肺炎球菌多糖缀合物疫苗的制作方法

专利名称：：肺炎球菌多糖缀合物疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及改进的月^炎链^求菌(5Vreptococcws;wewmom'ae)疫苗。
背景技术：
：2岁以下的儿童对大多数多糖疫苗还不能产生免疫应答，因此通过化学方法使多糖与蛋白载体缀合而具有免疫原性一直都是必要的。将多糖(一种不依赖T的抗原)与蛋白质(一种依赖T的抗原)偶联而赋予多糖依赖T的性质，包括同种型转换、亲和力成熟和记忆诱导。然而，重复给予多糖-蛋白质缀合物或将多糖-蛋白质缀合物组合制成多价疫苗可能会出现问题。例如，据报导按照标准婴幼儿接种时间表，在一定剂量范围内用(游离)TT和肺炎球菌多糖-TT缀合物疫苗同时进行免疫，并对用破伤风类毒素(TT)作为蛋白载体的流感嗜血菌(i^emop/u'/i^^ywewz。e)b型多糖(PRP)疫苗进行了试验。当肺炎球菌疫苗的剂量增加时，对Hib缀合物疫苗的PRP多糖部分的免疫应答降低，这表明很可能通过使用同一载体蛋白引起了多糖的免疫干扰(Dagan等，Infect.Immun.(1998);M:2093-2098)。也证明了载体-蛋白质剂量对针对蛋白质本身的体液应答的影响是多方面的。据报导，在婴幼儿体内增加四价破伤风类毒素缀合物的剂量导致对破伤风载体的应答降低(Dagan等，出处同上)。对于联合疫苗，这些作用的典型分析被描述为载体诱导的表位抑制，这一点虽然还未得到充分认识，但相信是由过量载体蛋白造成的(Fattom,VaccineU:126(1999))。这似乎导致针对载体蛋白的B细胞和针对多糖的B细胞竟争Th细胞。如果针对载体蛋白的B细胞占优势，则没有足够的Th细胞可为对多糖特异性B细胞提供必需的辅助。然而，已经观察到的免疫效果一直不一致，载体蛋白的总量在一些情况下提高免疫应答，而在另一些情况下则降低免疫应答。因此，将多种多糖缀合物组合成单一、有效的疫苗制剂还存在着技术困难。肺炎链球菌是一种革兰氏阳性菌，可造成极高的发病率和死亡率(特别是对年纪小的人和上年纪的人)，引起侵袭性疾病例如肺炎、菌血症(bacteraemia)和脑膜炎，以及与定居现象有关的疾病例如急性中耳炎。在美国，60岁以上的人群中，估计患有肺炎球菌性肺炎的比例为3-8/100,000,其中有20%的病例导致菌血症，其他的则表现为脑月莫炎等，即便使用了抗生素治疗，死亡率也接近30%。肺炎球菌被用化学键连接的赋予血清型特异性的多糖包裹着。有90种已知血清型的肺炎球菌，荚膜是肺炎球菌主要的毒力决定因素，因为荚膜不但保护细菌内表面不受补体作用，而且它本身的免疫原性也较差。多糖是不依赖T的抗原，不能被加工或呈递到MHC分子与T细胞相互作用。然而，它们能通过影响B细胞表面受体交联的替代机制而刺激免疫系统。一些实验表明，针对侵袭性肺炎球菌疾病的保护作用与荚膜特异性抗体的相关性最为紧密，并且保护作用是血清型特异性的。肺炎链球菌是婴儿及幼童侵袭性细菌病和中耳炎最常见的原因。同样地，老年人对肺炎球菌疫苗的反应也较差[Roghmann等(1987),J.Gerontol42:265-270]，因此，细菌性肺炎的发病率在这一人群中升高[Verghese和Berk,(1983)Medicine(Baltimore)62:271-285]。由肺炎链球菌所引起的主要临床症候群已得到了普遍认识，有关论述见标准医学教科书(FedsonDS,MuscherDM.载于PlotkinSA,OrensteinWA编辑，Vaccines.第4版，PhiladelphiaWBSaundersCo,2004a:529-588)。例如，4曼袭性肺炎王求菌疾病(Invasivepneumococcaldisease,IPD)定义为在血液或其它正常无菌部位分离出肺炎链球菌的"f壬Y可感染(MusherDM.Streptococcuspneumoniae.载于MandellGL，BennettJE,DolinR(编辑).PrinciplesandPracticeofInfectiousdiseases(第5版).NewYork,ChurchillLivingstone,2001，第2128-2147页)。一般认为慢性阻塞性肺病(COPD)包括通常同时存在的几种病况(气流阻塞、慢性支气管炎、纟田支气管炎或小气道疾病(smallairwaysdisease)及肺气肿)。患者受累于其病况的恶化，这些疾病通常与气喘加重有关，并且常常咳出粘液或脓性痰的咳嗽加重(Wilson，EurRespirJ200117:995-1007)。COPD在生理学上定义为患有慢性支气管炎和/或肺气肿的患者存在不可逆或部分可逆的气道阻塞(Standardsforthediagnosisandcareofpatientswithchronicobstructivepulmonarydisease(慢性阻塞性肺病患者的诊断与治愈标准).AmericanThoracicSociety.AmJRespirCritCareMed.1995年11月;152(5Pt2):S77-121)。COPD的恶化常常是由细菌(例如肺炎球菌)感染引起的(SethiS，MurphyTF.Bacterialinfectioninchronicobstructivepulmonarydiseasein2000:astate-of-the-artreview(2000例慢性阻塞性肺病中的细菌性感染现有技术综述).ClinMicrobiolRev.2001年4月；14(2):336-63)。因此，本发明的目的是开发出改进的多种血清型肺炎链球菌多糖缀合物疫苗的制剂。附图简述图1.柱状图表示老年猕猴(Rhesusmonkey)的ll价缀合物免疫原性。颜色较浅的直方柱表示两次接种磷酸铝佐剂中的11价缀合物后的GMC。颜色较深的直方柱表示两次接种C佐剂中的ll价缀合物的GMC。图2.柱状图表示接种C佐剂或磷酸铝佐剂中的11价缀合物针对PS3的i己忆B细月包。图3.柱状图表示Balb/C小鼠对于4价单纯多糖和4价dPly缀合物的抗多糖19F免疫原性。图4.柱状图表示Balb/C小鼠对于4价单纯多糖和4价PhtD缀合物的抗多糖22F免疫原性。图5.柱状图表示Balb/c小鼠的抗22FIgG应答。图6.柱状图表示Balb/c小鼠的抗22F调理吞噬效价。图7.柱状图表示对C57B1幼小鼠用不同佐剂配制的13价缀合物疫苗进行免疫后所诱导的IgG应答进行比较。图8.柱状图表示猴肺炎模型中不同疫苗组合的保护性功效。图9.柱状图表示Balb/c小鼠用22F-PhtD或22F-AH-PhtD缀合物免疫后的抗PhtDIgG应答。图10.小鼠用22F-PhtD或22F-AH-PhtD免疫后产生的针对4型肺炎球菌攻击的保护作用。
发明内容本发明提供改进的肺炎链球菌疫苗，该疫苗包含IO种以上(例如11、12、13、14或15种以上)荚膜糖，这些荚膜糖得自不同的肺炎链球菌血清型并与两种或更多种载体蛋白缀合，其中该疫苗包含与白喉类毒素或CRM197缀合的血清型19F荚膜糖，并且其中该疫苗任选还包含得自流感嗜血菌作为游离蛋白或作为另外的载体蛋白或既作为游离蛋白又作为另外的载体蛋白的D蛋白。对于本发明的目的，"针对COPD恶化对人宿主进行免疫"或"治疗或预防COPD恶化"或"减轻COPD恶化的严重性"均是指降低COPD恶化的发病率或比率(例如降低比率0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%或以上)或者在例如用本发明组合物或疫苗免疫的患者组中减轻如上所规定的COPD恶化的严重性。本发明的肺炎链球菌疫苗通常包含荚膜糖抗原(优选为缀合的)，其中所述糖由至少10种肺炎链球菌血清型中获得。肺炎链球菌荚膜糖数目的范围可为IO种不同的血清型(或者"V"，价)至23种不同的血清型(23V)。在一个实施方案中，有10、11、12、13、14或15种不同的血清型。在本发明另一个实施方案中，疫苗可包含缀合的肺炎链球菌糖和未缀合的肺炎链球菌糖。优选糖血清型的总数《23种。例如，本发明可包含10种缀合的血清型和13种未缀合的糖。按类似方式，疫苗可分别包含ll、12、13、14、15或16种缀合的糖和12、11、10、9、8或7种未缀合的糖。在一个实施方案中，本发明的多价肺炎球菌疫苗选自以下的血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，虽然应当理解的是，可根据接受疫苗者的年龄和将给予疫苗的地理位置，替换成另外的一种或两种血清型，例如血清型6A可包4舌在列举明细中。例如，10价疫苗可包含得自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。11价疫苗还可包括得自血清型3的糖。12价或13价儿童(嬰幼儿)用疫苗也可包括补充了血清型6A和19A、或6A和22F、或19A和22F、或6A和15B、或19A和15B、或22F和15B的10价或11价制剂，而13价老年人用疫苗可包括补充了血清型19A和22F、8和12F、或8和15B、或8和19A、或8和22F、或12F和15B、或12F和19A、或12F和22F、或15B和19A、或15B和22F的11价制剂。14价儿童用疫苗可包括补充了以下血清型的上述IO价制剂血清型3、6A、19A和22F;血清型6A、8、19A和22F;血清型6A、12F、19A和22F;血清型6A、15B、19A和22F;血清型3、8、19A和22F;血清型3、12F、19A和22F;血清型3、15B、19A和22F;血清型3、6A、8和22F;血清型3、6A、12F和22F;或血清型3、6A、15B和22F。一个实施方案的组合物包括得自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖(优选是缀合的)。在本发明又一个实施方案中，包括至少11种糖抗原(优选是缀合的)，例如得自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖。在本发明又一个实施方案中，包括至少12种或13种糖抗原，例如，疫苗可包含由血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F获得的荚膜糖，或者由血清型l、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F获得的荚膜糖，尽管其它糖抗原，例如23价(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)也包括在本发明中。本发明的疫苗可包含得自流感嗜血菌的D蛋白(PD)(参见例如EP0594610)。流感嗜血菌是中耳炎关键的致病生物，本发明的发明人提出在肺炎链球菌疫苗中包含这一蛋白质将提供针对流感嗜血菌相关中耳炎的保护水平(参阅POET出版物)。在一个实施方案中，疫苗组合物包含D蛋白。一方面，PD作为一种或多种糖的载体蛋白存在。另一方面，D蛋白可作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。再一方面，D蛋白既作为载体蛋白又作为游离蛋白存在。D蛋白可以全长蛋白或以片段使用(WO0056360)。再一方面，D蛋白以作为大多数糖的载体蛋白存在，例如6、7、8、9种以上的糖可与D蛋白缀合。在这一方面，D蛋白还可以游离蛋白存在。本发明的疫苗包含两种以上不同类型的载体蛋白。每种类型的载体蛋白可作为一种以上糖的载体而起作用，所述糖可以相同或不同。例如，血清型3和4可与同一载体蛋白缀合，或与载体蛋白的同一分子缀合，或与同一载体蛋白的不同分子缀合。在一个实施方案中，两种以上不同的糖可与同一载体蛋白缀合，或与载体蛋白的同一分子缀合或与同一载体蛋白的不同分子缀合。每种肺炎链球菌荚膜糖可与独立选自以下的载体蛋白缀合TT、DT、CRM197、TT的C片段、PhtD、PhtDE融合物(特别是WO01/98334和WO03/54007中所述的载体蛋白)、脱毒肺炎链球菌溶血素和D蛋白、得自血清型19F以外总是与DT或CRM197缀合(优选与DT缀合)的糖。可用于本发明缀合物一个较完整的蛋白载体列举明细见下文。如果组合物中对于两种或更多种糖的蛋白载体相同，则糖可与该蛋白载体的同一分子缀合(载体分子具有2种以上不同的糖与其缀合)[参见例如WO04/083251]。或者，糖可各自独立与蛋白载体的不同分子缀合(蛋白载体的每种分子仅有一种类型的糖与其缀合)。在存在于本发明免疫原性组合物的缀合物中，与一种或多种肺炎链球菌荚膜糖缀合的载体蛋白任选地为多聚组氨酸三联体家族(polyhistidinetriadfamily,Pht)蛋白成员、其片#爻或其融合蛋白。PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白的氨基酸序列与WO00/37105或WO00/39299中所公开的序列(例如对于PhtD与WO00/37105的SEQIDNO:4的氨基酸序列1-838或21-838)可共享80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的同一性。例如，融合蛋白由全长PhtA、全长PhtB、全长PhtD、全长PhtE中的2、3或4种组成，或者由PhtA片段、PhtB片段、PhtD片段、PhtE片段中的2、3或4种组成。融合蛋白的实例为PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D,其中所述蛋白与在先提及的蛋白在N端连接(参见例如WO01/98334)。