专利名称：用于治疗高胆红素血症的胆红素吸附材料的制作方法
技术领域：
本发明属于生物分离工程技术领域。涉及到合成了具有赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺吸附功能基的系列胆红素吸附材料，并在病人血浆中进行了吸附实验。
背景技术：
胆红素是衰老红细胞中血红素的代谢产物，正常情况下在肝脏与葡萄糖醛酸结合后经进一步代谢排出体外。如果肝脏对其代谢出现障碍，则血液中的胆红素浓度会升高，当胆红素浓度超过17μmol/L时就会产生黄疸，此时的胆红素又成为一种内源性毒素，极易透过生物膜，并透过血脑屏障与神经核团结合，干扰脑细胞的正常代谢及功能，对大脑产生不可逆的毒副作用。胆红素脑病易发生于新生儿，并往往导致死亡。胆道阻塞、急性及慢性黄疸性肝炎、中毒性肝炎、各种溶血性肝炎、新生儿黄疸症等都会导致肝脏对胆红素的代谢紊乱，从而导致病患者体内胆红素的积累，产生高胆红素血症，他们体内的胆红素浓度可高达近700μmol/L，致使患者生理失调。当前，急性肝功能衰竭导致的死亡率高达80％。如果能够及时的除去血液中过量的胆红素，将极大的缓解病情，给病人肝细胞进行自我修复和肝移植争取时间，对挽救病人的生命具有重大意义。
大量研究表明，利用血液净化吸附疗法可以有效地治疗高胆红素血症。此疗法的关键是胆红素吸附材料的性能。近20年来，胆红素吸附材料的研究主要集中在载体和功能基团两方面，依据载体的类型可分为合成树脂类吸附剂和多糖类吸附剂，依据功能基团的类型可分为广谱类吸附剂和亲和吸附剂。
合成树脂类吸附剂是网状结构的高分子聚合物，可根据不同的需要进行人工合成，使其具备特定的吸附性能，是目前研究较多的吸附剂。树脂类吸附剂可分为离子交换树脂和吸附树脂两大类。a)应用离子交换树脂型胆红素吸附材料去除胆红素的实例有以乙稀基苯共聚合体为骨架的BL-300阴离子交换树脂型胆红素吸附材料，此类吸附材料已商品化。在实际治疗中，该类吸附材料对病人血浆中胆红素的去除率可达到50~60％，但治疗时间较长，一般需要4~6小时。另外，此类吸附材料的价格昂贵(6000~9000RMB)，很难被广大高胆红素血症患者所接受。b)应用吸附树脂型胆红素吸附材料去除胆红素的实例有高分子树脂型胆红素吸附剂(中国专利号ZL 200410016088.2)、吸附胆红素的环糊精交联聚合物微球(中国专利号ZL 03111583.7)等。高分子树脂型胆红素吸附剂(中国专利号ZL 200410016088.2)是以聚苯乙烯-二乙烯苯为载体，β环糊精为功能基吸附胆红素。动物全血灌流实验表明这种吸附材料对胆红素的去除率可达61.2％，但没有给出更为详细的实验结果。吸附胆红素的环糊精交联聚合物微球(中国专利号ZL 03111583.7)是以二异氰酸酯为交联剂，与环糊精单体缩合而成。实验结果表明该类吸附材料在不含牛血清白蛋白胆红素溶液和含牛血清白蛋白胆红素溶液中对胆红素的去除率分别为87.5％和51.5％。可见白蛋白分子对吸附效果影响严重，并且专利中并没考察吸附材料在实际血浆中对胆红素的吸附性能，而只有在实际血浆中对胆红素具有良好吸附性能的吸附材料才具有临床意义。
材料表面功能基与胆红素具有亲和作用的吸附剂被称为亲和吸附剂，以人血清白蛋白(中国专利号ZL 01128196.0)以及三嗪染料(Denizli A等，Journal of Chromatography BBiomedical Sciences and Applications，1998，707(1-2)25-31)为功能基的吸附剂均属此类。用于治疗高胆红素血症的免疫吸附材料(中国专利号ZL 01128196.0)是以琼脂糖凝胶为载体，人血清白蛋白HSA为吸附胆红素的功能分子。此类吸附材料虽然血液相容性良好，在血浆中对胆红素的去除率达到57.3％。但末端偶联人血清白蛋白HSA为配基吸附胆红素，使得制备成本偏高，而且人血清白蛋白HSA的使用也使得吸附材料易被微生物所污染，不易保存。以三嗪染料为功能基的胆红素吸附剂，以二甲基丙烯酸乙二醇酯和甲基丙烯酸-2-羟基乙酯的共聚物为载体。此类吸附材料对胆红素的吸附量可达24.2mg/g，但染料配基的脱落问题使得该类吸附材料很难应用于临床。
目前，只有日本生产的乙稀基苯共聚合体阴离子树脂在临床上得到了应用，其它吸附剂离临床应用还有很大的距离。研究新型的胆红素吸附剂解决目前胆红素吸附材料存在的(1)病人血浆体系中对胆红素的吸附容量低；(2)血液相容性差、价格昂贵等缺陷，对挽救重症肝炎病人的生命具有重要意义。
我们提出了以天然的多糖类材料为载体，通过筛选功能基团链以提高吸附材料对胆红素的吸附容量，最终合成对血液中胆红素去除率高、血液相容性好的吸附材料。总体构想是(1)选择多糖类材料琼脂糖凝胶为载体以增强血液相容性。(2)鉴于间隔臂和末端功能基对胆红素的吸附都有贡献，通过计算机软件计算吸附材料的整个功能基团链与胆红素分子的疏水性常数，根据“相似相溶”原理，推测与胆红素分子疏水性常数最接近的吸附材料对胆红素的吸附性能最优。
