p＜0.01)。上述实验结果表明GGA可诱导HSP70在LGN部位表达，使得通过安全、简便的方式诱导内源性保护机制进行中枢保护成为可能。HSP70在GGA用药后24小时达高峰，48小时时明显降低。
2、GGA诱导大鼠LGN部位HSP70表达的剂量曲线检测用GGA诱导大鼠LGN部位HSP70表达的剂量曲线，具体方法为将实验大鼠随机分为0(对照)、100、200、400、800(单位mg/kg)GGA剂量组(各剂量组n＝6)，全部大鼠于给药(给药方法见步骤1)后24小时迅速断头处死，取脑，分离双侧LGN核，液氮内冻存，用于蛋白印迹检测，检测方法及统计学分析方法与步骤1相同，其中，蛋白印迹检测时以一抗以β-actin单克隆小鼠抗体为量参，即将用于检测GGA诱导HSP70表达的剂量曲线的膜置于剥脱液(62.5mM Tris·Cl(pH 6.7)，100mM2-巯基乙醇，2％SDS)中55℃孵育30-60min后，重新与β-actin单克隆小鼠抗体(1∶1000)进行杂交反应，其余步骤相同。
蛋白印迹检测结果见图3中的图A，HSP70的表达量随着给予GGA剂量的增加而增加，以400mg/kg和800mg/kg两组最显著。
半定量及统计分析结果见图3中的图B，与对照组相比，不同剂量GGA诱导大鼠LGN部位HSP70蛋白的表达量为(4.19±0.39)*、(11.33±0.52)*、(17.20±0.45)*、(17.00±0.14)*(*p＜0.01)。100或200mg/kg和400或800mg/kg之间分别比较差异有显著性意义(#p＜0.01)，400mg/kg和800mg/kg剂量组之间HSP70的表达差异无显著性意义。
上述实验结果表明GGA可诱导HSP70在LGN部位表达，400mg/kg和800mg/kg GGA剂量组诱导HSP70的量显著高于其它组，但两组之间无显著性差异。另外，根据人治疗胃溃疡的标准剂量按体面积换算出大鼠的用量为396.25mg/kg，极其接近400mg/kg，因此将400mg/kg/d作为优选的GGA给药剂量。
二、免疫组织化学法检测口服赋形剂、GGA或热休克处理后大鼠LGN部位HSP70的分部情况免疫组织化学法检测口服赋形剂、GGA或热休克处理后大鼠LGN部位HSP70的分部情况。实验大鼠随机分为2组N组(正常对照组，n＝6)和T组(处理组)；T组又分为VT组(赋形剂给药组)、GT组(GGA给药组，400mg/kg)和HT组(热休克处理组)。给药及热休克处理方法与步骤一相同。与上述处理后24小时时深度麻醉大鼠，左心室升主动脉插管，快速灌注生理盐水，右心耳剪开放血，待流出液体清亮后，再灌注4％多聚甲醛固定液(称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500-800mL 0.1mol/L PBS(NaCl 0.8g，KCl 0.2g，KH2PO40.24g，Na2HPO41.44g，依次溶于900mL蒸馏水中，溶解后，将pH值调至7.5，后加水至1000mL)，加热至60℃左右，持续搅拌(或磁力搅拌)使粉末完全溶解，通常需滴加少许1mol/L NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PBS于1000mL，充分混匀)300mL，取整脑，制备上丘和LGN位置的石蜡切片进行免疫组织化学染色，包括以下步骤(1)60℃烤箱中烤片2小时后将切片放入二甲苯中脱腊2次，每次15分钟。
(2)用100％、95％、85％、75％梯度酒精脱苯。各级为2-5分钟。蒸馏水冲洗2次，每次5分钟。
(3)用3％H2O2封闭内源性过氧化物酶，15分钟，避光。蒸馏水冲洗，0.1M PBS(pH7.5)洗5分钟(4)将玻片置于盛有PBS的玻片盒中，微波修复(95℃，5分钟)，自然冷却至室温。10％正常山羊血清室温封闭15min，倾去血清，勿洗。
(5)HSP 70单克隆小鼠抗体(1∶100)湿盒中4℃过夜，用PBS代替一抗孵育的切片作阴性对照。
(6)次日，PBS洗切片，3×5分钟。滴加生物素化的抗小鼠的IgG(购自吉泰生物科技公司)工作液，室温孵育1小时。PBS洗切片3次，每次5分钟。
(7)滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液(购自自吉泰生物科技公司)，室温孵育30分钟。PBS洗切片3次，每次5分钟。
(8)用新配制的DAB(DAB 6g，PBS 10mL，30％H2O210mL，充分混匀)，光镜下显色。用自来水充分冲洗，苏木素复染细胞核。
(9)100％、95％、85％、75％梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶(北京市北郊化工厂)封片，显微镜下观察并照相。
