专利名称：肖菝葜属植物提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肖菝葜属植物提取物及其制备方法和应用，具体地说，是含有酚苷、黄酮苷的肖菝葜属植物提取物及其制备方法和应用，以及含有该提取物的药物组合物，本发明尤其指的是原植物为肖菝葜属植物的白土苓药材提取物。
背景技术：
土茯苓为常用中药，来源为菝葜属植物土茯苓。《本草纲目》记载“土茯苓有赤白两种，入药用白者良”。土茯苓为李时珍所指的赤者，也就是说，上述土茯苓中的赤者实质上为真正土茯苓。药理研究结果表明土茯苓及同属植物的乙酸乙酯提取物对心血管系统有一定的保护作用，水提取物具有免疫调节作用，此外土茯苓还有抗菌、抗肿瘤等多种功效；而白者其实为白土茯苓，民间习称白土苓，在很多地区常作为土茯苓的代用品，白土苓来源可分为肖菝葜属植物肖菝葜、短柱肖菝葜或华肖菝葜，或者是三个品种的混合物，相对土茯苓而言，针对白土苓开展的化学及药理研究则显得相对较少。
已有的化学成分研究表明，土茯苓中含有皂苷类、黄酮(苷)、苯丙素类、甾醇类等化合物，而对于白土茯苓，目前仅有对肖菝葜的脂溶性成分进行的化学成分的研究报道。由于对白土苓的基础研究较少，有些处方只是注明成分含有肖菝葜属植物的白土苓，但也仅仅在质量标准中仅收载了对白土苓采用薄层色谱与对照药材进行对照的笼统的定性鉴别，缺少定量控制指标，造成白土苓在用药和制剂中化学成分复杂，不易进行质量监控。
发明内容
本发明人通过大量的试验研究，得到了肖菝葜属植物(肖菝葜、短柱肖菝葜或华肖菝葜)的有效部位，该提取物是肖菝葜属植物粗提物经过精制而制得，其中有效成分明确，含量较高，达到了明确肖菝葜属植物(尤其是白土苓)有效部位的组成和含量、并可大辐降低服用量的目的，从而提高了生物利用度，并且研究了肖菝葜属植物的抗肿瘤活性的药理药效。
本发明的目的在于提供一种肖菝葜属植物提取物，其由常规提取以及有针对性的精制方法制得，该提取物成分明确，具有明显的抗肿瘤的活性。
本发明的目的还在于提供肖菝葜属植物提取物的制备方法，该方法包括提取精制过程，尤其是采用依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂萃取和大孔吸附树脂进行有效成分的富集等技术，使得肖菝葜属植物提取物中有效成分明确、含量高、杂质少，更有利于其在抗肿瘤制剂上的应用。
本发明提供了一种肖菝葜属植物提取物，其中以该提取物的总重量计，其至少含有酚苷10％，黄酮苷10％，所述酚苷包括4-羧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羧基-2，6-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羟基-3，5-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羟基-3，5-二甲氧基-苯甲酸-葡萄糖苷等，所述黄酮苷包括芒果苷，橙皮苷，等色原酮，酮和二氢黄酮苷等。
其中用高效液相色谱法测得黄酮苷中橙皮苷的重量含量至少为0.5％，优选1-5％。
经过药理试验测试，本发明的含有上述成分的提取物具有明显的抗肿瘤活性，尤其对lewis肺癌、肝癌H-22和肉瘤S-180均具有显著的抑制作用。
在本发明优选实施例中，具有抑制肿瘤效果的提取物其由以下方法制得(1)将肖菝葜属植物用至少2倍量的10-95％浓度醇提取，得到提取液；(2)提取液浓缩得浓缩液，加水使其混悬；(3)静止，滤过，取滤液备用；(4)取上述滤液，上大孔树脂柱，以水洗脱至洗脱液糖反应为阴性，弃去水洗脱液；(5)以浓度不超过90％的醇洗脱，洗脱液浓缩，即得。
以提取物总重计，肖菝葜属植物提取物中至少含有酚苷10％，黄酮苷10％。其中酚苷优选为10％-90％，更优选40-60％；黄酮苷优选为10％-90％，更优选为40-60％；所述的肖菝葜属植物主要是指肖菝葜属植物肖菝葜、短柱肖菝葜或华肖菝葜，尤其是指白土苓。