发明内容
本发明的目的在于设计、合成一种无毒、无害、胆红素吸附效果好、成本低的多糖型吸附材料，以克服现有技术中主要存在的吸附材料在实际病人血浆中对胆红素吸附容量低、价格昂贵等缺陷。达到对胆红素高选择性的去除，并且具有良好的血液相容性的目的。
本发明的技术方案如下(1)选用血液相容性良好的琼脂糖凝胶为载体，它是从天然植物中提取出来的多糖类物质，含有大量的羟基。通常情况下，它是惰性的，不具有吸附性，所以血液相容性好。使用N，N’羰基二咪唑活化载体，以双氨基试剂、双醛基试剂作为间隔臂分子，根据吸附材料与胆红素分子之间可能存在的氢键、疏水、离子键等作用机制，键合几种不同的末端功能基(赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺)合成一系列胆红素吸附材料。
(2)通过计算机软件优化吸附材料的最低能量构型，并计算此构型时整个功能基团链的疏水性常数，通过与胆红素分子疏水性常数的比较来确定吸附性能最佳的吸附材料。一般认为，与胆红素分子疏水性常数较接近的吸附材料具有较好的吸附性能，这是因为根据“相似相溶”原理，其与胆红素分子的吸附作用力应该较强。
按照上述实验构思，本发明提供出了用于治疗高胆红素血症的胆红素吸附材料，包括选用琼脂糖凝胶为载体，采用N，N’羰基二咪唑活化载体，以双氨基试剂、双醛基试剂作为间隔臂分子，末端分别偶联赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺的一系列对胆红素具有较高吸附容量的多糖型吸附材料的合成过程，其特征在于1)利用N，N’羰基二咪唑活化琼脂糖凝胶，其中N，N’羰基二咪唑的质量浓度为60~220g/L，琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％，反应温度25~37℃，反应时间1~2小时，反应后琼脂糖凝胶表面的活性基团密度为72~192mmol/Lgel；2)利用双氨基试剂合成带有氨基功能基团的琼脂糖凝胶。其中双氨基试剂在溶液中的体积百分比为2~20％，N，N’羰基二咪唑活化的琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％，反应温度25~37℃，反应时间2~4小时，反应后琼脂糖凝胶表面的氨基密度为50~107mmol/Lgel；3)利用双醛基试剂合成带有醛基功能基团的琼脂糖凝胶。其中双醛基试剂在溶液中的体积百分比为3~25％，带有氨基功能基团的琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％，反应温度25~37℃，反应时间2~18小时，反应后琼脂糖凝胶表面的醛基密度为13~23mmol/Lgel；
4)分别利用赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺与带有醛基功能基团的琼脂糖凝胶反应，合成系列胆红素吸附材料。其中，赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺在溶液中的摩尔浓度分别为0.2~1.0mol/L，带有醛基功能基团的琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％，反应温度25~37℃，反应时间2~24小时，反应后琼脂糖凝胶表面的吸附功能基密度为13~23mmol/Lgel；5)以赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料，在胆红素浓度为324mg/L的人血浆中的吸附容量分别为0.71~1.21g/Lgel、0.78~1.29g/Lgel、0.91~1.44g/Lgel和1.20~1.81g/Lgel。密度为23mmol/Lgel的以正丁胺为末端功能基的吸附材料，对胆红素浓度为474μmol/L的实际病人血浆中的胆红素去除率达到55.2％。
本发明的效果和益处是选用多糖类材料琼脂糖凝胶为载体，与其他吸附材料相比，具有血液相容性好、非特异性吸附小等优点，增强了治疗的安全性；采用赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺为末端功能基，取代人血清白蛋白HSA，保证治疗效果，降低生产成本，使材料易于消毒、运输和保存。如密度为23mmol/Lgel的以正丁胺为末端功能基的吸附材料，对胆红素浓度为474μmol/L的实际病人血浆中的胆红素去除率达到55.2％，0.5小时吸附基本达到平衡。胆红素去除率接近进口吸附柱水平，但吸附效率远高于进口吸附柱。
附图是以正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料在实际病人血浆中对胆红素的去除率与时间的关系图。