如果使用Pht蛋白的片段(单独或作为融合蛋白的一部分)，则每个片段任选含有一个或多个组氨酸三联体基序和/或这些多肽的巻曲螺旋区。组氨酸三联体基序是具有序列HxxHxH的多肽部分，其中H为组氨酸，x为组氨酸以外的氨基酸。巻曲螺旋区是用"Coils"算法预测的区域(Lupus，A等(1991)Science252;1162-1164)。在一个实施方案中，该片段或者每个片段包括一个或多个组氨酸三联体基序以及至少一个巻曲螺旋区。在一个实施方案中，该片段或者每个片段含有正好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序(任选在两个或更多个三联体之间具有天然Pht序列，或者具有内三fl关体序列(intra-triadsequence)，其中内三联体序列与天然肺炎球菌内三联体Pht序列的同一性超过50%、60%、70%、80%、90%或100%-例如，在WO00/37105的SEQIDNO:4中所示的PhtD内三联体序列)。在一个实施方案中，该片段或者每个片段含有正好或至少2、3或4个巻曲螺旋区。在一个实施方案中，本文所公开的Pht蛋白包括连接了信号序列的全长蛋白、信号肽(例如N端的20个氨基酸)已被去除的成熟全长蛋白、天然存在的Pht蛋白变异体和Pht蛋白的免疫原性片段(例如上述片段或包含得自WO00/37105或WO00/39299氨基酸序列的至少15或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够诱导对WO00/37105或WO00/39299中所述氨基S交序列特异性的免疫应答)。具体地讲，本文所用术语"PhtD"包括连接了信号序列的全长蛋白、信号肽(例如N端的20个氨基酸)已被去除的成熟全长蛋白、天然存在的PhtD变异体和PhtD的免疫原性片段(例如上述片段或包含得自WO00/37105或WO00/39299中的PhtD氨基酸序列的至少15或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够诱导对WO00/37105或WO00/39299中所述PhtD氨基酸序列(例如WO00/37105中PhtD的SEQIDNO:4)特异性的免疫应答。如果蛋白载体对组合物中的两种或更多种糖是相同的，则糖可与载体蛋白的同一分子缀合(载体分子有2种以上不同的糖与之缀合)[参见例如WO04/083251]。或者，糖可以各自单独与蛋白载体的不同分子缀合(蛋白载体各个分子仅有一种类型的糖与之缀合)。可用于本发明的载体蛋白的实例为DT(白喉类毒素);TT(破伤风类毒素)或TT的C片段；DTCRM197(—种DT突变体)；其它DT点突变体，例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等，J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107和其它突变(参见Nicholls和Youle,载于GeneticallyEngineeredToxins,编辑Frankel,MaecelDekkerInc,1992);Glu-148缺失或突变为Asp、Gin或Ser，和/或Ala158缺失或突变为Gly，以及US4709017或US4950740中^^开的其它突变；Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534中至少一个或多个残基的突变，以及US5917017或US6455673中公开的其它突变；或US5843711中公开的片段；肺炎链球菌溶血素(Kuo等(1995)Infect.Immun.63;2706-13)，包括以某种方式脱毒的ply,例如dPLY-GMBS(WO04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-曱醛；PhtX,包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE，以及Pht蛋白的融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物(WO01/98334和WO03/5400"(PhtA-E有关详述见下文)；OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白一通常从脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群(iV.me"Z"gz'^foserogroupB)中提取一EP0372501);PorB(得自脑膜炎奈瑟氏球菌)；PD(流感嗜血菌D蛋白一参见例如EP0594610B)或其免疫功能等同物；合成肽(EP0378881、EP0427347);热激蛋白(WO93/17712、WO94/03208);百日咳蛋白(WO98/58668、EP0471177);细月包因子；'淋巴因子；生长因子或激素(WO91/01146);人工蛋白，包含得自各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位(Falugi等(2001)EurJImmunol31;3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等(2004)InfectImmun72;4884-7);肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998);铁吸收蛋白(ironuptakeprotein)(WO01/72337);艰难梭菌(C.^^"7e)的A毒素或B毒素(WO00/61761)。Nurkka等人(Nurkka等，/W/aWc/"yk;,/owsZ)^ease/owr"a/."(77人70朋-2004年11月)描述了具有所有血清型均与PD缀合的ll价肺炎球菌疫苗。然而，本发明的发明人指出，与PD缀合的19F相比，用与DT缀合的19F缀合物诱导的抗体调理吞噬活性得到改进。另外，本发明的发明人指出，观察到与DT缀合的19F与19A的交叉反应性较大。因此，本发明组合物的特征在于血清型19F与DT或CRM197缀合。一方面，血清型19F与DT缀合。免疫原性组合物余下的糖血清型全部与一种或多种不是DT的载体蛋白缀合(即仅19F与DT缀合)，或者可以在一种或多种不是DT的载体蛋白或是DT本身的载体蛋白之间分摊。在一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的所有血清型都与PD缀合。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD与TT或DT或CRM197之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，并且只有一种糖与TT缀合。在本实施方案的一个方面，所述一种糖为18C或12F。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，并且不超过2种糖与TT缀合。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT与DT或CRM197之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT与肺炎链球菌溶血素之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT与CRM197之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT、肺炎链球菌溶血素与任选PhtD或PhtD/E融合蛋白之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，19A与肺炎链球菌溶血素或TT缀合，另外的一种(两种或三种)糖与TT缀合，还有一种糖与PhtD或PhtD/E缀合，余下的所有糖都与PD缀合。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，19A与肺炎链球菌溶血素缀合，另外的一种(两种或三种)糖与TT缀合，还有一种糖与肺炎链球菌溶血素缀合，另外的两种糖与PhtD或PhtD/E缀合，另外余下的所有糖都与PD缀合。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含得自流感嗜血菌的D蛋白。在该实施方案中，如果PD不是其中一种用来缀合19F以外任何糖的载体蛋白，例如19F与DT缀合而其它血清型与一种或多种不同的不是PD的载体蛋白缀合，则PD作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。如果PD是一种用于缀合19F以外的糖的载体蛋白，则PD可任选作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。在本说明书全文中，术语"糖"可指多糖或寡糖并且包括多糖和寡糖。将多糖从细菌中分离出来，可按照已知方法(参见例如EP497524和EP497525),优选用微流化法，将多糖的大小减小到某种程度。为了降低多糖样品的粘度和/或改进缀合产品的滤过性，可将多糖的大小减小。寡糖的重复单元数目较少(通常5-30个重复单元)，通常为水解的多糖。肺炎链球菌的荚膜多糖包含重复的寡糖单元，寡糖单元可最多含有8个糖残基。有关重要的肺炎链球菌血清型寡糖单元的综述参见JONES,Christopher,Vaccinesbasedonthecellsurfacecarbohydratesofpathogenicbacteria(基于病原菌细月包表面津唐类的疫苗).爿w.Jcac/."ras.CKwc，2005年6月，第77巻，第2册，第293-324页，ISSN0001-3765。在一个实施方案中，荚膜糖抗原可以是全长多糖，然而在其它实施方案中，可以是l个寡糖单元，.或者不超过重复寡糖单元糖链的天然长度。在一个实施方案中，疫苗中存在的所有糖都为多糖。全长多糖的大小可以"减小"，也就是说它们的大小可通过各种方法减小，例如酸解处理、过氧化氢处理、通过emulsiflex⑧之后用过氧化氢处理，以产生寡糖片段；或者用微流化法将其减小。本发明的发明人还注意到，本领域的焦点一直是利用寡糖以便于缀合物的生产。本发明的发明人发现，采用天然多糖缀合物或其大小略微减小的多糖缀合物，可以获得一个或多个以下优势l)具有高免疫原性、可滤过的缀合物，2)缀合物中多糖与蛋白质的比率可以改变，使得缀合物中多糖与蛋白质的比率(重量/重量)可以增力口(这样可对载体抑制作用产生影响)，3)易水解的免疫原性缀合物可以通过采用较大的糖进行缀合而达到稳定。使用较大的多糖可导致与缀合载体更多的交联，并且可以减少从缀合物中释放出游离糖。现有技术所述的缀合物疫苗往往是为了改进缀合而在缀合前使多糖解聚。本发明的发明人发现糖保持较大尺寸的糖缀合物疫苗可以提供针对肺炎球菌疾病的良好的免疫应答。因此，本发明的免疫原性组合物可包含一种或多种糖缀合物，其中每种糖在缀合前的平均大小(例如重均分子量M一超过80kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或1000kDa。在一个实施方案中，本发明的一种或多种糖缀合物在缀合之前，糖的平均大小应为50-1600kDa、80-1400kDa、100-1000kDa、150-500kDa或200-400kDa(注意如果平均大小为Mw,则本文单位"kDa"应当用"x103，，代之)。在一个实施方案中，缀合后的缀合物应当易通过0.2微米滤器过滤，使得与过滤前的样品比较时，过滤后可获得的收率超过50%、60%、70%、80%、90%或95%。对于本发明的目的，"天然多糖"是指还未经过加工的糖(例如纯化后的糖)，加工的目的在于减小糖的大小。在正常纯化过程中多糖的大小可略微减小。这样的糖仍是天然糖。只有多糖经过减小技术，该多糖才能^皮一见作不是天然糖。对于本发明的目的，"按高达2倍(x2)的因数减小"是指将糖进行加工，使糖的大小减小但仍保持其大小为天然多糖大小的一半以上。x3、x4等以此类推，也就是说将糖进行加工，使多糖的大小减小但仍保持大小为天然多糖大小的三分之一、四分之一以上等。在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含得自至少10种血清型并与载体蛋白缀合的肺炎链球菌糖，其中至少l、2、3、4、5、6、7、8、9种或每种肺炎链球菌糖均为天然多糖。在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含得自至少10种血清型并与载体蛋白缀合的肺炎链球菌糖，其中至少l、2、3、4、5、6、7、8、9种或每种肺炎链球菌糖都按高达x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或xl0的因数减小。在这一方面的一个实施方案，多种糖，例如6、7、8种以上的糖按高达x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或xlO的因素减小。糖的分子量或平均分子量(或大小)在本文是指缀合前所测得的糖的重均分子量(Mw),通过MALLS进行测定。MALLS技术是本领域众所周知的，通常按照实施例2所述方法进行。