免疫组织化学染色结果如图4所示(正常对照组(A)，赋形剂处理组(B)，GGA处理组(C)，热休克处理组(D)，标尺＝20μm)，正常对照组和赋形剂处理组未见明显HSP70阳性细胞，给予GAA 400mg/kg或热休克处理24小时后，在大鼠LGN组织切片可见散在分布的棕黄色HSP70阳性表达细胞(箭头所示)，进一步证明GGA可诱导HSP70在LGN部位表达。
实施例2、检测口服GGA对视神经切断后大鼠外侧膝状体的影响实施1中的实验证明口服GGA可诱导HSP70在LGN部位表达，但GGA诱导HSP70上调是否对视神经切断模型的LGN具有神经保护作用仍不明确，用微清白蛋白(Parvalbumin，PV)选择性地标记中继神经元(Yucel YH，Zhang Q，Gupta N，Kaufman PL，Weinreb RN.Loss of neurons in magnocellular and parvocellular layers of the lateralgeniculate nucleus in glaucoma.Arch.Ophthalmol 2000；118378-84.)，通过检测PV阳性细胞的分布情况及其数量和面积，并测定标志神经元内源代谢水平的线粒体细胞色素氧化酶(CCX)(Wong-Riley MT.Cytochrome oxidasean endogenousmetabolic marker for neuronal activity.Trends Neurosci.1989；1294-101.)的活性，检测GGA对视神经横断后LGN神经元的影响，具体实验如下一、免疫组织化学法检测大鼠外侧膝状体PV的分部情况随机将大鼠分为N(正常对照组)、T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)、T+G(视神经切断加GGA治疗组，400mg/kg/d)、T+H(视神经切断加热休克处理组)，各组n＝12。于术前24小时给药，手术后每天一次，持续28天；热休克处理组于术前24小时一次，手术后每隔一周一次，持续28天，给药及热休克处理方法与实施例1相同，视神经切断方法如下(Clarke DB，Bray GM，Aguayo AJ.Prolonged administration of NT-4/5fails to rescue most axotomized retinalganglion cells in adult rats.Vision Res.1998；381517-24.)①用水合氯醛(40mg/100g体重)腹腔麻醉大鼠，消毒铺巾；②沿左眼上眶缘剪开皮肤，钝性分离软组织至泪腺，将泪腺大部分剪除，继续分离至上直肌，断上直肌后，钝性向后分离，暴露视神经起始部及视神经；③纵行挑开视神经外膜，在距离视神经起始部约1mm的位置完全剪断视神经，整个过程要避免损伤位于视神经下方的视网膜中央动脉；④眼球复位，缝合创口，用盖玻片压平角膜观察眼底血供。涂抗生素眼膏，手术完毕。检查术后大鼠眼底，见图5(A正常眼底，B视神经切断后眼底)，将存在持续性视网膜缺血的大鼠剔除。
大鼠于上述处理后28天时，深度麻醉，各组分别取6只大鼠，左心室升主动脉插管，快速灌注生理盐水，右心耳剪开放血，待流出液体清亮后，再灌注4％多聚甲醛固定液300mL，取整脑放入4％多聚甲醛固定液中4℃固定12-24小时，石蜡包埋，在LGN处每间隔约200um，作厚度为7um的连续切片，共6张，用于免疫组化分析。大鼠的LGN主要分为dLGN(Dorsal lateral geniculate nucleus，外侧膝状体背侧核)、vLGN(Ventral lateral geniculate nucleus，外侧膝状体背侧核)和IGL(Intergeniculate leaf，中间层)三部分，位置示意图见图8(Paxinos G，WatsonC.The rat brain in stereotaxic coordinates，Academic，San Diego，Ca，1986)。现用免疫组织化学染色的方法检测上述不同处理组大鼠外侧膝状体PV在dLGN、vLGN和IGL分部情况，一抗为PV单克隆小鼠抗体(按1∶200比例稀释，美国AffinityBioReagents公司)，二抗为生物素化的抗小鼠的IgG(购自吉泰生物科技公司)工作液，三抗为辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液(购自自吉泰生物科技公司)，具体步骤参见实施例1，以0.1mol/L PBS代替一抗孵育液，用相同方法制备的切片作为阴性对照。
免疫组化染色结果表明PV细胞主要分布于LGN的dLGN和vLGN中，PV阳性细胞经染色呈深棕色，胞体形态不一，胞核淡染，部分细胞突起明显，大鼠双侧dLGN和vLGN部位的PV阳性细胞的分布情况如图6、图7所示(手术同侧A、C、E、G、I；手术对侧B、D、F、H、J。A-B正常对照组；C-D视神经切断组；E-F视神经切断加赋形剂治疗组；G-H视神经切断加GGA治疗组；I-J视神经切断加热休克处理组。标尺＝10μm)，两者相比较，vLGN中的PV阳性细胞数量较多。