座标横座标为吸附时间，单位为小时。纵座标为胆红素的去除率，用百分率％表示。符号□代表总胆红素符号○代表直接胆红素，符号△代表间接胆红素。
实验条件密度为23mmol/Lgel的以正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料吸附材料55ml(装柱)，动态吸附时间2.5小时，含胆红素病人血浆与吸附材料的体积比为10∶1，胆红素初始浓度为474μmol/L。
具体实施例方式
以下结合技术方案和附图，详细叙述本发明的细节最佳实施例。
实施例1N，N’羰基二咪唑活化琼脂糖凝胶的制备称取琼脂糖凝胶0.43~1.0L，用去离子水经过真空抽滤4-5次除去凝胶中的防腐剂，依次以30％、70％、100％的丙酮清洗凝胶，称取60~220g的N，N’羰基二咪唑溶于1.0L丙酮中，然后把洗好的凝胶加到该溶液中，在温度25~37℃，150转/分的摇床中反应1~2小时。反应结束后，用6~10倍体积的丙酮反复清洗已活化的凝胶，真空抽滤，除去反应过程中产生的咪唑。此时琼脂糖凝胶表面的活性基团密度为72~192mmol/Lgel。
实施例2双氨基试剂偶联琼脂糖凝胶的制备在1.0L丙酮中加入0.021~0.25L的双氨基试剂(如二氨基二丙基亚胺、己二胺、乙二胺等)后，再加入0.43~1.0L用N，N’羰基二咪唑活化好的琼脂糖凝胶，在温度25~37℃，150转/分的摇床中反应2~4小时。反应结束后，用6~10倍体积的去离子水反复清洗反应后的凝胶，然后再用0.15mol/L、pH8.2的硼酸缓冲液清洗胶样。此时琼脂糖凝胶表面的氨基密度为50~107mmol/Lgel。
实施例3带有醛基活性基团的琼脂糖凝胶的制备把0.43~1.0L偶联双氨基试剂的琼脂糖凝胶分散在1.0L含双醛基试剂(如戊二醛、乙二醛等)体积百分比为3~25％的0.15mol/L、pH8.2的硼酸缓冲液中，在温度25~37癈，150转/分的摇床中反应2~18小时。反应结束后，依次用6~10倍体积的去离子水，6~10倍体积的2mol/L醋酸，6~10倍体积的0.15mol/L、pH8.2的硼酸缓冲液清洗胶样，抽干。此时琼脂糖凝胶表面的醛基密度为13~23mmol/Lgel。
实施例4通过疏水性常数的计算筛选功能基利用计算机软件ChemOffice计算以赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺为末端功能基的吸附材料的疏水性常数分别为-0.8441，-0.8607，-1.1197和0.8978，胆红素分子的疏水性常数为1.0413。理论上以正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料的疏水性常数(0.8978)与胆红素分子的疏水性常数(1.0413)最接近，根据“相似相溶”原理，推测其对胆红素应具有较高的吸附容量，推测的准确性需要进一步通过吸附实验验证。
实施例5赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺为末端功能基的吸附材料的制备及评价分别将赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺溶于1.0L的0.15mol/L、pH8.2的硼酸缓冲液中，使其摩尔浓度为0.2~1.0mol/L，将0.43~1.0L带有醛基活性基团的琼脂糖凝胶分别加入其中，在温度25~37癈，150转/分的摇床中反应2~24小时。反应结束后，用6~10倍体积的去离子水清洗胶样，用硼氢化钠还原反应过程中生成的双键。此时琼脂糖凝胶表面的吸附功能基密度为13~23mmol/Lgel。
分别取含有不同功能基的胆红素吸附材料0.5ml，加入5ml高胆红素血症病人血浆，胆红素浓度为324mg/L，静态吸附2.5小时，分析吸附前后血浆中胆红素的变化量，计算胆红素吸附量。实验结果表明以赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺为末端功能基的吸附材料，对人血浆中胆红素的吸附容量分别为0.71~1.21g/Lgel、0.78~1.29g/Lgel、0.91~1.44g/Lgel和1.20~1.81g/Lgel。其中以正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料的性能优于其它吸附材料，这一结果在某种程度上与理论计算的结果吻合。