由于本发明的提取物中所含有的有效成分为混合物，其所含有的经检测已经明确的有效化合物成分包括酚苷和黄酮苷等，至今没有文献公开报道肖菝葜属植物(包括肖菝葜、短柱肖菝葜或华肖菝葜)在治疗肿瘤方面有效成分的合理组成是什么，优选治疗量是多少，这样势必导致出现量效关系不容易把握、疗效不稳定等缺陷性特点，尤其对于适合治疗肿瘤的中药注射剂型来说，组成成分确切、含量准确更易于把握制剂质量。申请人发现，本发明的制备方法得到的提取物中确切的疗效化合物是(但不仅仅是)治疗有效量的酚苷和黄酮苷，于是本发明进行了大量的实验检测，结果证实，肖菝葜属植物提取物中黄酮苷的含量至少为10％，而且其中的橙皮苷的含量占黄酮苷总重的至少0.5％，其治疗效果是最佳的。
本发明还提供了一种肖菝葜属植物提取物的制备方法，其中包括将肖菝葜属植物用至少2倍量的10-95％浓度醇，提取得到提取液；将其浓缩得浓缩液，加水使其混悬；静置，滤过，取滤液备用；将上述滤液上大孔树脂柱，所述的大孔吸附树脂优选为可以去除糖类成分的吸附树脂，例如AB-8，D-101，HP-20等，优选DIALON HP-20，以水洗脱至洗脱液糖反应为阴性；以浓度不超过90％的醇洗脱即得。也可根据需要将洗脱液浓缩，减压干燥，得到提取物干燥成品。
上述制备方法，其中提取用的醇优选乙醇。
在大量的实验中，申请人发现，当提取用的醇浓度为10-75％时，所述制备方法中经过大孔吸附树脂的精制即可得到对肿瘤细胞有抑制作用初步的目标提取物，而当提取用醇的浓度超过70％，尤其是超过75％，则优选在大孔树脂吸附之前还包括用至少为0.5倍滤液重量的低极性溶剂、中等极性溶剂萃取除杂，所述的低极性溶剂为snyder参数ε0＜0.4的溶剂，中等极性溶剂为snyder参数0.4＜ε0＜0.6的溶剂，至少萃取一次，再用较高极性溶剂萃取有效成分，所述较高极性溶剂为snyder参数ε0＞0.6的溶剂，将较高极性溶剂的萃取液上大孔树脂柱。将较高极性的溶剂例如正丁醇的萃取液上大孔树脂柱，得到的提取物富集了对lewis肺癌、肝癌H-22和肉瘤S-180均具有明显抑制作用的活性成分，该提取物可以称为有效部位或有效成分的总和。
所述的低极性的溶剂为可以去除脂肪族成分的溶剂，优选snyder参数ε0＜0.4的低极性溶剂，其选自石油醚、乙醚、丙酮和异丙醇中至少一种；中等极性的溶剂为可以去除甾醇、萜类成分的溶剂，优选snyder参数0.4＜ε0＜0.6的中等极性溶剂，其为氯仿和/或乙酸乙酯；所述的较高极性的溶剂优选其snyder参数ε0＞0.6，主要为正丁醇。
上述制备方法中洗脱用醇的浓度为90％，收集的是90％以下浓度醇洗脱的成分(不包括水洗脱下来的成分)，但从尽可能去粗存精的的角度衡量，优选洗脱用醇的浓度为60％，收集60％以及浓度60％以下的醇洗脱的成分，更优选收集10％～60％的醇的洗脱液。
本发明方法中对肖菝葜属植物的乙醇(尤其是较高浓度的乙醇)提取物采用依次以石油醚、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂或溶剂组合萃取至少一次的好处在于，最大程度地除去脂溶性成分，尤其是70～95％浓度醇提取物，其中含有一些对抑制肿瘤来说属于杂质的脂溶性成分，更优选采用极性小的有机溶剂将其除去，综合考虑工业上生产的条件和设备要求，可以选择一些适用的有机溶剂，例如石油醚、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等分别进行萃取；而最终的试验证明，正丁醇萃取液中含有的是本发明欲得到的对lewis肺癌、肝癌H-22和肉瘤S-180等均具有明显抑制作用的有效成分，其效果优于不经过上述溶剂萃取得到的提取物的活性。
上述方法中的萃取用各溶剂的用量优选为被萃取液重量的3-5倍。
为了进一步得到更加精制的提取物，本发明还优选将上述得到的正丁醇萃取液浓缩后加水溶解，上大孔吸附树脂柱，先以水冲洗，除去糖类成分，再以30％乙醇洗脱，目的是将吸附于树脂柱的有效成分洗脱下来，所述的大孔吸附树脂为可以除去糖类物质的本领域公知的树脂，例如AB-8，D-101，HP-20等，优选DIALON HP-20。