二、dLGN、vLGN手术同侧及对侧的PV阳性细胞数及其面积分析步骤一的免疫组化染色结果表明dLGN和vLGN两部位中PV阳性细胞的表达数量差异很大，故分别进行数据处理在高倍镜下对定位在dLGN、vLGN手术同侧及对侧的PV阳性细胞进行计数，计算出每mm2细胞数，并应用Leica Qwin图像分析软件进行LGN细胞面积测量，求得平均神经元大小。同时对试验数据应用方差分析进行统计学处理(SPSS11.5软件)，组间比较应用q检验，结果以x±s表示，p＜0.05为差异有显著性意义。
其中，手术同侧dLGN中PV阳性细胞表达数量的定量分析结果见图9A所示(#p＜0.01)，N(正常对照组)、T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)手术同侧dLGN中的PV阳性细胞数依次为(55.24±3.32/mm2)、(44.33±3.83/mm2)*、(43.33±.27/mm2)*、(51.33±3.26/mm2)**、(50.83±2.86/mm2)**(与对照组相比*p＜0.01，**p＜0.05)，T+G(视神经切断加GGA治疗组)和T+H(视神经切断加热休克处理组)同侧dLGN中的PV阳性细胞数较T(视神经切断组)和T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。手术同侧dLGN中PV阳性细胞面积的定量分析结果见图9B所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H组手术同侧dLGN中的PV阳性细胞面积依次为(180.437±38.93/μm2)、(140.582±17.924/μm2)*、(141.439±13.381/μm2)*、(161.282±21.257/μm2)**、(160.830±25.269/μm2)**(与对照组相比*p＜0.01，**p＜0.05)，T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)同侧dLGN中的PV阳性细胞面积较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。
手术对侧dLGN中PV阳性细胞表达数量的定量分析结果见图10A所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H组手术对侧dLGN中的PV阳性细胞数依次为(55.24±3.32/mm2)、(40.666±2.50/mm2)*、(41±2.607/mm2)*、(49.16±4.91/mm2)*、(48.5±3.209/mm2)*(与对照组相比*p＜0.01)，T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)对侧dLGN中的PV阳性细胞数较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。手术对侧dLGN中PV阳性细胞面积的定量分析结果见图10B所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H组手术对侧dLGN中的PV阳性细胞面积依次为(180.437±38.93/μm2)、(134.54±17.150/μm2)*、(134.112±11.203/μm2)*、(160.837±24.711/μm2)*、(158.112±21.198/μm2)*(与对照组相比*p＜0.01)，T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)对侧dLGN中的PV阳性细胞面积较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。
手术同侧vLGN中PV阳性细胞表达数量的定量分析结果见图11A所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H组手术同侧vLGN中的PV阳性细胞数依次为(325.16±6.79/mm2)、(302±9.89/mm2)*、(303.83±11.44/mm2)*、(314.66±8.59/mm2)**、(314.33±5.16/mm2)**(与对照组相比*p＜0.01；**p＜0.05)，T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)同侧vLGN中的PV阳性细胞数较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。