菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯在制备治疗宫颈炎药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体为菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯制备治疗宫颈炎药 物中的应用。
【背景技术】
[0002] 中药知母为百合科（Liliaceae)植物知母（Anemarrhena asphodeloides)的干燥 根茎，具有清热泻火、生津润燥之功效，为中药常用的滋阴药之一。临床用于外感热病，高热 烦渴，肺热燥咳，骨蒸潮热，内热消渴，肠燥便秘等症状。知母皂苷及其苷元为其有效成分之 一，近年来药学工作者对知母皂苷及其苷元进行了多项药理研究，用于治疗老年性痴呆具 有很好的前景。知母皂苷是中药知母中有效成分之一，含量质量分数约为6%，知母皂苷元 是知母皂苷类成分水解后去掉结合糖基的产物，同时在植物中大量存在。本发明采用萃取、 水解、重结晶等方法分离、富集得到纯度质量分数为96. 3%的菝葜皂苷元，并通过酰化反应 合成菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯化产物。并且首次发现菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯化产物 具有抗宫颈炎的活性。
[0004] 菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯化产物
【发明内容】
[0005] 我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药的先导化合物， 是开发新药的天然宝库，从天然产物中提取活性物质并进行合理的结构修饰，开发成安全 性好、毒性低的新药具有重要应用价值和广阔发展前景。
[0006] 菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯在制备治疗宫颈炎药物中的应用
[0007] 本发明菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯可以制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、散剂、 丸剂、口服液、糖浆剂、混悬剂、喷雾剂、溶液、汤剂、凝胶剂、霜剂、乳膏剂、滴剂等。在上述制 剂中，有效剂量的本发明提取物可以单独或与药学尚可接受的载体：赋形剂、崩解剂、润滑 剂、着色剂等组成混合物。
[0008] 有益效果
[0009] 本发明首次发现菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯具有良好治疗宫颈炎作用，并且呈剂 量依赖关系，为进一步研究新药提供基础。为妇科治疗提供新的选择。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1
[0011] 取干燥的知母根茎5kg，体积分数为60 %的乙醇回流提取3次（每次2h)，提取液 合并、减压浓缩至一定体积，经正丁醇萃取，萃取液合并，用体积分数为20 %的醋酸加热水 解6h，放冷，抽滤，得到固体，通过氯仿一甲醇重结晶得到白色针状结晶50g，此单体化合物 为菝葜阜苷元（sarsasapogenin)。
[0012] 在氩气保护下将1.0g(2.4mmol)自制菝葜皂苷元溶入重蒸干燥吡啶中，然后将 体积分数为70%的甲酸在冰浴温度下滴加至上述吡啶溶液中，滴加完毕后室温搅拌。减 压蒸出吡啶，向剩余物中加入水，乙酸乙酯萃取三次，有机相lmol. L 1的氢氧化钠水洗，饱 和食盐水洗，无水硫酸钠干燥过夜后，蒸出溶剂。柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度（体 积比为100 : 5~100 : 30)洗脱得到甲酯衍生化的菝葜皂苷元0.88g、收率为80%。 白色无定形粉末，正ESI-MS谱给出准分子离子峰m/z 445. 1[M+H]+。13C-NMR(300MHz， CDC13) S :l〇9.9(C-22)、81. 1(C-16)、71. 1(C-3)、65.3(C-26)、62.2(C-17)、56.5(C-14)、 42. 2 (C-20)、42. 2 (C-20)、40. 8 (C-13)、40. 3 (C-12)、40.1 (C-9)、37. 3 (C-5)、35. 4 (C-8)、 35. I (C-10)、31. 8(C-15)、30. 7(C-1)、30. 7(C-4)、27. 2(C-25)、26. 4(C-6)、26. 4(C-7)、 26. 0(C-23)、25. 9(C-24)、25. I (C-2)、23. 9(C-19)、20. 9(C-11)、16. 6(C-18)、16. I (C-27)、 14. 3(C-21)、161. 0(0 = C-0)。