对于肺炎球菌糖的MALLS分析，可以联合使用2个柱子(TSKG6000和5000PWxl)，用水洗脱糖。采用光散射4企测器(例如安装有10mW氩激光源的WyattDawnDSP,波长为488nm)和干涉型折光计(interferometricrefractometer)(例如安装有P100室和498nm红色滤光片的WyattOtilabDSP)对糖进行检测。在一个实施方案中，肺炎链球菌糖为天然多糖或为尺寸在正常提取过程中被减小的天然多糖。在一个实施方案中，肺炎链球菌糖通过机械裂解(例如通过微流化或超声处理)被减小。微流化和超声处理的优势是将较大的天然多糖的大小减小到足以提供可滤过的缀合物。按不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因数减小。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌缀合物，该肺炎链球菌缀合物由天然多糖和按不超过x20因数减小的糖的混合物制备。在本实施方案的一个方面，大部分糖，例如6、7、8种以上的糖按高达x2、x3、x4、x5或x6的因数减小。在一个实施方案中，肺炎链球菌糖通过连接基(例如双官能连接基)与载体蛋白缀合。连接基任选为异双官能或同双官能的，具有例如1个反应性氨基(reactiveaminogroup)和1个反应性羧基、2个反应性氨基或2个反应性羧基。连接基具有例如4-20个、4-12个、5-10个碳原子。一种可能的连接基是ADH。其它连接基包括B-丙酰胺基(WO00/10599)、硝基苯基乙胺(Gever等(1979)Med.Microbiol.Immunol.165;171-288)、卣代烷基卣(US4057685)、糖苷4建(US4673574、US4808700)、己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一个实施方案中，ADH用作连接基与得自血清型18C的糖缀合。在一个实施方案中，ADH用作连接基与得自血清型22F的糖缀合。联技术制备。缀合方法可依赖于四氟硼氟酸l-氰基-4-二曱氨基吡啶输(CDAP)使糖活化以形成氰酸酯。活化的糖从而可以直接或通过间隔基(连接基)与载体蛋白上的氨基偶联。例如，间隔基可以是胱胺或半胱胺以得到硫醇化多糖，硫醇化多糖可以通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如采用GMBS)反应或者与卣代乙酰化载体蛋白(例如采用碘乙酰胺[例如乙基缺乙酰胺盐酸盐]反应或者与溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯(N-succinimidylbromoacetate)或SIAB或SIA或SBAP)反应后所获得的硫醚键而与载体偶联。优选氰酸酯(任选由CDAP化学法制备)与己二胺或ADH偶联，氨基衍生化糖采用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学法通过蛋白载体上的^&与载体蛋白缀合。这类缀合物可参见公布的PCT申请WO93/15760UniformedServicesUniversity和WO95/08348和WO96/29094。其它合适的技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酉旨、降茨烷(norborane)、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。大多数可参见WO98/42721。缀合可包括通过糖的游离羟基与CDI反应形成的羰基连接基(Bethell等，J.Biol.Chem.1979,254;2572-4;Hearn等，J.Ch醒atogr.1981.218;509-18),随后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯键。这可包括端基还原为伯羟基(任选伯羟基与CDI反应以形成CDI氨基甲酸酯中间体以使伯羟基受保护/脱保护)以及CDI氨基曱酸酯中间体与蛋白质的氨基偶联。缀合物也可通过直接还原性胺化法制备，参见US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)。其它方法参见EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。另一种方法包括经溴化氰(或CDAP)活化的糖用己二酸二酰肼(ADH)衍生化后，再与蛋白载体通过碳二亚胺缩合反应而偶联(ChuC等，InfectImmunity,1983245256)，例如采用EDAC。在一个实施方案中，糖上的羟基(优选活化羟基，例如使羟基活化以制备氰酸酯[例如与CDAP反应])与蛋白质上的氨基或羧基直接或间接(通过连接基)连接。如果存在连接基，则糖上的羟基优选与连接基上的氨基连接，例如用CDAP缀合。连接基(例如ADH)上的另一个氨基可与蛋白质上的羧基缀合，例如釆用碳二亚胺化学法，例如采用EDAC。在一个实施方案中，肺炎球菌荚膜糖先与连接基缀合后，连接基再与载体蛋白缀合，或者连接基与载体缀合后再与糖缀合。还可采用联合技术，一些糖-蛋白质缀合物通过CDAP制备，另一些通过还原性胺化制备。一般而言，以下类型的蛋白载体的化学基团可用于偶联/缀合A)羧基(例如通过天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接与糖上的氨基连接或者经碳二亚胺化学法(例如EDAC)与连接基上的氨基连接。B)氨基(例如通过赖氨酸)。在一个实施方案中，该基团直4妄与糖上的羧基连接，或者经碳二亚胺化学法(例如EDAC)与连接基上的羧基连接。在另一个实施方案中，氨基与糖上用CDAP或CNBr活化的羟基直接连接或者与连接基上这种基团连接；与具有醛基的糖或连接基连接；具有琥珀酰亚胺酯基的糖或连接基连接。C)琉基(例如通过半胱氨酸)。在一个实施方案中，该基团与溴乙酰化糖或氯乙酰化糖或者与马来酰亚胺化学法的连接基连接。在一个实施方案中，该基团是用双二重氮联苯胺(bisdiazobenzidine)活化/修饰的。D)羟基(例如通过酪氨酸)。在一个实施方案中，该基团是用双二重氮联苯胺活化/修饰的。E)咪唑基(例如通过组氨酸)。在一个实施方案中，该基团是用双二重氮联苯胺活化/修饰的。F)胍基(例如通过精氨酸)。G)吲哚基(例如通过色氨酸)。一般而言，在糖上的下列基团可用于偶联OH、COOH或NH2。可以在本领域已知的各种处理后产生醛基，例如高碘酸盐、加酸水解、过氧化氢等。直接偶联法糖-OH+CNBr或CDAP——>氰酸酯+NHr蛋白质——>缀合物糖-醛+NHr蛋白质——>席夫碱(Schiffbase)+NaCNBH3——>缀合物糖-COOH+NH2-蛋白质+EDAC——>缀合物糖-NH2+COOH-蛋白质+EDAC——>缀合物通过间隔基(连接基)间接偶联法糖画OH+CNBr或CDAP——>氰酸酯+NHrNH2——〉糖-NH2+COOH-蛋白质+EDAC——>缀合物糖-OH+CNBr或CDAP——>氰酸酯+NH2-SH——>糖-SH+SH-蛋白质(半胱氨酸暴露出来的天然蛋白质或通过例如SPDP》务饰蛋白质的氨基而获得的蛋白质)-—>糖-S-S-蛋白质糖-OH+CNBr或CDAP——〉氰酸酯+NH2-SH——>糖-SH+马来酰亚胺-蛋白质(氨基修饰)--->缀合物糖-OH+CNBr或CDAP——>氰酸酯+NH2-SH-—>糖-SH+卣代乙酰化-蛋白质一->缀合物糖-COOH+EDAC+NH2-NH2——>糖画NH2+EDAC+COOH-蛋白质——>缀合物糖-COOH+EDAC+NH2-SH-->糖-SH+SH-蛋白质(半胱氨酸暴露出来的天然蛋白质或通过例如SPDP修饰蛋白质的氨基获得的蛋白质)--—〉糖-S-S-蛋白质糖-COOH+EDAC+NH2-SH——>糖-SH+马来酰亚胺-蛋白质(氨基修饰)…—>缀合物糖-COOH+EDAC+NH2-SH——>糖-SH+囟代乙酰化-蛋白质——〉缀合物糖-醛+NHrNH2--—>糖-NH2+EDAC+COOH-蛋白质——〉缀合物注意除了上述EDAC外，还可以使用任何合适的^友二亚胺。总之，通常用于与糖偶联的蛋白载体化学基团的类型为氨基(例如赖氨酸残基上的氨基)、COOH基团(例如天冬氨酸和谷氨酸残基上的羧基)和SH基团(如可及的话)(例如半胱氨酸残基上的SH)。优选载体蛋白与肺炎链球菌糖的比率介于1:5和5:1之间；例如介于1:0.5-4:1、1:1-3.5:1、1.2:1-3:1、1.5:1-2.5:1之间；例如介于1:2和2.5:1之间；介于1:1和2:1之间(重量/重量)。在一个实施方案中，大部分缀合物，例如6、7、8、9个以上的缀合物中的载体蛋白与糖的比率大于l:l，例如1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1,5:1或1.6:1。在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌糖用CDAP和EDAC通过连接基与载体蛋白缀合。例如，18C或22F可按上述方法，用CDAP和EDAC通过连接基(例如其两端有2个肼基的连接基例如ADH)与蛋白质缀合。如果使用连接基，则CDAP可用来使糖与连接基缀合，而EDAC可用来使连接基与蛋白质缀合，或者EDAC可先用来使连接基与蛋白质缀合，之后可再用CDAP使连接基与糖缀合。一般而言，本发明的免疫原性组合物可包含各种糖缀合物，其中糖的剂量介于0.1-20吗之间、l-10吗之间或者l-3吗之间。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有各种肺炎链球菌荚膜糖，其中糖的剂量介于0.1-20|ig、0.5-10昭、0.5-5吗或l-3|ig之间。在一个实施方案中，荚膜糖可以不同的剂量存在，例如一些荚膜糖存在的剂量正好为l吗，或者一些荚膜糖存在的剂量正好为3吗。在一个实施方案中，得自血清型3、18C和19F(或血清型4、18C和19F)的糖存在的剂量要比其它糖的剂量高。在本实施方案的一个方面，血清型3、18C和19F(或血清型4、18C和19F)存在的剂量大约或正好为3昭，而免疫原性组合物中其它糖存在的剂量大约或正好为l吗。对于本发明的目的，"约"或"大约"定义为在给定值的10%左右。在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白直接缀合(例如采用上述化学反应之一)。优选至少一种肺炎链球菌荚膜糖用CDAP直接缀合。在一个实施方案中，大部分荚膜糖，例如5、6、7、8、9种以上用CDAP直接与载体蛋白连接(参见WO95/08348和WO96/29094)。免疫原性组合物可包含肺炎链球菌蛋白，本文称为本发明的肺炎链球菌蛋白。这种蛋白质可以用作载体蛋白，或者可以作为游离蛋白存在，或者可以既以载体蛋白又以游离蛋白存在。本发明的肺炎链球菌蛋白或是表面暴露的(至少肺炎球菌生命周期的某一阶段)，或者是由肺炎球菌分泌或释放的蛋白质。优选本发明的蛋白质选自以下种类，例如具有LXXC的II型信号序列基序的蛋白(其中X为任何氨基酸，例如多聚组氨酸三联体家族(PhtX))、胆碱结合蛋白(CbpX)、具有I型信号序列基序的蛋白(例如SplOl)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X为任何氨基酸，例如Spl28、Spl30)和毒素(例如Ply)。这些种类(或基序)范围内的优选实例是以下蛋白质或其免疫功能等同物。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种选自以下的蛋白质多聚組氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SplOl、Spl30、Spl25和Sp133。在又一个实施方案中，免疫原性組合物包含两种或更多种选自以下的蛋白质多聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在又一个实施方案中，免疫原性组合物包含两种或更多种选自以下的蛋白质多聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)、肺炎链球菌溶血素(Ply)和Spl28。Pht(多聚组氨酸三联体)家族包含蛋白质PMA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族的特征是脂质化序列(lipidationsequence),被一个富含脯氨酸区和若干组氨酸三联体分隔成两个结构域(可能涉及金属或核苷结合或酶活性)、(3-5个)巻曲螺旋区、保守的N端和异源C端。它存在于所测试的所有肺炎球菌菌抹中。还发现在其它链球菌属和奈瑟氏球菌属(A^wen'fl)中存在同源蛋白质。在本发明一个实施方案中，本发明的Pht蛋白是PhtD。然而，要理解的是，术语PhtA、PhtB、PhtD和PhtE是指具有以下引用文献中所公开序列的蛋白质及其天然存在的(和合成的)变异体，该变异体具有与参比蛋白有至少90%同一性的序列同源物，优选有至少95%同一性，更优选有97%同一性。至于PhtX蛋白，PhtA公开于WO98/18930，亦称Sp36。正如上面所注意到的一样，它是得自多聚组氨酸三联体家族的蛋白质，具有II型LXXC信号基序。PhtD公开于WO00/37105，亦称Sp036D。