本发明的提取精制方法与现有技术公开的土茯苓的提取方法相比，富集了包括白土苓药材在内的肖菝葜属植物提取物的有效部位，现有技术关于土茯苓的提取多是制备总皂苷，保留的是正丁醇萃取部位的成分。而本发明的目的和创新之处在于同时保留酚苷和黄酮苷，通过有机溶剂萃取和大孔树脂吸附，尽可能除去糖类和脂溶性成分，得到的提取物可以直接制备成药物制剂用于治疗和抑制肿瘤，对lewis肺癌、肝癌H-22和肉瘤S-180等均具有明显抑制作用，其抑制率分别为39.2％、30.9％和40％，其功效和安全性得到了最大限度的保证。
本发明以白土苓为例，其经过上述方法得到的有效部位的含量测定方法为分光光度法(例如紫外分光光度)法，操作步骤为标准曲线的绘制取橙皮苷对照品50mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。精密量取1，2，3，4，5，6ml，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。按照紫外分光光度法(中国药典2005年版一部附录V A)，在320nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法取本品10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。在320nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含黄酮苷(以橙皮苷计)的重量，计算，即得黄酮苷含量。
本发明还提供了一种药物组合物，其含有临床治疗有效量的肖菝葜属植物提取物和药物辅料，该药物临床推荐有效剂量为10-500mg/日，优选30-50mg/日。
上述药物组合物包括口服剂型和注射剂型。在上述药物中，以注射剂型为例，作为与有效部位配合使用的辅助成分，根据不同的具体注射剂，建议选用甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷或氯化钠中的至少一种。例如，对于冻干粉针剂，可采用常规的冷冻干燥法，以水为溶媒，取提取物加入适量支架剂冻干而成，建议选用甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷中的至少一种作为辅助的支架剂，与所说的提取物共同组成；其中优选甘露醇作为支架剂。对于可供直接使用的输液制剂形式的药物，则可以选用甘露醇、葡萄糖、氯化钠中的至少一种作为辅助成分；其中尤以采用氯化钠作为辅助成分为优选。对于制备小针剂注射液和大输液制剂时，可加入抗氧剂，抗氧剂可以是抗坏血酸、抗坏血酸钠、硫代硫酸钠和焦亚硫酸钠中的一种或几种，也可以加入金属螯合剂，如EDTA。口服制剂包括片剂(普通片剂、分散片、缓释、控释片、泡腾片、口崩片)、胶囊剂(硬胶囊、软胶囊、缓释、控释胶囊)、颗粒剂、滴丸、口服液、栓剂，均可选用常规辅料。
本发明还提供了上述含有肖菝葜属植物提取物的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明肖菝葜属植物提取物药效试验结果如下(肖菝葜属植物提取物以白土苓为例)，经过本发明的上述提取方法得到的白土苓提取物用X表示，常规不经过除去糖等杂质的白土苓醇水提取物以Y表示，其中Y含有糖类成分约80％，含有酚苷约2-5％、黄酮苷约2-5％和少量其他成分(杂质)如甾醇、萜类等。
对小鼠H-22肝癌生长的抑制作用样品X，褐色粘稠状，无明显气味，溶于水。
实验动物II级KM小鼠，雌，体重21～23g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
瘤原，H-22，单位传代保存。
动物饲养在IVC系统，温度22～27℃，相对湿度50～70％，自由摄取基础饲料，饮用纯净水。每周换窝两次，五只一笼。
试剂与设备注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号04053121；天平。
剂量设计环磷酰胺重复原设计100mg/kg；X.由于样品量微，未做LD50(最大耐受量)，故以5∶1设lg/kg，0.2g/kg，0.04g/kg，0.008g/kg四组。
方法选择肿瘤生长旺盛、无溃破、健康良好的荷瘤小鼠，脱臼处死，无菌操作取瘤，按瘤重1∶2加入生理盐水，制成细胞悬液，于左腋窝皮下接种0.2ml。