手术同侧vLGN中PV阳性细胞面积的定量分析结果见图11B所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H组手术同侧vLGN中的PV阳性细胞面积依次为(192.997±46.851/μm2)、(151.160±18.627/μm2)*、(151.010±16.682/μm2)*、(173.375±18.035/μm2)、(172.082±24.805/μm2)**(与对照组相比*p＜0.01；**p＜0.05)，T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)对侧dLGN中的PV阳性细胞面积较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。
手术对侧vLGN中PV阳性细胞表达数量的定量分析结果见图12A所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H组手术对侧vLGN中的PV阳性细胞数依次为(325.16±6.79/mm2)、(302.66±9.309/mm2)*、(303±11.436/mm2)*、(312.33±4.546/mm2)*、(312.33±4.457/mm2)*(与对照组相比*p＜0.01)。T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)对侧vLGN中的PV阳性细胞数较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。手术对侧vLGN中PV阳性细胞面积的定量分析结果见图12B所示(#p＜0.01)，N、T、T+V、T+G和T+H组手术对侧vLGN中的PV阳性细胞面积依次为(192.997±46.851/μm2)、(130.825±9.083/μm2)*、(135.153±12.880/μm2)*、(168.803±24.027/μm2)、(167.796±27.106/μm2)**(与对照组相比*p＜0.01)，T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)对侧dLGN中的PV阳性细胞面积较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。
与对照组相比，视神经切断后LGN中继神经元数目减少，而GGA给药组和热休克处理组的中继神经元数目较单纯手术组和口赋形剂组升高，且视神经切断后LGN中不仅中继神经元的数量减少，细胞的面积也减小，GGA给药组和热休克处理组的中继神经元的面积较单纯手术组和口赋形剂组增大，表明GGA对视神经切断造成的LGN损伤具有保护作用。
三、检测大鼠外侧膝状体内线粒体细胞色素氧化酶活性细胞色素氧化酶存在于线粒体内膜，是呼吸链的终端酶，在ATP生成过程中起决定性作用。神经元是高度分化的高能耗细胞，富含线粒体。脑组织的高能磷酸化合物形成主要依赖葡萄糖的有氧分解，而生物体90％分子氧的消耗过程都在线粒体细胞色素氧化酶(CCX)处完成，所以，CCX在保证脑神经元正常能量代谢、维持其正常功能的过程中起到重要作用，且CCX活力与神经元的活性呈正相关，是神经元内源代谢的标志。口服GGA诱导LGN部位线粒体细胞色素氧化酶活性升高，以检测GGA是否对视神经切断造成的LGN的损伤具有保护作用。
用与步骤一相同的方法进行实验分组及处理，处理后28天时，对大鼠进行深度麻醉，各组分别取6只大鼠，断头处死大鼠，用线粒体提取试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)并按照试剂盒说明书提取脑线粒体，并用BCA法测定线粒体浓度。
1、建立线粒体蛋白浓度测定标准曲线浓度测定前需要建立线粒体蛋白浓度测定标准曲线，方法为用与实施例1相同的方法建立线粒体蛋白浓度测定标准曲线取Eppendorf管17个，按表2进行编号和配液。配好后，置于37℃水浴箱中温浴30分钟，然后用BCA分析试剂盒和紫外分光光度计内定量程序，绘制一线粒体蛋白浓度标准曲线(见图13)，备用。
表2线粒体蛋白浓度标准曲线液体配制
2、细胞色素C氧化酶活性测定测定上述各组大鼠脑线粒体浓度后，用细胞色素C氧化酶分析试剂盒(美国sigma公司)测定其中的细胞色素C氧化酶(CCX)活性，具体方法为先将0.95mL分析缓冲液加入比色杯，进行分光光度计调零。然后，加适量酶或线粒体混悬液和1×酶稀释缓冲液使总液量达到1.05mL，并混匀。加入50μl还原型亚铁细胞色素C溶液，混匀，反应开始。5秒钟后开始测量。每间隔10秒分光光度计自动测量一次，共六次，记录数据。最后根据sigma公司提供的下述公式〔式I，ΔA表示A/min(样品)-A/min(空白)，dil表示酶或样品的稀释因子〕计算酶活性，以对照组CCX活性为100％，以百分数表示各实验组CCX活性量。试验数据应用方差分析进行统计学处理(SPSS11.5软件)，组间比较应用q检验，结果以x±s表示，p＜0.05为差异有显著性意义。