正如上面所注意到的一样，它也是得自多聚组氨酸三联体家族的蛋白质，具有II型LXXC信号基序。PhtB公开于WO00/37105，亦称Sp036B。PhtB家族的另一成员是C3-降解多肽，公开于WO00/17370。这一蛋白质也得自多聚组氨酸三联体家族，并具有II型LXXC信号基序。优选的免疫功能等同物是公开于WO98/18930的蛋白Sp42。PhtB截短物(大约79kD)公开于WO99/15675,也有人认为是PhtX家族的成员。PhtE公开于WO00/30299，亦称BVH-3。当本文提及任何Pht蛋白时，是指可以使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合物。例如，提及PhtX则包括任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合物。提及PhtD或PhtB也就提及到PhtDE或PhtBE融合物，参见例如WO0198334。肺炎链球菌溶血素是具有独特溶细胞(溶血)活性和补体活化活性的多功能毒素(Rubins等，Am.Respi.CitCareMed,153:1339-1346(1996))。该毒素不是由肺炎球菌分泌的，而是在自溶素的影响下在肺炎球菌裂解时释放出来的，其作用包括例如刺激人单核细胞产生炎性细胞因子，抑制人呼吸道上皮纤毛的击打，降低杀菌活性和嗜中性粒细胞迁移。肺炎链球菌溶血素最明显的作用是溶解红细胞，这包括与胆固醇结合。因为它是一种毒素，所以在给予体内前需要脱毒(即当以适于保护的剂量提供时应对人体无毒性)。野生型或天然肺炎链球菌溶血素的表达和克隆是本领域所知的。参见例如Walker等(InfectImmun，55:1184-1189(1987))、Mitchell等(BiochimBiophysActa,1007:67-72(1989)和Mitchell等(NAR,18:4010(1990))。可以通过化学方法例如用福尔马林或戊二醛或这两种溶液的组合处理，对ply进行脱毒(WO04081515、PCT/EP2005/010258)。对于各种毒素，这些方法是本领域众所周知的。或者，ply可以通过遗传方法脱毒。因此，本发明包括肺炎球菌蛋白的衍生物，它可以是例如突变蛋白。本文所用术语"突变"是指应用众所周知的定点诱变技术或任何其它常用方法，使分子经历缺失、添加或取代一个或多个氨基酸。例如，按照上述方法可以改变突变型ply蛋白，使之在生物学上没有活性但又保留其免疫原性表位，参见例如WO90/06951、Berry等(InfectImmun,67:981-985(1999))和WO99/03884。要理解的是，本文所用术语"Ply"是指适于医用的经突变或脱毒(即无毒)的肺炎链球菌溶血素。关于胆碱结合蛋白家族(CbpX),该家族的成员最初被鉴定为可用胆碱亲和色谱法纯化的肺炎球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白与细胞壁磷壁酸和与膜締合的脂磷壁酸的磷酰胆碱部分非共价地结合。虽然在结构上该蛋白质的确切性质(氨基酸序列、长度等)可以发生改变，但是它们却都具有整个家族共有的数个区域。一般而言，胆碱结合蛋白包括N端区(N)、保守重复区(R1和/或R2)、富含脯氨酸区(P)和保守胆碱结合区(C),构成了占该蛋白质大约一半的多个重复区。本申请所用术语"胆碱结合蛋白家族(CbpX)"选自WO97/41151中所鉴定的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公开于WO97/41151。CbpD和CbpG公开于WO00/29434。PspC公开于WO97/09994。PbcA公开于WO98/21337。SpsA为WO98/39450中所公开的胆碱结合蛋白。优选胆碱结合蛋白选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。另一个优选的实施方案是CbpX截短物，其中"CbpX"如上定义，"截短物"是指缺少50。/。以上胆碱结合区(C)的CbpX蛋白。优选这类蛋白质缺少完整的胆碱结合区。更优选这类蛋白质截短物缺少(i)胆碱结合区，也缺少(ii)蛋白质N端一半的部分，但仍保留至少1个重复区(R1或R2)。还更优选截短物具有2个重复区(R1和R2)。该优选的实施方案的实例是WO99/51266或WO99/51188所示的NRlxR2和RlxR2，然而，缺少类似胆碱结合区的其它胆碱结合蛋白也包括在本发明范围内。LytX家族是与溶解细胞有关的膜締合蛋白。N端域包括胆碱结合域，然而LytX家族不具有上述CbpA家族存在的所有特征，因此本发明认为，LytX家族完全不同于CbpX家族。与CbpX家族相比，C端域含有LytX蛋白家族的催化域。该家族包括LytA、LytB和LytC。至于LytX家族，LytA公开于Ronda等，EurJBiochem,164:621-624(1987)。LytB公开于WO98/18930，亦称Sp46。LytC同样公开于WO98/18930,亦称Sp91。该家族优选的成员是LytC。另一个优选的实施方案是LytX截短物，其中"LytX"如上定义，"截短物"是指LytX蛋白缺少50%以上的胆碱结合区。优选这类蛋白质缺少完整的胆碱结合区。本发明的又一个优选的实施方案是CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)。优选这一蛋白质包含CbpX的NRlxR2(或RlxR2)和LytX的C端部分(Cterm，即缺少胆碱结合区)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更优选CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。还更优选为CbpA。优选LytX是LytC(亦称Sp91)。本发明的另一个实施方案是缺少胆碱结合区(C)的PspA或PsaA截短物，用与LytX的融合蛋白表示。优选LytX是LytC。至于PsaA和PspA,两者都是本领域所知的。例如PsaA及其跨膜缺失变异体记载于Berry和Paton,InfectImmun1996年12月；64(12):5255-62。PspA及其跨膜缺失变异体公开于例如US5804193、WO92/14488和WO99/53940。Spl28和Spl30公开于WO00/76540。Spl25是具有LPXTG(其中X为任何氨基酸)的细胞壁锚定基序(CellWallAnchoredmot的的肺炎球菌表面蛋白的实例。已经发现具有这一基序的该类肺炎球菌表面蛋白范围内的任何蛋白质均可用于本发明的内容中，因此^皮认为是本发明的另一种蛋白质。Spl25本身公开于WO98/18930,亦称ZmpB-一种锌金属蛋白酶。Spl01公开于WO98/06734(其中的检索号为y85993)。其特征是I型信号序列。Spl33公开于WO98/06734(其中的^r索号为y85992)，其特征也是I型信号序列。莫拉氏菌(Moraxe〃acflta玎/mfc)蛋白抗原的实例是OMP106[WO97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)];OMP21或其片4爻[(WO0018910);LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)];TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)];C叩B[HelminenME等(1993)Infect.Immun.61:2003-2010];UspAl和/或UspA2[WO93/03761(UniversityofTexas)];OmpCD;HasR(PCT/EP99/03824);PilQ(PCT/EP99/03823);OMP85(PCT/EP00/01468);lipo06(GB9917977.2);lipo10(GB9918208.1);lipoll(GB9918302.2);lipo18(GB9918038.2);P6(PCT/EP99/03038);D15(PCT/EP99/03822);OmpIAl(PCT/EP99/06781);Hly3(PCT/EP99/03257)和OmpE。可以包括在4关合疫苗(尤其用于预防中耳炎)中的未分型流感嗜血菌抗原或其片段的实例包括微丝结合蛋白(Fimbrinprotein)[(US5766608-OhioStateResearchFoundation)]和包含其肽的融合物[例如LB1(f)肽融合物；US5843464(OSU)或WO99/64067];OMP26[WO97/01638(Cortecs)];P6[EP281673(StateUniversityofNewYork)];TbpA和/或TbpB;Hia;Hsf;Hin47;Hif;Hmwl;Hmw2;Hmw3;Hmw4;Hap;D15(WO94/12641);P2和P5(WO94/26304)。本发明的蛋白质还可以为了获益而组合使用。所谓组合是指免疫原性组合物包含在以下组合范围内的所有蛋白质，或作为载体蛋白，或作为游离蛋白，或者是两者的混合物。例如，本文下述两种蛋白质的组合，两种蛋白质均可用作载体蛋白，或者两种蛋白质均可作为游离蛋白存在，或者两种蛋白既可作为载体又可作为游离蛋白存在，或者一种蛋白可作为载体蛋白和游离蛋白存在，而另一种蛋白只作为载体蛋白或只作为游离蛋白存在，或者一种蛋白作为载体蛋白存在，另一种蛋白作为游离蛋白存在。如果给出三种蛋白质的组合，则存在类似的可能性。优选的组合包括^旦不限于PhtD+NRlxR2、PhtD+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NRlxR2、PhtA+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、丽xR2+LytC、NRlxR2+PspA、NRlxR2十PsaA、NRlxR2十Spl28、RlxR2+LytC、RlxR2+PspA、RlxR2+PsaA、RlxR2+Sp128、RlxR2+PhtD、RlxR2+PhtA。优选NRlxR2(或RlxR2)得自CbpA或PspC。更优选得自CbpA。其它组合包括3种蛋白质组合，例如PhtD+NRlxR2+Ply和PhtA+NRlxR2+PhtD。在一个实施方案中，疫苗组合物包含脱毒肺炎链J求菌溶血素和PhtD或PhtDE作为载体蛋白。在又一个实施方案中，疫苗组合物包含脱毒肺炎链球菌溶血素和PhtD或PhtDE作为游离蛋白。本发明另提供含有本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。本发明的疫苗可以加有佐剂，特别是欲用于老年人群但同样用于嬰幼儿人群时。合适的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾，但还可为钩盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可为乙酰化酪氨酸或乙酰化糖、阳离子或阴离子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混悬液。优选所选用的佐剂为TH1型应答的优先诱导物。这种高水平的Thl型细胞因子往往有利于诱导细胞介导的针对给定抗原的免疫应答，同时高水平的Th2型细胞因子往往有利于诱导针对抗原的体液免疫应答。Thl型和Th2型免疫应答的区分并不是绝对的。实际上个体将支持被认为主要是Thl或主要是Th2的免疫应答。然而，根据Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT细胞克隆中所述，这种区分通常便于研究细胞因子家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R丄.(1989)THlandTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties(TH1和TH2细胞不同模式的淋巴因子分泌导致不同的功能性质).AnnualReviewofImmunology,7，第145-173页。从传统上讲，Thl型应答与由T淋巴细胞产生INF-y和IL-2细胞因子有关。通常直接与Thl型免疫应答诱导有关的其它细胞因子并不是由T细胞产生的(例如IL-12)。相比之下，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。促进主要是Thl应答的合适的佐剂系统包括单磷酰脂质A或其衍生物，特别是3-脱-0-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)(有关它的制备参见GB2220211A);和单磷酰脂质A、优选3-脱-0-酰化单磷酰脂质A与铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳液的组合。在这种组合中，抗原和3D-MPL包含在同一颗粒结构中，使得更有效地传递抗原信号和免疫刺激信号。研究显示3D-MPL能够进一步提高明矾吸附性抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine(1998)16:708-14;EP689454-B1]。