[0014] 菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯化产物
[0015] 实施例2
[0016] 1、样品（实施例1获得菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯化产物）对白介素IP (IL-10) 诱导大鼠宫颈鳞状上皮细胞炎症的影响：
[0017] 大鼠宫颈鳞状上皮细胞（RCEC)细胞分离和培养：处死大鼠，取宫颈部位的组织剪 成1~2mm3的小块，用无菌Hank's平衡液（含15mmol. L 1HEPES,青霉素IOOkU. L \链霉素 IOOmg. L \ 二性霉素 0? 25mg. L-l，pH 7. 4)洗涤 3 次，0? 1%胶原酶（189kU. L 3 在 37°C消化 50分钟，然后用0. 2%胰蛋白酶37°C消化20分钟，Hank's平衡液洗涤两次，用生长培养基 悬浮，将来动物宫颈的组织接种于60mm培养皿中，在34°C，5% C02培养箱中培养。生长培 养基为A与B (1 :1)两部分组成，A与B成分如下：
[0018] (A) 24小时条件培养基：DMEM培养基（含10% FBS)培养Swiss 3T3细胞24小时 后的培养基；
[0019] (B)宫颈上皮细胞培养基（cervical epithelial growth medium，CEGM):由 HamF12和RPMI-1640 (1:1)组成，再添加7. 5 %猪血清、胰岛素（10 y g. L ^、转铁蛋白 (lOmg. L 3、氢化可的松（6. 5mg. L 3、霍乱毒素（0. lnmol. L i、牛脑提取物（150mg. L 3，
[0020] 3天后，弃去培养基，用D-Hanks轻轻漂洗除去组织碎片。然后加入CEGM培养， 当细胞达到融合后，先用D-Hanks漂洗1小时，然后加入0.025 %胰蛋白酶与0.5mmol. L-1EDTA(1:1)消化，用CEGM重新悬浮，然后接种到预先铺有胶原凝胶的IOOmm培养皿上。 此二代培养物可以传代，先添加0. 1 %胶原酶0. 005L在34°C孵育直到胶原完全液化（约1 小时），用D-Hanks洗涤细胞悬液，再用0. 025%胰蛋白酶与0. 5mmol. L 1EDTAd : 1)在37°C 消化10分钟，细胞悬液经洗涤后重新悬浮在CEGM中，接种于预先铺有胶原凝胶的培养板， 实验用第2~3代细胞。台盼蓝检测细胞活率大于95%，细胞纯度鉴定采用免疫组化SABC 法，将生长有细胞的盖玻片从培养板中取出，丙酮固定，以小鼠抗大鼠细胞角蛋白多抗为一 抗，二氨基联苯胺（DAB)显色，胞浆被染成棕黄色者为阳性，实验同时设立阴性对照。显微 镜下观察显色结果，细胞阳性率达95%以上。
[0021] (2)细胞分组和处理
[0022] 将细胞悬液调到IXlO9. 1 \接种于2孔培养板中，培养液不含小牛血清。以每 个细胞培养孔为一样本个体，随机分为正常对照组、炎疰对照组，样品〇, 〇1，〇. 1，1. 〇和 10, Ong. ml 1组，每种处理设3个复孔。样品组分别加入样品至终浓度0. 01，0. 1，I. 0和 10.0 ng. ml \正常对照组和炎症对照组添加培养液，置34°C，5% C02培养箱中培养24小时 后，炎症对照组和样品组加入终浓度为5ng. ml-1的IL-I P，置34°C，5% C02培养箱中培养 6小时。分别收集每组上清液用放射免疫分析法分别测定IL-8和PGE2含量。此试验重复 2次。
[0023] 结果：
[0024] 表1对大鼠宫颈鳞状上皮细胞分泌IL-8和PEG2的作用
[0026] 与炎症对照组相比，#p〈0. 01，*p〈0. 05
[0027] 讨论本发明样品组药效呈剂量依赖关系，并且在高剂量下样品组与正常组无显著 性差异。证明其在具有良好治疗效果。
[0028] 2、样品对实验性大鼠子宫颈炎的治疗作用：
[0029] 实验方法：