72只小鼠随机分为6组，空白对照组、阳性对照组、X1g组、X0.2g组、X0.04g组和X0.008g组，每组12只，雌雄各半。
接种24h后给药。空白对照组每天以生理盐水0.4ml/20g体重灌胃连续10天；X的1g组每天以0.02g/0.4ml/20g体重灌胃连续10天；0.2g组每天以0.004g/0.4ml/20g体重灌胃连续10天；0.04g组每天以0.008g/0.4ml/20g体重灌胃连续10天；0.008g组每天以0.0016g/0.4ml/20g体重灌胃连续10天。环磷酰胺组于接种24h后以100mg/kg(0.2ml/20g)一次性腹腔给药。
申请人同时也对常规提取方法得到的，即不经过除去糖等杂质的白土苓醇水提取物Y按照上述方法做以相同试验条件的药理实验，以验证未经除杂的提取物对小鼠H-22肝癌的生长抑制作用，结果表明，在等剂量下，含有多糖等成分的常规白土苓提取物对小鼠H-22肝癌的生长抑制几乎没有明显的作用，对比的实验数据未提供在上表中。
讨论1.空白对照组平均瘤重1.4g，大于1g；最小瘤重1.1g，均大于0.4g。移植瘤生长良好，试验成立。
2.通常使用环磷酰胺做阳性对照药的剂量是50mg/kg体重，腹腔注射，浓度为0.2ml/20g体重。对H-22的抑制率一般在50～60％。
3.X1g组，无论是抑瘤率还是t检验均表明该药对H-22有一定疗效。X0.2g组在给药四次后动物有中毒表现，随后停药。X0.04g组和X0.008g组均给药10次，其中X0.04g组抑瘤率为30％，与空白对照组比较(t检验)，P＝0.09，有显著性差异。
对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用样品X，褐色粘稠状，无明显气味，溶于水。
实验动物II级C57小鼠，雌雄各半，体重18～23g，由中国医科院血研所动物室提供，许可证号scxk(津)2004-0001；动物饲养在IVC系统，温度20～22℃，相对湿度40～58％，自由摄取基础饲料饮用纯净水。每周换窝两次，五只一笼。瘤原Lewis肺癌，中国医科院肿瘤所试验中心提供。
试剂与设备1.注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号04053121。
2.电子天平，T500型，d＝0.1g，美国双杰兄弟(集团)公司常州常熟双杰测试仪器厂生产。
剂量设计1.环磷酰胺按传统剂量50mg/kg。
2.由于在X对小鼠H-22抑瘤试验中，0.04g/kg体重组有效，0.008mg/kg体重组无效，1g/kg及0.2g/kg两组均出现中毒表现，故设0.08g/kg，0.04g/kg，0.02g/kg，三个剂量组。
方法选择肿瘤生长旺盛、无溃破、健康良好的荷瘤小鼠，脱臼处死，无菌操作取瘤，按瘤重1∶2加入生理盐水，制成细胞悬液，于左腋窝皮下接种0.2ml。
60只C57小鼠 随机分为5组，空白对照组、阳性对照组，X0.08g/kg组、X0.04g/kg组和X0.02g/kg组，每组12只，雌雄各半。
接种24h后给药。空白对照组每天以生理盐水0.4ml/20g体重灌胃连续8天；X0.08g/kg组每天以X0.016g/0.4ml/20g体重灌胃连续8天；X0.04g/kg组每天以F0.008g/0.4ml/20。体重灌胃连续8天；X0.02g/kg组每天以F0.004g/0.4ml/20g体重灌胃连续8天。环磷酰胺组于接种24h后以50mg/kg(0.2ml/20g)一次性腹腔给药。
讨论1.空白对照组平均瘤重1.76g，大于1g；最小瘤重1.22g，均大于0.4g。移植瘤生长良好，移植瘤模型成功。
2.环磷酰胺做阳性对照药的剂量是50mg/kg体重，腹腔注射，浓度为0.2ml/20g体重。对Lewis肺癌的抑制率为62.5％，与以往试验结果相近。
3.关于X0.08、0.04、0.02g/kg三个剂量组给药8天后均显示对Lewis肺癌有很好的抑制作用，与空白组比较均有显著性差异，而且抑瘤率均大于30％。
对小鼠S-180的生长抑制作用样品X，褐色粘稠状，无明显气味，溶于水。