一种强化系统包括单磷酰脂质A和皂苦衍生物的组合、特别是QS21和3D-MPL的组合(参见WO94/00153)，或者其中QS21是被胆固醇摔灭的反应原性较弱的组分(参见WO96/33739)。包括水包油乳液中的QS21、3D-MPL和生育酚的一个特别有效的佐剂制剂参见WO95/17210。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外还包含皂苷，它可以是QS21。该制剂还可包含水包油乳液和生育酚(WO95/17210)。含有未甲基化CpG的寡核苷酸(WO96/02555)和其它免疫调节性寡核苦酸(WO0226757和WO03507822)也是TH1应答的优先诱导物，并且适用于本发明。具体的佐剂是选自以下的佐剂金属盐、水包油乳液、Toll样受体激动剂(特别是Toll样受体2激动剂、Toll样受体3激动剂、Toll样受体4激动剂、Toll样受体7激动剂、Toll样受体8激动剂和To11样受体9激动剂)、皂苷或其组合。可以与本发明疫苗组合物一起使用的佐剂为bleb或得自革兰氏阴性菌菌林外膜小泡的制备物，例如WO02/09746中所述菌抹-特别是脑膜炎奈瑟氏球菌bleb。bleb的佐剂性质可通过将LOS(脂寡糖)保留在其表面(例如用低浓度的洗涤剂^是取[例如0-0.1%脱氧胆酸盐])而得到改进。可通过WO02/09746中所述的msbB(-)或htrB(-)突变对LOS进行脱毒。还可通过保留得自脑膜炎球菌bleb的PorB(和任选除去PorA)来改进佐剂性质。可以通过将脑膜炎球菌bleb上LOS的外核心*#结构截短来改进佐剂性质-例如通过WO2004/014417所述的IgtB(-)突变。或者，可对上述LOS(例如从msbB(-)和/或IgtB(-)菌抹分离出的LOS)进行纯化，并用作本发明组合物的佐剂。可用于本发明组合物的另一种佐剂可选自皂苷、脂质A或其衍生物、免疫调节性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳液或其组合。另一种优选的佐剂是与其它佐剂组合的金属盐。优选佐剂为Toll样受体激动剂，特别是Toll样受体2、3、4、7、8或9的激动剂或皂苷，特别是Qs21。另还优选佐剂系统包含得自上述例举明细中的两种或更多种佐剂。特别是优选含有皂苷(特别是Qs21)佐剂和/或Toll样受体9激动剂例如含有CpG的免疫刺激寡核苷酸的组合。其它优选的组合包含皂苷(特别是QS21)和Toll样受体4激动剂例如单磷酰脂质A配体例如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。特别优选的佐剂是3D-MPL和QS21的组合(EP0671948Bl)、含有3D-MPL和QS21的水包油乳液(WO95/17210、WO98/56414)或者用其它载体配制的3D-MPL(EP0689454Bl)。其它优选的佐剂系统包含3DMPL、QS21和CpG寡核苷酸的组合，参见US6558670、US6544518。在一个实施方案中，佐剂是(或含有)Toll样受体(TLR)4配体，优选为激动剂，例如脂质A衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别是3-脱-0-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL可得自北美葛兰素史克生物制品公司(GlaxoSmithKlineBiologicalsNorthAmerica),主要促进对IFN-g(Thl)表型的CD4+T细胞应答。可按照GB2220211A公开的方法制备。从化学结构看，它是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A与3、4、5或6条酰化链的混合物。优选本发明组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒径可以使之通过0.22,过滤器进行过滤除菌。其制备可参见国际专利申请WO94/21292。已知并被视为TLR4激动剂的脂质A的合成衍生物包括但不限于OM174:(2-脱氧-6-0-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-0-膦酰基-卩-D-p比喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-a-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)(WO95/14026)OM294DP:1,10-双(二氢磷酸)-(3S,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]癸-l,10-二醇酯(WO99/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP:1-二氢磷酸10-(6-氨基己酸)-(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]癸-l,10-二醇酯(WO01/46127)可以使用的其它TLR4配体为烷基氨基葡糖苦磷酸酯(AGP)(例如WO9850399或US6303347中公开的烷基氨基葡糖苦磷酸酯(AGP)和AGP的制备方法)，或者AGP药学上可接受的盐(参见US6764840)。一些AGP是TLR4激动剂，另一些是TLR4拮抗剂。一般认为两种均可用作佐剂。用于本发明的其它优选的免疫刺激剂为QuilA及其衍生物。QuilA是从南美奎拉雅属皂树(QuillajasaponariaMolina)中分离出来的皂苷制备物，Dalsgaard等人于1974年首次提出QuilA具有佐剂活性(Dalsgaard等，"Saponinadjuvants(急香佐剂)",ArchivftirdiegesamteVirusforschung，第44巻，SpringerVerlag,Berlin,第243-254页)。已经用HPLC分离出QuilA的纯化片段，它保留了佐剂活性而无与QuilA相关的毒性(EP0362278)，例如QS7和QS21(亦称QA7和QA21)。QS-21是从奎拉雅属皂树(QuillajasaponariaMolina)的树皮中获得的天然皂苷，它诱导CD8十细胞毒性T细胞(CTL)、Thl细胞和显著的IgG2a抗体应答，是本发明范围内优选的皂苷。文献中记载了特别优选的QS21的具体制剂，这些制剂还包含甾醇(WO96/33739)。可以按以下形式分离出本发明制备部分的皂苷微团、混合微团(最好但不必只与胆盐混合)、或者ISCOM基质(EP0109942Bl)、脂质体或相关胶状结构(例如蠕虫样或环状多聚体复合物)或者当与胆固醇和脂质制备时为脂质结构/片层结构和薄片状、或者水包油乳液(例如参见WO95/17210)。皂苷可优选与金属盐締合，例如氢氧化铝或磷酸铝(WO98/15287)。优选皂苷以脂质体、ISCOM或水包油乳液的形式存在。一种强化系统包括单磷酰脂质A(或脱毒脂质A)与皂苷衍生物的組合，特别是QS21与3D-MPL的组合(参见WO94/00153)、或者其中QS21被胆固醇猝灭的反应原性较弱的组分(参见WO96/33739A)。一种水包油乳液中含有生育酚(含有或不含QS21和/或3D-MPL)的特别有效的佐剂制剂参见WO95/17210。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外还包含皂苷，它可以是QS21。还可采用免疫刺激寡核苷酸或任何其它Toll样受体(TLR)9激动剂。用于本发明佐剂或疫苗的优选的寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，优选含有两个或更多个二核苷酸CpG基序，其被至少3个、更优选至少6个以上核苷酸间隔开。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接着鸟噤呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常为脱氧核苷酸。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸之间为二硫代磷酸酯键，或更优选为硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯键和其它核苷酸间的化学键也在本发明的范围内。包括在本发明范围内的还有具有混杂的核苷酸间化学键的寡核苷酸。有关产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法参见US5,666,153、US5,278，302和WO95/26204。优选的寡核苷酸的实例具有下列序列，这些序列优选含有^5危代磷酸酯修饰的核苷酸间化学键。OLIGO1(SEQIDNO:l):TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826)OLIGO2(SEQIDNO:2):TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)OLIGO3(SEQIDNO:3):ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGOLIGO4(SEQIDNO:4):TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006)OLIGO5(SEQIDNO:5):TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)OLIGO6(SEQIDNO:6):TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456)替代的CpG寡核苷酸可包含上述优选的序列，其中有无关紧要的缺失或添加。本发明所用的CpG寡核苷酸可以用本领域已知的任何方法合成(例如参见EP468520)。这种寡核苷酸可方便地用自动合成仪进行合成。佐剂可为水包油乳液，或者可包含水包油乳液与其它佐剂組合。乳液系统的油相优选包含可代谢油。术语可代r謝油的含义是本领域众所周知的。可代谢可定义为"能够通过代谢被转化"(Dorland'sIllustratedMedicalDictionary,W.B.SandersCompany,第25版(1974))。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，对接受者是无毒的，并且能够通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是植物油的普遍来源。合成油也是本发明的一部分，可包括市售的油，例如NEOBEE⑧等。角鲨烯(2,6,10，15,19,23-六曱基-2，6,10,14，18,22-二十四碳六烯)是不饱和油，大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚油、米#:油和酵母中，是用于本发明特别优选的油。角鲨烯为可代谢油，因为它是胆固醇生物合成中的中间体(默克索引(Merckindex),第10版，检索号8619)。母育酚(例如维生素E)也常常用于油乳液佐剂中(EP0382271Bl、US5667784、WO95/17210)。本发明油乳液中所用的母育酚(优选水包油乳液)可以按照EP0382271Bl所述方法制备，其中母育酚可以是母育酚液滴的分散体，优选直径不超过1微米，任选含有乳化剂。或者，母育酚还与其它油联用，以形成油乳液的油相。可与母育酚耳关用的油乳液的实例见本文所述，例如上述可4^i射油。有研究提出水包油乳液佐剂本身用作佐剂组分(EP0399843B)，95/17210、WO98/56414、WO99/12565、WO99/11241)。有研究4是出其它油乳液佐剂，例如油包水乳液(US5,422,109、EP0480982B2)和水包油包水乳液(US5，424，067、EP0480981B)。所有这些均构成形成本发明佐剂和组合物的优选的油乳液系统(特别当掺入母育酚时)。更优选油乳液(例如水包油乳液)另还含有乳化剂，例如吐温80(TWEEN80)和/或甾醇，例如胆固醇。优选的油乳液(优选水包油乳液)含有可代谢的无毒油，例如角鲨烷、角鲨烯或生育酚例如a生育酚(以及优选角鲨烯和a生育酚两种)和任选乳化剂(或表面活性剂)，例如吐温80。甾醇(优选胆固醇)也可包括在内。水包油乳液的生产方法为本领域技术人员所熟知。一般来讲，该方法包括将含有母育酚的油相与表面活性剂(例如PBS/TWEEN80溶液)混匀，然后用匀浆器匀浆。本领域技术人员应当清楚的是，包括将混合物两次通过注射器针头的方法可适于少量液体的匀浆。同样，本领域技术人员可调整微乳化器(M110S微乳化机(Microfluidicsmachine)的乳化过程，最多为50个通道，时间2分钟，最大压力输入6巴(输出压力约850巴))以产生较少量或较大量的乳液。可采用常规实验进行调整，实验包括测量所得乳液，直到获得具有所需直径的油滴的制剂。水包油乳液中，油和乳化剂应在水性载体中。水性载体可为例如磷酸緩沖盐溶液。稳定的水包油乳液内的油滴大小优选不超过1微米，直径范围基本可为30-600nm，优选直径基本约为30-500nm，更优选直径基本为150-500nm，直径特别约为150nm,用光子相关光谱测量。在这一方面，80o/o(数量)的油滴应该在优选范围内，更优选超过90%和更优选超过95%(数量)的油滴在规定的大小范围内。