[0030] 样品（实施例1)栓剂的制备：将IOOmg卡波普浸泡于注射用水中，充分溶胀，加入 聚山梨醇20mg，搅拌均勾，加入用乙醇溶解的25mg样品，充分混勾加水至IOmL即得
[0031] 1)大鼠子宫颈炎模型的建立：制备大鼠子宫颈炎模型：用阿拉伯树胶将苯酚混悬 制备25%苯酚胶浆，向造模大鼠阴道深部注入0. 4ml，三天一次，共三次。大鼠由南京青龙 山实验动物中心。
[0032] 2)分组及处理
[0033] 将大鼠随机分为分组：每组6只。造模后第三天，开始阴道局部给药，连续12天。 样品治疗组分别给样品2、4和8mg. kg \ d i。阳性对照组给聚甲酚磺醛5mg-kg \ d \阴性 对照组给空白基质栓剂。
[0034] 3)子宫颈组织病理形态学观察
[0035] 末次给药后24天处死动物，解剖取材阴道至子宫角处组织，用10%福尔马林固 定，石蜡包埋，切片，HE染色。每个样本选取相同部位的同一张石蜡切片，在显微镜下观察 子宫颈部位的粘膜及其粘膜下间质的病理形态学变化。随机选取非重叠的3个视野，采用 计算机图像分析系统分析炎性细胞数量等。
[0036] 病理形态学评分标准如下：
[0037] 粘膜：鳞状上皮层次仅局部超过2-3层略有增厚为"+，'，明显增厚为"++，'，广泛 增厚并使粘膜凹凸不平为"+++，' ：有些处柱状上皮可见有增生而出现鳞化趋势为" + "，明显 鳞化为"++"，鳞化区域广泛甚至达宫腔为"+++，' ：仅见极少区域鳞状上皮出现糜烂而被邻 近柱状上皮增生替代为" + "，柱状上皮增坐明显替代鳞状上皮为"++"，鳞状上皮大片脱落 由柱状上皮替代为"+++";仅见极少区域糜烂突破基底膜为"+，'，可见明显粘膜上皮变性坏 死为"++"，粘膜溃疡伴有感染为"+++"。
[0038] 炎细胞浸润：仅见粘膜及粘膜下浅层有少量炎细胞浸润为" + "，粘膜及粘膜下 间质内均有中等量炎细胞浸润为"++"，粘膜下及间质内深层均见大量广泛炎细胞浸润为 "+++"。
[0039] 间质成纤维细胞增生：间质内仅见成纤维细胞略较正常对照组增多为"+，'，成纤 维细胞增生明显并有少量胶原纤维束为"++，'，成纤维细胞增生伴有大量胶原纤维束形成 为 "+++，'。
[0040] 综合宫颈总体病理改变程度分为如下4级：正常：六项中仅见浅层少量炎细胞浸 润；轻度：六项中两项以上" + "；中度：六项中两项以上" + "，两项有"++，'；重度：六项中一 项有"+++"，两项有"++，'，三项有" + "；或三项有"+++"。
[0041] 结果
[0042] 1.子宫颈组织病理形态学观察
[0043] 造模大鼠子宫颈组织大量炎性细胞浸润，可见上皮糜烂与粘膜溃疡，并有糜烂部 位柱状上皮替代鳞状上皮的趋势。粘膜下层毛细血管扩张充血，间质水肿，从粘膜至间质均 可见大量炎性细胞浸润，并可见间质纤维组织增生。样品2、4和8mg. kg-1治疗组与阴性对 照组相应部位比较，粘膜下炎性细胞浸润明显减轻，其中8mg. kg-1治疗组的细胞形态与组 织结构更接近正常对照组。结果见表2、3。
[0044] 表2对实验性宫颈炎大鼠宫颈病理形态学变化的影响
[0045]
[0046] 表3对实验性宫颈炎大鼠宫颈组织炎症细胞数的影响
[0047]
【主权项】
1. 菝皂苷元3位羟基甲酰酯在制备治疗宫颈炎药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的菝皂苷元3位羟基甲酰酯在制备治疗宫颈炎药物中的应用， 其特征在于所述的菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、散剂、丸 剂、口服液、糖浆剂、混悬剂、喷雾剂、溶液、汤剂、凝胶剂、霜剂、乳膏剂、滴剂等。3. 根据权利要求2所述的菝皂苷元3位羟基甲酰酯在制备治疗宫颈炎药物中的应用， 其特征所述的在所述的制剂中，有效剂量的菝皂苷元3位羟基甲酰酯可以单独或与药学尚 可接受的载体：赋形剂、崩解剂、润滑剂、着色剂等组成混合物。
【专利摘要】本发明涉及医药技术领域，具体为菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯制备治疗宫颈炎药物中的应用。本发明首次发现菝葜皂苷元3位羟基甲酰酯具有良好治疗宫颈炎作用，并且呈剂量依赖关系，为进一步研究新药提供基础。为妇科治疗提供新的选择。
【IPC分类】A61P29/00, A61P15/00, A61K31/58
【公开号】CN105193825
【申请号】CN201510672267
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月18日