式I大鼠手术同侧膝状体部位CCX活性检测结果见图14A(#p＜0.01)，与N(正常对照组100％)相比，T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)、T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)手术同侧LGN中的CCX活性水平分别为(57.07±2.85)％*、(57.24±3.84)％*、(88.36±2.41)％*、(87.36±3.72)％*，差异有显著性意义(*p＜0.01)。组间比较T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)同侧LGN中的CCX活性较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。
大鼠手术对侧膝状体部位CCX活性检测结果见图14B(#p＜0.01)，与N(正常对照组100％)相比，T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)、T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)手术对侧LGN中的CCX活性依次下降(47.17±4.00)％*、(47.46±1.44)％*、(74.10±4.50)％*、(72.77±4.07)％*，差异有显著性意义(*p＜0.01)。组间比较T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)对侧LGN中的CCX活性较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(#p＜0.01)。
上述实验结果表明视神经切断后LGN细胞色素氧化酶活性明显下降，提示LGN神经元的活性降低，GGA给药组和热休克处理组的LGN细胞色素氧化酶活性明显升高，进一步说明GGA对视神经切断造成的LGN损伤具有保护作用。
实施例3、检测口服GGA对大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞的影响青光眼导致视功能损伤的病理基础是视网膜神经节细胞(RGCs)进行性死亡和视神经纤维丢失，RGC的死亡常导致视功能发生不可逆性损害，因此，青光眼治疗的关键在于阻止视神经损害，保护视功能。实施例2的实验证明GGA对视神经切断造成的LGN损伤具有保护作用，但GGA是否也能对由视神经切断诱导的RGCs损伤起到保护作用，现用下述实验检测口服GGA对大鼠视神经切断后RGCs的影响。
一、检测口服GGA对大鼠视网膜HSP70表达的影响将实验大鼠随机分为4组N(正常对照组)、V(赋形剂处理组)、G(GGA处理组，400mg/kg)和H(热休克处理组)，各组n＝6。大鼠于给赋形剂、GGA或热休克处理后24小时迅速断头处死，取眼球，分离双眼视网膜，液氮内冻存，用蛋白印迹法检测大鼠视网膜HSP70表达情况，并对HSP70表达水平进行半定量分析，具体实验方法见实施例1。
大鼠视网膜HSP70表达水平的蛋白印迹结果见图15中的图A，大鼠口服GGA或热休克处理后24小时可见视网膜HSP70表达升高。大鼠视网膜HSP70表达水平的半定量分析结果见图15中的图B，与正常组相比(N∶1)，V(赋形剂处理组)、G(GGA处理组，400mg/kg)和H(热休克处理组)视网膜中HSP70的表达量分别为(0.96±0.12)、(12.31±0.68)*、(11.82±0.75)*(*p＜0.01)。
上述实验结果表明口服GGA可以安全、有效地诱导HSP70在视网膜的表达，从而对RGCs起到保护作用。
二、检测口服GGA对大鼠视神经切断后视网膜神经节细胞的影响1、FG逆行标记法计数大鼠视网膜神经节细胞随机将大鼠分为5组N(正常对照组)、T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)、T+G(视神经切断加GGA治疗组，GGA 400mg/kg)、T+H(视神经切断加热休克处理组)。于术前24小时给药，以后每天一次。热休克处理于术前24小时一次，以后每隔一周一次。具体给药及处理方法见实施例1。视神经切断模型的建立方法为水合氯醛(40mg/100g体重)腹腔麻醉，消毒铺巾，沿左眼上眶缘剪开皮肤和软组织，暴露视神经起始部及视神经，纵行挑开视神经外膜，在距离视神经起始部约1mm的位置完全剪断视神经，在手术剪断视神经的同时于眶侧断端留置一小块浸有50g/L的FG(Flurogold，荧光金，美国Affinity公司)的明胶海绵(北京化学试剂公司)，切口复位，缝合。整个手术过程要避免损伤位于视神经下方的视网膜中央动脉。