存在于本发明油乳液中各成分的含量按常规在以下范围内0.5-20%或2-10%的油(占剂量总体积)，例如角鲨烯；2-10%的a生育酚(如存在时)和0.3-3。/。的表面活性剂，例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。优选油(优选角鲨烯)与母育酚(优选a生育酚)的比率Sl，因为这样可提供较稳定的乳液。乳化剂，例如吐温80或斯盘85(Span85)也可以大约1%的水平存在。本发明的疫苗另含有稳定剂在某些情况下可能是有益的是。优选的乳液系统的实例参见WO95/17210、WO99/11241和WO99/12565,其中公开了基于角鲨烯、a-生育酚和吐温80的乳液佐剂，任选与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL—起配制。因此，在本发明一个特别优选的实施方案中，本发明的佐剂另外还包含其它免疫刺激剂，例如LPS或其衍生物和/或皂苷。其它免疫刺激剂的实例如本文所述，另参见"VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach(疫苗i殳计—亚单^f立和佐剂方法)"1995,PharmaceuticalBiotechnology,第6巻，编辑Powell,M.F.和Newman,M.J.，PlenumPress,NewYorkandLondon,ISBN0-306-44867-X。在一个优选的方面，本发明的佐剂和免疫原性組合物含有溶于上述油乳液中的皂苷(优选QS21)和/或LPS衍生物(优选3D-MPL)，任选具有甾醇(优选胆固醇)。另外，油乳液(优选水包油乳液)可含有斯盘85和/或卵磷酯和/或三辛酸甘油酯。含有水包油乳液、甾醇和皂苷的佐剂参见WO99/12565。通常对于人用急苷(优选QS21)和/或LPS衍生物(优选3D-MPL)，在人用剂量的免疫原性组合物中存在的范围为每剂l吗-200昭，例如IO-IOO吗，优选10吗-50吗。通常油乳液(优选水包油乳液)将含有2-10%的可代谢油，优选含有2-10%的角鲨烯、2-10%的a生育酚和0.3-3%(优选0.4-2%)的乳化剂(优选吐温80[聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯])。如果角鲨烯和a生育酚都存在时，优选角鲨烯与a生育酚的比率S1,因为这样可提供稳定的乳液。斯盘85(失水山梨醇三油酸酯)可以0.5-1%的水平存在于本发明所用的乳液中。在某些情况下可能有益的是本发明免疫原性组合物和疫苗另含有稳定剂，例如其它乳化剂/表面活性剂，包括辛酸(默克索引，第10版，检索号1739)，其中三辛酸甘油酯是特别优选的。如果包括角鲨烯和皂苷(优选QS21),有益的是制剂也包括甾醇(优选胆固醇)，因为这使得乳液中油的总水平降低。这样使得制造成本降低，接种疫苗的总体舒适度得到改善，所获得的免疫应答也得到定性和定量的改进，例如IFN-Y产生改进。因此，本发明的佐剂系统中，可代谢油与皂苷比率(重量/重量)的范围通常为200:1-300:1,本发明还可用"低油"形式，可代谢油与皂苷比率的优选范围为1:1-200:1,优选20:1-100:1，更优选基本上为48:1，这种疫苗保留了所有成分有益的佐剂性质，却具有反应原性大为降低的特征。因此，特别优选的实施方案中角鲨烯与QS21的比率(重量/重量)范围为1:1-250:1，优选的范围还可为20:1-200:1,优选20:1-100:1，更优选基本上为48:1。优选甾醇(更优选胆固醇)也包括在内，皂苷与甾醇的比率如本文所述。本发明的乳液系统优选具有小的油滴，大小为亚孩炎米范围。更优选油滴大小的范围为120-750nm，更优选直径为120-600nm。特别有效的佐剂制剂(在本发明的免疫原性组合物中与A1P04的最终组合)包括皂苷(优选QS21)、LPS衍生物(优选3D-MPL)和油乳液(优选水包油乳液中的角鲨烯和a生育酚)，参见WO95/17210或WO99/12565(特别是实施例2表1的佐剂制剂11)。TLR2激动剂的实例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉类，例如咪喹莫德和瑞喹莫德是已知的TLR7激动剂。单链RNA也是已知的TLR激动剂(在人中的TLR8和在小鼠中的TLR7),而双链RNA和polyIC(聚肌胞苷酸---种市售的病毒RNA的合成模拟物)是示例性的TLR3激动剂。3D-MPL是TLR4激动剂的实例，而CPG是TLR9激动剂的实例。免疫原性组合物可包含吸附在金属盐上的抗原和免疫刺激剂。其中抗原和免疫刺激物3-脱-0-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)吸附在同一颗粒上的铝型疫苗制剂可参见EP0576478Bl、EP0689454Bl和EP0633784Bl。然而在这些情况下，抗原首先吸附到铝盐上，免疫刺激剂3D-MPL再吸附到同一铝盐颗粒上。该方法包括首先在水浴中对3D-MPL的悬浮液进行超声处理直到颗粒达到80nm和500nm之间。抗原通常在室温下搅拌l小时后被吸附到铝盐上。然后将3D-MPL悬浮液加到吸附的抗原中，将该制剂在室温下保温1小时，然后保存于4"C下备用。在另一种方法中，免疫刺激剂和抗原吸附在单独的金属颗粒上，参见EP1126876。这种改进方法包括将免疫刺激剂吸附到金属盐颗粒上，之后将抗原吸附到其它金属盐颗粒上，然后将不同的金属颗粒混匀后制成疫苗。用于本发明的佐剂可以是佐剂组合物，其中含有吸附到金属盐颗粒上的免疫刺激剂，其特征是金属盐颗粒基本上不含其它抗原。此外，本发明提供疫苗，其特征是免疫刺激剂吸附到基本不含其它抗原的金属盐颗粒上，以及吸附有抗原的金属盐颗粒基本不含其它的免疫刺激剂。因此，本发明提供包含吸附到金属盐颗粒上的免疫刺激剂的佐剂制剂，其特征是组合物中基本不含其它抗原。而且，这一佐剂制剂可以是制备疫苗时所需要的中间体(如果要使用该佐剂的话)。因此，本发明提供制备疫苗的方法，该方法包括将佐剂组合物与抗原相混合，所述佐剂组合物是一种或多种吸附到金属颗粒上的免疫刺激剂。优选抗原已经预吸附到金属盐上。所述金属盐可与吸附免疫刺激剂的金属盐相同或类似。优选金属盐为铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。本发明还提供疫苗组合物，该疫苗组合物包含吸附到第一金属盐颗粒上的免疫刺激剂，和吸附到第二金属盐颗粒上的抗原，其特征是第一金属盐颗粒和第二金属盐颗粒是单独的颗粒。对于本文所述该部分的任何用法，本文所述LPS或LOS书f生物或突变或者脂质A衍生物被设计成比天然脂多糖毒性低(例如3D-MPL)且可互换的等同物。它们可以是如上所述TLR4配体。这样的其它衍生物可参见WO020786737、WO9850399、WO0134617、WO0212258、WO03065806。在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含脂质体载体(通过已知技术由磷脂(例如二油酰基磷脂酰胆碱[DOPC])和任选络醇[例如胆固醇]制备)。该脂质体载体可以携带脂质A衍生物[例如3D-MPL-参见上文]和/或皂苷(例如QS21-参见上文)。在一个实施方案中，佐剂含有(每0.5ml剂量)O.l-lOmg、0.2-7mg、0.3-5mg、0.4-2mg或0.5-lmg(例如0.4陽0.6mg、0.9-1.lmg、0.5mg或lmg)磷脂(例如DOPC);0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)甾醇(例如胆固醇)；5-60fig、10-50吗或20-30jig(例如5-15吗、40画50昭、10jig、20昭、30昭、40吗或50略)脂质A衍生物(例如3D-MPL)和5-60jag、10-50(xg或20-30吗(例如5-15吗、40-50吗、10吗、20吗、30吗、40[xg或50iig)皂苦(例如QS21)。这一佐剂特别适于老年人用疫苗制剂。在一个实施方案中，包含6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(和还可包含一种或多种得自以下血清型的糖缀合物3、6A、19A和22F),其中在已4妄种疫苗的人中，针对一种或多种(或所有)以下疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗诱导的GMC抗体效价。在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含由可代谢油(例如角鲨烯)、乳化剂(例如吐温80)和任选母育酚(例如a生育酚)制成的水包油乳液。在一个实施方案中，佐剂含有(每0.5ml剂量)0.5-15mg、l-13mg、2-llmg、4誦8mg或5-6mg(例如2-3mg、5-6mg或10-1lmg)可代谢油(例如角豊烯)；0.1-10mg、0.3-8mg、0.6-6mg、0.9-5mg、l-4mg或2-3mg(例如0.9-1lmg、2-3mg或4-5mg)乳化剂(例如吐温80)和任选0.5-20mg、l陽15mg、2陽12mg、4-10mg、5隱7mg(例如11-13mg、5-6mg或2-3mg)母育酚(例如a生育酚)。这一佐剂可任选另含有5-60吗、10-50jig或20-30吗(例如5-15吗、40-50吗、10吗、20吗、30吗、40吗或50吗)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。这些佐剂特别适于婴幼儿或老年人用疫苗制剂。在一个实施方案中，包含这一佐剂的疫苗组合物含有得自至少所有以下血清型的糖缀合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可含有一种或多种得自以下血清型的糖缀合物3、6A、19A和22F),其中在已接种疫苗的人中，针对一种或多种(或所有)以下疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F而诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar疫苗所诱导的GMC抗体效价。这一佐剂可任选含有0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1隱0.15mg、0.25mg或0.U5mg)甾醇(例如胆固醇)；5_60吗、10_50昭或20_30吗(例如5-15吗、40-50昭、10吗、20昭、30吗、40吗或50昭)脂质A衍生物(例如3D-MPL)和5-60(xg、10-50吗或20-30昭(例如5-15[ig、40画50吗、10(ig、20吗、30)ig、40|ig或50昭)皂苷(例如QS21)。这一佐剂特别适于老年人用疫苗制剂。在一个实施方案中，包含这一佐剂的疫苗组合物含有得自至少所有以下血清型的糖缀合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可包含一种或多种得自以下血清型的糖缀合物3、6A、19A和22F),其中在已接种疫苗的人中，由针对一种或多种(或所有)以下疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗所诱导的GMC抗体效价。在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含磷酸铝和脂质A衍生物(例如3D-MPL)。这一佐剂可包含(每0.5ml剂量)100-750|ig、200-500吗或300-400昭Al(为磷酸铝)和5-60(ig、10-50昭或20-30吗(例如5-15吗、40陽50吗、IO昭、20fig、30吗、40或50昭)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。这一佐剂特别适于老年人或婴幼儿用疫苗制剂。在一个实施方案中，包含这一佐剂的疫苗组合物含有得自至少所有以下血清型的^t缀合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可包含一种或多种以下血清型的糖缀合物3、6A、19A和22F)，其中在已4妄种疫苗的人中，针对一种或多种(或所有)以下疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F而诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar疫苗所诱导的GMC抗体效价。含有本发明免疫原性组合物的疫苗制品可通过系统途径或黏膜途径给予所述疫苗，用来保护或治疗易受感染的哺乳动物。这些给药法可包括通过肌内、腹膜内、真皮内或皮下途径注射，或通过黏膜给予口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。鼻内给予疫苗以治疗肺炎或中耳炎是优选的(因为可更有效地防止鼻咽携带的肺炎球菌，因此在初期阶段削弱感染)。尽管本发明的疫苗可按单剂量给予，其成分还可以在同一时间或在不同时间共给予(例如可以在给予疫苗的任何细菌蛋白成分的同一时间或1-2周后，单独给予肺炎球菌糖缀合物，以侵_优化协调彼此间的免疫应答)。对于共给予，任选Thl佐剂可存在于^f壬何或所有不同的给药成分中。除了单一给药途径外，还可采用两种不同的给药途径。