实验动物II级C57小鼠，雌雄各半，体重18～23g，由中国医科院血研所动物室提供，许可证号scxk(津)2004-0001，动物饲养在IVC系统，温度20～22℃，相对湿度40～58％，自由摄取基础饲料饮用纯净水。每周换窝两次，五只一笼。瘤原Lewis肺癌，中国医科院肿瘤所试验中心提供。
试剂与设备1.注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号04053121。
2.电子天平，T500型，d＝0.1g，美国双杰兄弟(集团)公司常州常熟双杰测试仪器厂生产。
剂量设计1.环磷酰胺按我所传统剂量50mg/kg。
2.设0.2g/kg，0.04g/kg，0.008g/kg三个剂量组。
方法选择肿瘤生长旺盛、无溃破、健康良好的荷瘤小鼠，脱臼处死，无菌操作取瘤，按瘤重1∶2加入生理盐水，制成细胞悬液，于左腋窝皮下接种0.2ml。
60只C57小鼠 随机分为5组，空白对照组、阳性对照组，X0.08g/kg组、X0.04g/kg组和X0.02g/kg组，每组12只，雌雄各半。
接种24h后给药。空白对照组每天以生理盐水0.4ml/20g体重灌胃连续8天；给药组灌胃连续8天。环磷酰胺组于接种24h后以100mg/kg(0.2ml/20g)一次性腹腔给药。
讨论1.空白对照组平均瘤重1.76g，大于1g；最小瘤重1.22g，均大于0.4g。移植瘤生长良好，移植瘤模型成功。
2.环磷酰胺做阳性对照药的剂量是100mg/kg体重，腹腔注射，浓度为0.2ml/20g体重。对Lewis肺癌的抑制率为92.9％，与以往试验结果相近。
3.从各表中数据可以看出本发明的提取物具有抑制肿瘤的活性，并且与环磷酰胺比较其副作用显著降低，具有可开发的前景。
关于0.2、0.04两个剂量组给药8天后均显示对S-180肉瘤有很好的抑制作用，与空白对照组比较均有极显著性差异，而且抑瘤率均大于30％，尤其是X0.2组的抑瘤率大于40％。
本发明的药理实验中涉及的提取物按照实施例1的方法制得。
图1本发明提取物中分离的橙皮苷的氢—核磁共振图谱；图2本发明提取物中分离的橙皮苷的碳—核磁共振图谱。
具体实施例方式
以下实施例是为了更详细地说明本发明，并非对本发明构成限制。
实施例1肖菝葜属植物提取物取短柱肖菝葜的干燥根茎，切片，用8倍量95％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水适量使混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次，分别回收溶剂，得正丁醇部位(提取率约为原生药量的1％)；正丁醇部位的浸膏加水溶解，上大孔树脂柱(DIALON HP-20)，先以水冲洗，再以60％乙醇洗脱至洗脱液无色，即可(即，药理学研究中的X)。
经检测，该提取物中酚苷约为50％，黄酮苷约为50％；其中用高效液相色谱法测定，经过对图谱吸收峰的计算，得到黄酮苷中橙皮苷的重量含量约为2％。
经过化合物的分离和纯化，并且通过理化反应及波谱分析等方法，证实了上述酚苷包括4-羧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羧基-2，6-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羟基-3，5-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷，4-羟基-3，5-二甲氧基-苯甲酸-葡萄糖苷，所述黄酮苷包括芒果苷，橙皮苷，等色原酮，酮同和二氢黄酮苷。
分离和纯化方法如下取肖菝葜属植物(例如短柱肖菝葜)的干燥根茎饮片，用8倍量95％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水适量使混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次，回收溶剂，分别得石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。
正丁醇部位经大孔吸附树脂Diaion HP-20柱色谱，分别用水，10％，30％60％的乙醇梯度洗脱。按洗脱顺序分成四部分。