对上述各组大鼠的RGCs进行FG逆行标记法逆行标记的方法为动物麻醉后，固定大鼠于立体定位仪(日本Narishige公司)上，耳间颅顶正中线垂直切开头皮，分离暴露颅骨矢状缝和人字缝，找到Bregma点，根据大鼠脑立体定位图谱确定双侧上丘)，每侧上丘注射两点(前囟后-5.9mm和-6.4mm，旁开1.4mm，深0.4mm)，每点注射1.5μl。彻底止血，分层缝合颅骨膜、腱膜和皮肤。处理后14天时，各组取6只大鼠，麻醉处死动物后取眼球，浸入40g/L的多聚甲醛溶液避光后固定1小时。经PBS漂洗3次后沿角膜缘剪除角膜，分离视网膜，平铺于载玻片上，在视网膜周边做几处小切口便于平伏，最后用Vectashield(Vector公司)封片。
上述各组大鼠RGCs的FG逆行标记结果如图16A所示(A-E图分别为N(正常对照组)、T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)、T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)，标尺＝30μm)，可见FG逆行标记能很好地将大鼠视网膜神经节细胞标记出来，标记均匀清楚。
在荧光显微镜下对上述各组大鼠的RGCs进行计数，具体方法为以视盘为中心在通过视乳头的坐标轴上，分别在视网膜鼻上、鼻下、颞上、颞下距取中心1mm(后部)，2mm(中周)，3mm(周边)处，同一显微镜视场高倍视野(400×)下，手工计数每一视野中的RGCs数(Caprioli J，Ishii Y，Kwong JM.Retinal ganglion cellprotection with geranylgeranylacetone，a heat shock protein inducer，in a ratglaucoma model.Trans.Am.Ophthalmol Soc.2003；10139-50.)。圆形胞体、直径超过8Lm为RGCs，而形态不规则的、直径较小的为小胶质细胞，不予计数(Cheng L，Sapieha P，Kittlerova P，Hauswirth WW，Di PA.TrkB gene transfer protectsretinal ganglion cells from axotomy-induced death in vivo.J.Neurosci.2002；223977-86.)，以对照组RGCs数目为100％，以百分数表示各实验组RGCs的存活量，同时对计数结果进行统计学分析。
RGCs计数及统计学分析结果如图16B所示(#p＜0.01)，与N(正常对照组100％)相比，T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)、T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)视网膜中的RGCs存活量(11.33±0.99)％*、(11.39±0.39)％*、(46.16±4.10)％*、(47.91±1.67)％*，差异有显著性意义(*p＜0.01)。组间比较T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)视网膜中的RGCs存活量较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。
研究表明RGCs通常于视神经切断后4-5d开始死亡，随手术后时间延长，RGCs数目不断减少，RGCs数目在手术后7d约为正常数的50％，手术后14d时约90％的RGCs死亡(Cheng L，Sapieha P，Kittlerova P，Hauswirth WW，Di PA.TrkB gene transferprotects retinal ganglion cells from axotomy-induced death in vivo.J.Neurosci.2002；223977-86.)。上述实验结果表明视神经切断后RGCs的数量约是正常对照组的11.3％，与现有研究结果一致，而GGA给药组和热休克处理组视神经切断后的RGCs的数量较单纯视神经切断和神经切断加赋形剂组显著增多，证明GGA对RGCs具有保护作用。
2、dUTP缺口末段标记法检测视网膜神经节细胞的凋亡情况研究表明切断视神经可诱发大量RGCs凋亡，实施例1的实验也对此得到了进一步的验证，但导致凋亡的原因仍不清楚，研究表明可能与以下原因相关靶源性神经营养因子的中断、兴奋性氨基酸过度释放、氧自由基及NO(nitric oxide，一氧化氮)等对神经元的毒性作用，此外，神经元自身的状态也可影响神经元的存活；受损的RGCs对靶源性神经营养因子的反应性降低可能也是RGCs凋亡的原因之一(Marcic TS，Belyea DA，Katz B.Neuroprotection in glaucomaa model for neuroprotectionin optic neuropathies.Curr.Opin.Ophthalmol 2003；14353-56.)，现用TdT介导的dUTP缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPnick-end labeling)检测视神经切断后视网膜神经节细胞地凋亡情况。