例如，可以经肌内(或真皮内)给予糖或冲唐缀合物，可以IN(或真皮内)给予细菌蛋白。另外，本发明的疫苗对于初次剂量可经肌内给予，加强剂量则可以IN给予。疫苗中蛋白抗原含量的范围通常为l-100吗，优选5-50吗，最常见的范围为5-25昭。在最初接种疫苗后，接受者经适当时间间隔后可接受一次或数次加强免疫。疫苗制剂通常可参见《疫苗设计(VaccineDesign)》("Thesubunitandadjuvantapproach(亚单位与佐剂办法)"(编辑PowellM.F.和NewmanM丄)(1995)PlenumPressNewYork)。脂质体内的包封可参见Fullerton,美国专利4,235,877。可将本发明的疫苗保存在溶液中或者冻干。优选将溶液在糖(例如蔗糖或乳糖)存在下冻干。另还优选将其冻干，在临用前复原。冻干处理可使组合物(疫苗)更加稳定，并且在3D-MPL存在且铝型佐剂不存在时可能使抗体效价更高。本发明一方面提供疫苗盒，该疫苗盒包括装有本发明免疫原性组合物(任选为冻干形式)的小瓶，还包括装有本文所述佐剂的小瓶。预期在本发明这一方面，佐剂将用来使冻干的免疫原性组合物复原。尽管本发明的疫苗可以任何途径给予，但是将所述疫苗乡会予皮肤(真皮内)构成本发明的一个实施方案。人的皮肤包括外层的"角状，，外皮，称为角质层，它覆盖着表皮。该表皮的下层被称为真皮，它进而覆盖着皮下组织。研究人员指出，将疫苗注射进皮肤(特别是真皮内)，刺激免疫应答，这还可能与多个额外的优势有关。用本文所述疫苗进行真皮内接种构成了本发明的优选特征。真皮内注射的常用技术"芒图法(Mantouxprocedure)"包括以下步骤清洁皮肤，然后用一只手绷紧皮肤，使小号注射针(26-31号)的斜面朝上，按10-15°的角度插入。一旦针头的斜面插入，则将针管放低并进一步前推，同时施加轻微的压力使之在皮肤下抬高。然后将液体非常緩慢地注入，从而在皮肤表面形成小疱或肿块，之后1"曼慢抽出针头。最近，文献记载了专门设计用于将液体制剂注射进入皮月夫或穿透皮肤的装置，例如记载于WO99/34850和EP1092444中的装置，又例如记载于以下文献中的喷射注射装置WO01/13977、US5,480，381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5，569，189、US5,704,911、US5，383，851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537。真皮内给予疫苗制剂的替代方法可包括常用的注射器和针头，或者设计用于射弹递送固体疫苗的装置(WO99/27961),或者透皮贴剂(WO97/48440、WO98/28037),或者涂4未在皮肤表面(透皮或经皮递药，WO98/20734、WO98/28037)。当将本发明的疫苗给予皮肤，或者更特别是给予真皮内时，疫苗为小体积液体，体积尤其介于约0.05ml和0.2ml之间。本发明的皮肤或真皮内用疫苗中抗原的含量可与肌内疫苗中存在的常用剂量类似(见上)。然而，皮肤或真皮内疫苗的特点是制剂可为"低剂量"。因此，"低剂量，，疫苗中的蛋白抗原存在的量优选每剂只不过0.1-10昭，优选0.1-5pg;糖(优选缀合的)抗原存在的范围为0.01-1吗糖/剂、优选介于0.01-0.5吗糖/剂。本文所用术语"真皮内递药"是指疫苗递送至皮肤的真皮区。然而，疫苗未必只位于真皮内。真皮是位于距人皮肤表面大约1.0mm和约2.0mm之间的皮肤层，但是人与人之间以及在不同身体部位都有一定的变化。一般而言，预计进入皮肤表面以下1.5mm便可达到真皮。真皮位于表面的角质层和表皮与下面的皮下层之间。根据递药方式，疫苗最终可只位于或者主要位于真皮内，或者可最终分布在表皮和真皮内。本发明另以游离或缀合的形式加入流感嗜血菌蛋白(例如D蛋白)，以提供用于预防或改善由流感嗜血菌引起的中耳炎的改进的疫苗。另外，本发明另通过向本发明的肺炎链球菌缀合物组合物中加入一种或两种以游离或缀合蛋白存在的肺炎球菌蛋白，从而提供用于预防或改善婴幼儿肺炎球菌感染(例如中耳炎)的改进的疫苗。所述肺炎球菌游离蛋白质可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。联合疫苗中还可包括一种或多种游离或缀合形式的粘膜炎莫拉氏菌蛋白抗原。因此，本发明提供一种诱导针对婴幼儿中耳炎的(保护性)免疫应答的改进方法。在另一个实施方案中，本发明通过给予安全和有效量的本发明疫苗[儿童疫苗],从而提供一种在婴幼儿(本发明范围限定为0-2岁)体内诱导(保护性)免疫应答的改进方法。本发明又一个实施方案包括提供用于医疗的本发明的抗原性肺炎链球菌缀合物组合物，以及本发明的肺炎链球菌缀合物在制备用于预防(或治疗)肺炎球菌疾病的药物中的用途。在又一个实施方案中，本发明通过给予安全和有效量的本发明疫苗，优选与一种或两种以游离或缀合的蛋白质存在的肺炎链球菌蛋白联用，从而提供一种在老年人群(在本发明范围内，如果患者50岁以上、通常55岁以上，更常见60岁以上就被认为是老年)体内诱导(保护性)免疫应答的改进方法，其中游离肺炎链球菌蛋白可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。本发明又一方面提供针对由肺炎链球菌和任选流感嗜血菌感染引起的疾病为人宿主提供免疫的方法，该方法包括给予宿主免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或疫苗盒。本发明又一方面提供用于治疗或预防由肺炎链球菌和任选流感嗜血菌感染引起的疾病的本发明免疫原性组合物。本发明又一方面提供本发明的免疫原性组合物或疫苗或疫苗盒在制备用于治疗或预防由肺炎链球菌和任选流感嗜血菌感染引起的疾病的药物中的用途。在本文中，本发明的发明人认为术语"包含"、"含有"和"包括，，在所有情况下都可任选地与术语"由......组成，，互换使用。本文涉及本发明"疫苗组合物"的实施方案也适用于涉及本发明"免疫原性組合物"的实施方案，反之亦然。本发明说明书中所引用的所有参考文献或专利申请都通过引用结合到本文。为了可以更好地理解本发明，故给出下面的实施例。这些实施例仅用于说明目的，不得理解为以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1:D蛋白的表达流感嗜血菌的D蛋白D蛋白表达的遗传构建原料编码D蛋白的DNA流感嗜血菌所有血清型和未分型菌抹的D蛋白均高度保守。含有编码完整D蛋白基因的DNA序列的载体pHIC348得自A.Forsgren博士,DepartmentofMedicalMicrobiology,UniversityofLund,Malm6GeneralHospital,Mahn6，Sweden。D蛋白的DNA序列参见Janson等(1991)InfectImmun.59:119-125。表达载体pMGl表达载体pMGl是pBR322的衍生物(Gross等，1985)，其中导入了噬菌体人衍生的调控元件，用于外源插入基因的转录和翻译(Shatzman等，1983)。另夕卜，氨千青霉素抗性基因用卡那霉素抗性基因替换。大肠杆菌(五.cW)菌林AR58用最早生长在SA500衍生物(gaffi::TN10，AJCircI857AHl)上的PI噬菌体原种转导N99，产生大肠杆菌菌林AR58。N99和SA500均为大肠杆菌K12菌林，得自美国国立卫生研究院(theNationalInstituteofHealth)MartinRosenberg十專士实马全室。表达载体pMG1为了产生D蛋白，将编码该蛋白质的DNA克隆到表达载体pMG1上。该质粒利用来自X噬菌体DNA的信号驱动所插入的外源基因的转录和翻译。当提供N蛋白时，载体含有启动子PL、操纵子OL和两个有用位点(NutL和NutR)以降低转录的极性作用(Gross等，1985)。将含有PL启动子的载体导入大肠杆菌溶原性宿主中以稳定质粒DNA。溶原性宿主菌林含有整合到基因组的复制缺陷型人噬菌体DNA(Shatzman等，1983)。染色体X噬菌体DNA指导cl阻抑蛋白的合成，该阻抑蛋白与载体OL阻抑物结合，阻止RNA聚合酶与PL启动子结合，从而阻止了插入基因的转录。表达菌林AR58的cl基因含有温度敏感突变基因，因此，PL指导的转录可受温度变化的调节，即培养物温度增加使阻抑物钝化，并开始合成外源蛋白质。这一表达系统可控制外源蛋白质、尤其是可能对细胞有毒的蛋白质的合成(Shimataka和Rosenberg,1981)。大肠杆菌菌林AR58用于产生D蛋白载体的AR58溶原性大肠杆菌菌抹是标准NIH大肠杆菌K12菌林N99的衍生物(FsiTgalK2、lacZ-thr，。它含有缺陷型溶原性人噬菌体(gaffi::TNlO,AKil—c1857AH1)。XKir表型防止宿主大分子合成被阻断。c1857突变赋予cl阻抑物温度敏感性损害。AH1缺失除去了X噬菌体右侧操纵子和宿主bio、uvr3和chlA基因座。用之前生长在SA500衍生物(galE::TN10，XKirc1857AH1)上的Pl噬菌体原种转导N99，产生AR58菌抹。通过邻近galE基因存在的编码四环素抗性的TN10转座子，用四环素筛选将缺陷型溶原体导入N99中。载体pMGMDPPrD的构建用含有流感病毒非结构Sl蛋白编码基因的pMG1载体(pMGNSI)构建pMGMDPPrD。D蛋白基因用在5'端和3，端分别含有Ncol和Xbal限制位点的PCR引物，由pfflC348载体(Janson等，1991Infect.,Immun.59:119-125)通过PCR进行扩增。然后将Ncol/Xbal片段导入pMGNSl中的Ncol和Xbal之间，从而产生含有NS1蛋白N端81个氨基酸紧接PD蛋白的融合蛋白。这一载体被称为pMGNSlPrD。根据上述构建体，产生最终用于D蛋白表达的构建体。从pMGNSlPrD上除去BamHI/BamHI片段。这种DNA水解可除去NS1编码区，但头3个N端的残基除外。当再连接载体时，就产生了具有下列N端氨基S1^列的融合蛋白的编码基因-陽—MDPSSHSSNMANT——NS1D蛋白D蛋白不含前导肽或脂质链与之正常连"l妾的N端半胱氨酸。因此蛋白质既不分泌到周质中也不被脂质化，而是以可溶形式保留在细胞质中。在37°C下，通过热激将最终构建体pMG-MDPPrD导入AR58宿主菌株。在卡那霉素存在下筛选出含有质粒的细菌。用特定的核酸内切酶消化被分离出的质粒DNA,来证实D蛋白编码DNA插入序列的存在。重组大肠杆菌菌^f朱称为ECD4。D蛋白的表达是处于Xpl启动子/0]j喿纵子的控制之下。宿主菌抹AR58在其基因組中含有温度敏感的cl基因，它通过与Oj吉合而阻断人pl在低温下进行表达。一旦温度升高，c1便从Ol上幹放出来，D蛋白便可进行表达。小规模制备在发酵结束时，将细胞浓缩并冷冻。按照下述方法从收获的细胞中提取和纯化D蛋白。将冷冻细胞培养物沉淀融化并重新悬浮于细胞裂解溶液(柠檬酸緩冲液，pH6.0)中至最终00650=60。将悬液以P=1000巴通过高压匀浆器两次。通过离心使细胞培养物匀浆澄清，经过滤除去细胞碎片。在第一纯化步骤中，将经过滤的裂解物加到阳离子交换层析柱(SPSepharoseFastFlow)上。PD通过离子相互作用与凝胶基质结合，通过逐步增加洗脱緩沖液的离子强度而被洗脱出来。在第二纯化步骤中，杂质被保留在阴离子交换基质(QSepharoseFastFlow)中。PD不与凝胶结合，可从流出物中收集。在上两个柱层析步骤中，用OD监测流分收集。阴离子交换柱层析法的流出物中含有经纯化的D蛋白，将该流出物进行超滤浓缩。使含有D蛋白的超滤留存物最终通过0.2!xm滤膜。大规模制备按照下述方法从收获的细胞中提取和纯化D蛋白。将收获的液体培养基冷却，并以大约800巴的压力直接通过高压匀浆器两次。在第一纯化步骤中，将细胞培养物匀浆液稀释，并加到阳离子交换层析柱(SPSepharoseBigbead)上。PD通过离子相互作用与凝月交基质结合，通过逐步增加洗脱緩沖液的离子强度而被洗脱出来，并进行过滤。在第二纯化步骤中，杂质被保留在阴离子交换基质(QSepharoseFastFlow)中。PD不与凝胶结合，可从流出物中收集。在上两个柱层析步骤中，用OD监测流分收集。阴离子交换柱层析法的流出物含有经纯化的D蛋白，将该流出物进行超滤浓缩并进行渗滤。使含有超滤留存物的D蛋白最终通过0.2pm滤膜。实施例lb:PhtD的表达PhtD蛋白是肺炎球菌组氨酸三联体(Pht)蛋白质家族的成员，其特征是存在组氨酸三联体(HXXHXH基序)。PhtD是838个氨基酸分子，携带5个组氨酸三联体(参见MedlmmuneWO00/37105,氨基酸序列为SEQIDNO:4，DNA序列为SEQIDNO:5)。PMD在中间还含有富含脯氨酸的区域(氨基酸位置为348-380)。PhtD具有一个20个氨基酸的N端信号序列，该序列具有LXXC基序。基因构建体用本公司自有的携带pX启动子的pTCMP14载体，将成熟MedlmmimePhtD蛋白的基因序列(自氨基酸21至氨基酸838)用重组法转移到大肠杆菌中。大肠杆菌宿主菌林为AR58，它携带cI8S7热敏阻抑物，允许启动子的热诱导。进行聚合酶链式反应，从Medlmmune质粒(得自肺炎链球菌菌株Norway4(血清型4)-SEQIDNO:5,携带了//ufD基因，参见WO00/37105)扩增；^Z)基因。采用只对pM)基因特异性的引物来扩增;A①基因的2个片段。引物携带M/el和《;"I或者《;"I和Wfll限制位点。这些引物不与来自载体的任何核苷酸杂交，但只与p/i^D特异性基因序列杂交。