第一部分上LH-20凝胶柱，以水-甲醇梯度洗脱，于水洗脱流分中分别得到4-羧基-2，6-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷(180mg)和4-羟基-3，5-二甲氧基-苯基-1-O-葡萄糖苷(250mg)；10％甲醇洗脱流分中得到4-羟基-3，5-二甲氧基-苯甲酸-葡萄糖苷(350mg)、4-羧基-苯基-1-O-葡萄糖苷(220mg)；30％甲醇洗脱流分中得到一色原酮苷(120mg，结构待定)、甲醇洗脱流分中得到3，5，7，4’-四羟基-二氢黄酮-6-C-鼠李糖(1-4)葡萄糖苷(300mg)；第二部分上LH-20凝胶柱，以水-甲醇梯度洗脱，于90％甲醇洗脱流分中得到芒果苷(320mg)、甲醇洗脱流分中得到一酮苷，即1，3，6，7-四羟基酮-3-O-葡萄糖苷(200mg)；第三部分上LH-20凝胶柱，以水-甲醇梯度洗脱，于50％甲醇洗脱流分中得到橙皮苷(300mg)，将橙皮苷溶于二甲亚砜(DMSO)溶液中，经核磁共振的氢谱和碳谱分析(仪器的型号为INOVA-5001H-NMR和INOVA-50013C-NMR，谱图见图1和图2)，并与橙皮苷标准品的核磁共振图谱对照，证明测定的成分即为橙皮苷。
第一部位富集成分均属于酚苷和黄酮苷类，计算其含量为占提取物总重的50％；第二、三部分富集的成分属于黄酮苷，计算其含量占提取物总重50％。
实施例2肖菝葜属植物提取物取肖菝葜的干燥根茎(10千克)，切片，用8倍量90％乙醇回流提取4次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水适量使混悬，依次用乙酸乙酯、正丁醇1倍量，各萃取3次，分别回收溶剂。得正丁醇部位，正丁醇部位的浸膏加水溶解，上大孔树脂柱(DIALON HP-20)，先以水冲洗，再以60％乙醇洗脱至洗脱液无色，即可(即，药理学研究中的X)。
经检测，该提取物中酚苷含量约为45％，黄酮苷含量约为55％。其中用高效液相色谱法测定，得到黄酮苷中橙皮苷的重量含量约为3％。
实施例3肖菝葜属植物提取物取华肖菝葜的干燥根茎，切片，用8倍量40％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水适量使混悬，静置24小时；滤过，滤液上大孔树脂柱(DIALON HP-20)，先以水冲洗，再以60％乙醇洗脱至洗脱液无色，回收溶剂即可。
经检测，该提取物中酚苷含量约为50％，黄酮苷含量约为50％。
其中用高效液相色谱法测定，得到黄酮苷中橙皮苷的重量含量约为3.5％。
实施例4肖菝葜属植物提取物冻干粉针的制备称取310g右旋糖苷，溶于4500毫升注射用水中，再称取按本发明方法制备的提取物350g，溶于上述溶液中。用20％的氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.2。加入配制量的0.1％针用活性炭加热搅拌15分钟，抽滤，滤液补充加入注射用水至5000毫升。精滤，中间体检查，灌装，冻干，压盖，成品检查，包装。
实施例5大输液的制备取按上述方法制得的提取物50g，加入834.7g氯化钠和90L的注射用水，搅拌溶解，加0.1mol/L NaOH适量，调pH约为7.0，补充注射用水至足量，再加入液量0.15％的针用活性炭，加热搅拌15分钟，抽滤除碳，测定含量、pH值合格后，再精滤分装，(105℃)热压灭菌，即得。
实施例6小水针的制备取按上述方法制得的提取物300g，加入80.0g氯化钠和10L的注射用水，搅拌溶解，加0.1mol/L NaOH适量，调pH约为7.0，加入10g抗氧剂硫代硫酸钠，补充注射用水至足量，再加入液量0.1％的针用活性炭，搅拌15分钟，抽滤除碳，测定含量、pH值合格后，再精滤分装，(105℃)热压灭菌，即得。
实施例7 口服液的制备取按上述方法制得的提取物250g，葡萄糖50g，加水1L，搅拌溶解，加入10g抗氧剂硫代硫酸钠，补充水至10L，混匀，滤过，分装，热压灭菌，即得。
实施例8 分散片的制备取按上述方法制得的提取物25g，微晶纤维素35g，淀粉10g，羧甲基淀粉5g，以5％PVP溶液为粘合剂制粒，压片，即得。