实施例6以正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料的体外动态吸附实验取以正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料55ml装入吸附柱中(内径4cm，高度6cm)，将550ml患有高胆红素血症病人的血浆过柱循环2.5小时，分析吸附前后血浆中胆红素的变化量，计算胆红素去除率。实验结果表明以正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料，对胆红素浓度为474靘ol/L的实际病人血浆中的总胆红素去除率达到55.2％，直接胆红素的去除率达到57.1％，间接胆红素的去除率达到52.2％，这一效果接近进口胆红素吸附柱水平。从附图1中还可以看出，吸附材料在0.5小时内对胆红素吸附基本平衡，由于进口胆红素吸附柱4~6小时才能基本达到吸附平衡，这一结果可以说明以正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料对胆红素的吸附速度远高于进口胆红素吸附柱。
权利要求
1.一种用于治疗高胆红素血症的胆红素吸附材料，包括选用琼脂糖凝胶为载体，采用N，N’羰基二咪唑活化载体，以双氨基试剂、双醛基试剂作为间隔臂分子，末端分别偶联赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺的一系列对胆红素具有较高吸附容量的多糖型吸附材料的合成方法，其特征在于a)利用N，N’羰基二咪唑活化琼脂糖凝胶，其中N，N’羰基二咪唑的质量浓度为60~220g/L，琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％，反应温度25~37℃，反应时间1~2小时，反应后琼脂糖凝胶表面的活性基团密度为72~192mmol/Lgel；b)利用双氨基试剂合成带有氨基功能基团的琼脂糖凝胶，其中双氨基试剂在溶液中的体积百分比为2~20％，N，N’羰基二咪唑活化的琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％，反应温度25~37℃，反应时间2~4小时，反应后琼脂糖凝胶表面的氨基密度为50~107mmol/Lgel；c)利用双醛基试剂合成带有醛基功能基团的琼脂糖凝胶，其中双醛基试剂在溶液中的体积百分比为3~25％，带有氨基功能基团的琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％，反应温度25~37℃，反应时间2~18小时，反应后琼脂糖凝胶表面的醛基密度为13~23mmol/Lgel；d)分别利用赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺与带有醛基功能基团的琼脂糖凝胶反应，合成系列胆红素吸附材料，其中，赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺在溶液中的摩尔浓度分别为0.2~1.0mol/L，带有醛基功能基团的琼脂糖凝胶在溶液中的体积百分比为30~50％，反应温度25~37？，反应时间2~24小时，反应后琼脂糖凝胶表面的吸附功能基密度为13~23mmol/Lgel。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗高胆红素血症的胆红素吸附材料，其特征还在于以赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺为末端功能基的胆红素吸附材料，在胆红素浓度为324mg/L的人血浆中的吸附容量分别为0.71~1.21g/Lgel、0.78~1.29g/Lgel、0.91~1.44g/Lgel和1.20~1.81g/Lgel。密度为23mmol/Lgel的以正丁胺为末端功能基的吸附材料，对胆红素浓度为474μmol/L的实际病人血浆中的胆红素去除率达到55.2％。
全文摘要
本发明属于生物分离工程技术领域，用于治疗高胆红素血症的胆红素吸附材料，采用琼脂糖凝胶为载体，用N，N’ 羰基二咪唑活化载体，以双氨基试剂、双醛基试剂作为间隔臂分子，末端分别偶联赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺，合成了系列胆红素吸附材料。其特征为赖氨酸、氨基乙醇、精氨酸和正丁胺胆红素吸附材料在胆红素浓度为324mg/L的人血浆中，吸附容量分别为0.71~1.21g/Lgel、0.78~1.29g/Lgel、0.91~1.44g/Lgel和1.20~1.81g/Lgel。以正丁胺为末端功能基的吸附材料，对病人血浆中的胆红素去除率达到50.0％以上。本发明的效果和益处是该材料具有价格低廉、可快速的从病人血浆中除去胆 红素，吸附容量大，血液相容性好等优点。
文档编号A61M1/38GK1876226SQ20061020009
公开日2006年12月13日 申请日期2006年1月27日 优先权日2006年1月27日
发明者贾凌云 申请人:大连理工大学