用与步骤1相同的方法进行实验分组及处理，各组大鼠于处理后7天时深度麻醉，左心室升主动脉插管，快速灌注生理盐水，右心耳剪开放血，待流出液体清亮后，再灌注4％多聚甲醛300mL，取眼球放入4％多聚甲醛4℃过夜，石蜡包埋，制备经过视神经的4μm石蜡切片，对其进行TUNEL染色(TUNEL试剂盒，德国Roche公司)并统计RGCs细胞凋亡数，具体方法包括以下步骤(1)切片常规脱蜡，入水；(2)擦干样品周围的水分，加蛋白酶K(20μg/mL溶于Tris·HCL中，pH7.4-8.0)50μl/片，室温放置湿盒中10分钟；(3)PBS液终止反应，洗3次，每次5min；(4)加TUNEL反应混合物(试剂1和试剂2的混合物，试剂盒自带)50μl/片，混匀后加样品片上，置于湿盒中，室温标记60分钟；(5)PBS液终止反应，洗3次，每次5min；(6)擦干样品周围的水分，加转化剂-POD液50μl/片，室温反应30分钟；(7)PBS液终止反应，洗3次，每次5min；(8)用新鲜配制的0.03％H2O2-0.5mg/mL DAB显色10分钟左右，显微镜下观察显色情况；
(9)苏木素复染；(10)脱水，透明，常规封片，镜检。
细胞凋亡结果判断标准凋亡阳性为胞浆和(或)胞膜棕褐色染色，计数每张切片中凋亡RGCs数，每个视网膜计数3张切片(n＝6)，计算RGCs凋亡细胞总数，求得平均每张切片的RGCs细胞凋亡数，并对试验数据应用方差分析进行统计学处理(SPSS11.5软件)，组间比较应用q检验，结果以x±s表示，p＜0.05为差异有统计学意义。
RGCs的TUNEL染色结果如图17A所示(A-E图分别为N(正常对照组)、T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)、T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)，标尺＝10μm)，TUNEL阳性细胞为胞浆和(或)胞膜棕褐色染色。统计分析结果如图17B所示(#p＜0.01)，T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)、T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)视网膜中凋亡细胞数分别是(42.28±5.15)*、(39.83±5.63)*、(21.56±4.12)*、(20.72±3.27)*，差异有显著性意义(*p＜0.01)。与N(正常对照组)相比(1±0.69)相比差异有显著性意义(*P＜0.01)。组间比较T+G(视神经切断加GGA治疗组)、T+H(视神经切断加热休克处理组)视网膜中凋亡细胞数较T(视神经切断组)、T+V(视神经切断加赋形剂治疗组)显著降低，差异具有显著性意义(p＜0.01)。
上述实验结果表明GGA给药组和热休克处理组的RGCs胞凋亡的数量较单纯手术组和口赋形剂组减少，进一步证明GGA或热休克处理对RGCs具有保护作用，原因可能与HSP70对细胞凋亡的抑制作用相关。
实施例4、GGA治疗青光眼的临床试验对已确诊为早、晚期青光眼的患者服用GGA后进行初步临床观察，包括疗效及不良反应等，先后对青光眼早期和晚期患者进行观察，并进行了初步分析，结果表明，本发明多肽化合物对早、晚期青光眼的均有较好的疗效，其中对早期的疗效尤为突出，且未见明显不良反应。
权利要求
1.替普瑞酮在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了替普瑞酮在制备预防和/或治疗青光眼药物中的新用途。动物实验结果表明口服GGA可有效诱导外侧膝状体和视网膜中HSP70表达，并对大鼠视神经切断后LGN神经元和RGCs胞具有保护作用，效果显著。与目前临床上常用的青光眼治疗性药物相比，本发明的药物具有以下优点1)疗效明显，总有效率可达92.5％以上；2)安全性高；3)主要用药途径为口服，用药方便；4)GGA价格低廉，制备该药物的成本较低，从而可减轻病人的经济负担。本发明不仅为青光眼的防治提供一条新的途径，也对神经系统疾病及进行性神经系统损伤性疾病的治疗及研究具有借鉴作用，在医药学领域的应用前景广阔。
文档编号A61P27/06GK1903188SQ200610089109
公开日2007年1月31日 申请日期2006年8月3日 优先权日2006年8月3日
发明者王宁利, 赵丽, 姜利斌, 李俊发, 卢青君, 李辽青, 范尔钟, 王玲, 王怀洲, 王春芳, 龙彩霞, 韩松, 李爱琴, 卢弘, 陈凤华 申请人:首都医科大学附属北京同仁医院