实施例9 滴丸的制备取PEG-6000 50-100g，加热融化，加入按上述方法制得的提取物25g，滴成滴丸，即得。
实施例10 滴丸的制备取PEG-4000 60-100g，加热融化，加入按上述方法制得的提取物25g，滴成滴丸，即得。
实施例11胶囊的制备取按上述方法制得的提取物250g，淀粉100g，以20％乙醇为粘合剂制粒，装胶囊，即得。
实施例12颗粒剂的制备取按上述方法制得的提取物250g，葡萄糖100g，糊精200g，以稀淀粉糊为粘合剂制粒，分装，即得。
实施例13片剂的制备取按上述方法制得的提取物25g，加淀粉50g，混匀，以淀粉浆为粘合剂，制粒，烘干，整粒，压片，即得。
实施例14片剂的制备取按上述方法制得的提取物25g，加淀粉40g，糊精10g，混匀，以淀粉浆为粘合剂，制粒，烘干，整粒，压片，即得。
实施例15软胶囊的制备取按实施例1的方法制得的提取物250g，加植物油550g，蜂蜡50g，加热混匀，装入囊材中，制成软胶囊即得。
权利要求
1.一种肖菝葜属植物提取物，以该提取物总重计，其中至少含有酚苷10％，黄酮苷10％。
2.如权利要求1所述的肖菝葜属植物提取物，其中该提取物中含有的酚苷为10％-90％、黄酮苷为10％-90％。
3.如权利要求1所述的肖菝葜属植物提取物，其由以下方法制得(1)肖菝葜属植物用至少2倍量的10-95％浓度醇，提取得到提取液；(2)提取液浓缩得浓缩液，加水使其混悬；(3)静置，滤过，取滤液备用；(4)取上述滤液，上大孔树脂柱，以水洗脱至洗脱液糖反应为阴性，弃去水洗脱液；(5)以浓度不超过90％的醇洗脱，洗脱液浓缩，即得到肖菝葜属植物提取物；以该提取物总重计，所述的肖菝葜属植物提取物中至少含有酚苷10％，黄酮苷10％。
4.权利要求1所述的肖菝葜属植物提取物的制备方法，其中包括(1)肖菝葜属植物用至少2倍量的10-95％浓度醇，提取得到提取液；(2)提取液浓缩得浓缩液，加水使其混悬；(3)静置，滤过，取滤液备用；(4)取上述滤液，上大孔树脂柱，以水洗脱至洗脱液糖反应为阴性，弃去水洗脱液；(5)以浓度不超过90％的醇洗脱，即得。
5.权利要求4所述的制备方法，其中步骤(1)中提取用的醇浓度为70-95％。
6.权利要求4或5所述的制备方法，在步骤(3)之后还包括依次用至少为0.5倍滤液重量的低极性溶剂、中等极性溶剂萃取除杂，所述的低极性溶剂为snyder参数ε0＜0.4的溶剂，中等极性溶剂为snyder参数0.4＜ε0＜0.6的溶剂，至少萃取一次，再用较高极性溶剂萃取有效成分，所述较高极性溶剂为snyder参数ε0＞0.6的溶剂，将较高极性溶剂的萃取液上大孔树脂柱。
7.权利要求6所述的制备方法，其中snyder参数ε0＜0.4的低极性溶剂选自石油醚、乙醚、丙酮和异丙醇中至少一种，snyder参数0.4＜ε0＜0.6的中等极性溶剂为氯仿和/或乙酸乙酯，snyder参数ε0＞0.6的较高极性溶剂为正丁醇。
8.权利要求4所述的制备方法，其中洗脱用醇的浓度为60％。
9.一种药物组合物，其特征在于含有治疗有效量的权利要求1所述的肖菝葜属植物提取物和药学可接受的辅料。
10.权利要求1所述的肖菝葜属植物提取物在制备治疗抗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种肖菝葜属植物提取物及其制备方法，该提取物至少含酚苷10％，黄酮苷10％；提取方法包括用高浓度醇回流提取药材，浓缩至无醇味，加水使混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，或其它有机溶剂，或含有机溶剂的组合依次萃取，分别回收溶剂，得正丁醇提取物；或以稀醇提取，提取液回收溶剂得提取物，以该提取物加水分散后上大孔树脂柱，以水洗脱至洗脱液不含糖，再以含醇水溶液洗脱，洗脱液回收溶剂，得提取物；该提取物具有抗肿瘤的活性。
文档编号A61P35/00GK1903340SQ20061008905
公开日2007年1月31日 申请日期2006年8月1日 优先权日2006年8月1日
发明者林瑞超, 王钢力, 戴忠, 姚令文, 秦文洁 申请人:中国药品生物制品标准化研究中心