用携带iVJel限制位点的第一引物插入人工ATG起始密码子。然后将所产生的PCR产物插入pGEM-T克隆载体(Promega)中，确认所述DNA序列的存在。然后采用标准技术在TCMP14表达载体中进行该片段的亚克隆，并将载体转化至v!R5S大肠杆菌中。PhtD纯化如下进行PhtD的纯化°大肠杆菌细胞在卡那霉素存在下的生长在3CTC下生长30小时，然后在39.5。C下诱导18小时。°在EDTA5mM和作为蛋白酶抑制剂的PMSF2mM存在下，大肠杆菌细胞从完整培养物中破裂(ODi115):Rannie,2次传代，1000巴。□在室温(20。C)下用膨胀床方式层流QXL层析法俘获抗原并除去细胞碎片柱子用NaCl150rnM+Empigen0.25%(pH6.5)洗涤，用NaCl400mM+Empigen0.25%的25mM磷酸钾緩沖液(pH7.4)洗脱。°用Sartobran150柱体(0.45fxm+0.2pm)过滤。。抗原在5mM咪唑存在下于4。C结合到Zn^螯合的琼脂糖凝胶FFIMAC层析柱(pH7.4)上柱子用咪唑5mM和Empigen1%洗涤，用50mM咪哇洗脱，咪唑和Empigen均溶于25mM磷酸钟緩冲液(pH8.0)。□4°C下以阳离子才莫式(positivemode)用FractogelEMDDEAE(pH8.0,25mM磷酸钾)进行弱阴离子交换层析法柱子用140mMNaCl洗涤，用200mMNaCl洗脱，而污染物(蛋白质和DNA)保持吸附在交换柱上。°在50kDa滤膜上用2mM磷酸钠/磷酸钾(pH7.15)浓缩及超滤。实施例lc:肺炎链球菌溶血素的表达肺炎链球菌溶血素按照WO2004/081515和WO2006/032499所述方法制备和脱毒。实施例2:缀合物的制备如何制备纯的肺炎球菌多糖是本领域众所周知的。对于这些实施例的目的，多糖主要按照EP072513所述方法或用密切相关的方法制备。多糖的大小在缀合之前可用下述微流化法减小。活化与偶联条件对每种多糖都是独特的。这些条件见表l。将经减小的多糖(PS5、6B和23F除夕卜)溶于NaCl2M、NaCl0.2M或注射用水(WFI)中。对所有血清型的最佳多糖浓度进行评价。除血清型18C以外的所有血清型都直接与下述载体蛋白缀合。制备了两种替代血清型22F缀合物一种是直接缀合的，另一种通过ADH连接基缀合。从100mg/ml母液的乙腈或乙腈/水50%/50%溶液中，将CDAP(CDAP/PS比率为0.5-1.5mg/mgPS)加到多糖溶液中。1.5分钟后，加入0.2M-0.3MNaOH,得到特定的活化pH。在3分钟内，在该pH下于25。C下使多糖进行活化。将纯的蛋白质(D蛋白、PhtD、肺炎链球菌溶血素或DT)(用量取决于最初的PS/载体蛋白比率)加到活化的多糖中，在pH调节下，偶联反应在特定pH下进行长达2小时(取决于血清型)。为了猝灭未反应的氰酸酯基团，将2M甘氨酸溶液加到混合物中。调节pH至猝灭pH(pH9.0)。将该溶液在25。C下搅拌30分钟，然后在2-8。C下连续緩慢地搅拌过夜。18C的制备将18C通过连接基-己二酸二酰肼(ADH)与载体蛋白连接。缀合前将多糖血清型18C微流化。用EDAC使破伤风类毒素衍生化对于破伤风类毒素的衍生化，将纯的TT稀释成25mg/ml的0.2MNaCl溶液，加入ADH间隔基以达到终浓度为0.2M。当间隔基完全溶解时，调节pH至6.2。然后加入EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)以达到终浓度为0.02M,在pH调节下，搅拌混合物1小时。在25。C下，通过增加pH至9.0至少30分钟以终止缩合反应。然后为了除去残余ADH和EDAC试剂，衍生化TT进行渗滤(IOkDaCO滤膜)。在偶联步骤前使TTAH产物进行最后的过滤除菌，再于-70°C保存。TTah与PS18C的化学偶联缀合参数详情可参见表1。将2克微流化PS用水稀释至规定浓度，加入NaCl粉调节至2MNaCl。加入CDAP溶液(100mg/ml，用乙腈/注射用水50/50(体积/体积)，新鲜制备)以达到适合的CDAP/PS比率。加入0.3MNaOH,使pH升至活化pH9.0，并稳定在该pH下直到加入TTah。3分钟后，加入衍生化TTah(20mg/ml的0.2MNaCl溶液)，以达到TTAH/PS比率为2;调节pH至偶联pH90。在pH调节下将溶液放置1小时。对于猝灭，将2M甘氨酸溶液加到混合物PS/TTAH/CDAP中。调节pH至猝灭pH(pH90)。将该溶液在25。C下搅拌30分钟后，然后在2-8。C下连续緩慢地搅拌过夜。PS22F^-PhtD缀合物对于该糖的第二种缀合方法(第一种为直接PS22-PhtD缀合方法见表l),通过连接基-己二酸二酰肼(ADH)使22F与载体蛋白连接。缀合前使多糖血清型22F微流化。PS22F衍生化在温控水浴中于25。C连续搅拌以进行活化和偶联。将微流化PS22F稀释，得到PS终浓度为6mg/ml的0.2MNaCl溶液，溶液用O.lNHCl调节pH至6.05±0.2。加入CDAP溶液(100mg/ml，用乙腈/WFI50/50，新鲜制备)，以达到合适的CDAP/PS比率(1.5/1(重量/重量))。加入0.5MNaOH使pH升至活化pH9.00士0.05,并稳定在该pH下直到加入ADH。3分钟后，加入ADH以达到合适的ADH/PS比率(8.9/1(重量/重量))，调节pH至偶联pH9.0，将溶液在pH调节下放置1小时。使PSAH衍生物浓缩并渗滤。偶联将PhtD(10mg/ml的0.2MNaCl溶液)加到PS22Fah衍生物中，以达到PhtD/PS22FAH比率为4/1(重量/重量)。用HC1调节pH至5.0±0.05。在10分钟内手动加入EDAC溶液(20mg/ml的0.1MTris-HCl，pH7.5)(250pl/分钟)以达到lmgEDAC/mgPS22FAH。在搅拌和pH调节下，将所得溶液在25。C下保温150分钟(尽管也能采用60分钟)。加入1MTris-HClpH7.5(最终体积的1/10)使溶液中和后，在25。C下》文置30分钟。在SephacrylS400HR上洗脱前，用5)imMinisart过滤器4吏缀合物澄清。所得缀合物最终的PhtD/PS比率为4:1(重量/重量)，游离PS含量低于1%，抗原性(a-PS/a-PS)为36.3%,抗PhtD抗原性为7.4%。缀合物的纯化釆用用0.15MNaCl平衡的SephacrylS400HR凝胶过滤柱(对于18C为S500HR)通过凝胶过滤对缀合物进行纯化，以除去小分子(包括DMAP)和未缀合的PS和蛋白质。根据反应成分的分子大小不同，先洗脱出PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎链球菌溶血素或PS-DT缀合物，接着是游离PS，然后是游离PD或游离DT，最后是DMAP和其它盐(NaCl、甘氨酸)。用UV28。nm检测含有缀合物的流分。按照它们的Kd合并流分，过滤除菌(0.22pm),并保存于+2-8。C。测定了缀合制品中的PS/蛋白质比率。肺炎链球菌PS-蛋白D/TT/DT/PhtD/Plv缀合物的特异性活化/偶粉猝灭条件当(>fluid"出现在第一行表头时，是指糖的大小在缀合之前通过^i:流化减小了。微流化后糖的大小见表2。表1.肺炎链球菌PS-蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>注意pHa、pHc、pHq分别对应于活化pH、偶联pH和猝灭pH。表征对每种缀合物进行表征，且每种都符合表2所示规格。多糖含量Oag/ml)用间苯二酚试验测定，蛋白质含量(吗/ml)用劳里试验(Lowrytest)测定。PS/PD最终比率(重量/重量)用浓度比率确定。游离多糖含量(％)蛋白抗体一起保温，用石克酸铵饱和后离心得到上清液，测定上清液中缀合物的游离多糖含量。a-PS/a-PSELISA用来定量测定上清液中的游离多糖。不存在缀合物时还可作为a-载体蛋白/a-PSELISA的对照。抗原性用夹心型ELISA对相同缀合物的抗原性进行分析，其中俘获和;险测的抗体分別为a-PS和a-蛋白质。游离蛋白含量(％)在纯化步骤中，可以将未缀合的载体蛋白与缀合物分离开来。采用大小排阻层析法(TSK5000-PWXL)后经UY检测(214nm)来测定游离的残留蛋白质含量。洗脱条件使得游离载体蛋白与缀合物分开。然后与标准曲线(0-50吗/ml载体蛋白)进行比较确定缀合产物中游离蛋白质的含量。游离载体蛋白(％)如下计算％游离载体=(游离载体(吗/ml)/(用劳里试验测定相应载体蛋白的总浓度(照/ml)x100%)。稳定性对于4。C下保存的缀合物和37。C下保存7天的缀合物，用HPLC-SEC凝胶过滤(TSK5000-PWXL)测定分子量分布(Kav)及稳定性。10价/11价/13价/14价缀合物的表征见表2(参见表下注释)。蛋白质缀合物可被吸附到磷酸铝上，合并，得到最终的疫苗。结论产生出免疫原性缀合物，这些缀合物是有前景的疫苗成分。表2-缀合物的表征<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>*天然PS微流化法后的PS大小通过将血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F缀合物(例如剂量分另'J为l(ig、3(ig、lpg、ljxg、l(ig、lpg、l(ig、3|iig、3(ig、l!ig的糖/人用剂量)混合来制备10价疫苗。通过另外加入表5中的血清型3缀合物来制备11价疫苗(例如l吗糖/人用剂量)。通过另外加入上述血清型19A和22F缀合物(22F直接与PhtD连接或者通过ADH连接基连接)[例如剂量为每种糖3吗/人用剂量]来制备13价疫苗。通过另外加入上述血清型6A缀合物(例如剂量为l吗糖/人用剂量)来制备14价疫苗。实施例3:在本发明免疫原性组合物中加入流感嗜血菌D蛋白可提供针对急性中耳炎(AOM)的改进保护作用的证据。研究设计本研究使用了11Pn-PD疫苗-包含分别与得自流感嗜血菌D蛋白缀合的血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(见实施例4中的表5)。受试者净皮随冲几分成两组，在大约3、4、5和12-15月龄时注射11Pn-PD疫苗或/fovn';c共4剂。所有受试者在3、4和5月龄时还同时接受GSKBiologicals乂>司的/"/朋n';o/^:ca(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。是尸e^an'x和Hib的组合，在用前混合。在给予第3次疫苗剂量后两周，开始进行"根据方案(According-to-Protocol)"分析的功效随访，持续直到24-27月龄。选择部分受试者，评价鼻咽携带的肺炎链球菌和流感嗜血菌。如果这些儿童中有人生病，出现耳痛、鼓膜自发性穿孔、自发性耳溢液时，建议家长咨询调查人员。如果调查人员怀疑是AOM发作，则将儿童立即转送耳鼻喉(ENT)专科医师确诊。AOM临床诊断根据的是鼓膜的视觉外观(即红、肺、光反射的丧失)或者存在中耳积液(用单纯耳镜或气动耳镜或用显微镜证实)。另外，还存在至少以下2种症状或征兆耳痛、耳溢液、听觉损失、发热、嗜眠、易怒、厌食、呕吐或腹泻。如果ENT专科医师对临床诊断作出确诊，则通过鼓膜穿刺术采集中耳积液样本以备细菌检测。对于重复看病的受试者，如果自前一次发作开始已经超过了30天，则被认为是新的AOM发作。另外，不论两次连续发作之间的间隔多久，如果所分离的细菌/血清型不同于前一次的分离物，则AOM发作被视为新的细菌性发作。临床实验结果共招募了4968名婴幼儿，11Pn-PD组2489名，对照组2479名。两组之间在人口学特征或风险因素上没有明显差异。临床发作和AOM病例定义在每个方案随访期间，在11Pn-PD组中记录到共333起临床AOM发作，对照组499起。表3表示11Pn-PD疫苗和之前在芬兰进行试验的两种7价疫苗(Eskola等，NEnglJMed2001;344:403-409和Kilpi等，ClinInfectDis200337:1155-64)针对任何AOM发作及由不同肺炎球菌血清型、流感嗜血菌AT战'和粘膜炎莫拉氏菌引起的AOM的保护性功效。不考虑病因，用11Pn-PD使AOM疾病总负担在统计学显著性和临床相关性方面降低33.6%(表3)。针对由11Pn-PD疫苗含有的ll种肺炎球菌血清型的任一种所致AOM发作的总功效为57.6%(表3)。最新研究的另一个重要发现是，由11Pn-PD疫苗提供的针对流感嗜血菌所引起的AOM的保护为35.6%(准确地讲由NTHi提供35.3%的保护)。在肺炎球菌缀合物疫苗时代，已知流感嗜血菌作为AOM主要病因的重要性增加，因此这一发现有着重大的临床意义。与针对AOM所提供的保护一致，在2岁时给予加强剂量后，11Pn-PD疫苗还降低鼻咽携带的流感嗜血菌。这些发现与之前在芬兰所作的观察不同，其中对于两种7价肺炎球菌缀合物疫苗，观察到由流感嗜血菌所致的AOM发作增力口(Eskola等和Kilpi等)，以病原报告为证。未能建立起对由Hi所致AOM发作的保护与针对载体蛋白D的抗体水平之间的明确的相关性，因为11Pn-PD疫苗接种者(保持未发作HiAOM)体内初次接种后的抗PDIgG抗体浓度，与在功效随访期间发生至少一次HiAOM发作的11Pn-PD疫苗接种者体内可测得的初次接种后的抗PDIgG抗体浓度基本相同。然而，虽然未能建立疫苗的生物学影响与初次接种后IgG抗PD免疫原性之间的相关性，<旦是有理由认为在流感嗜血菌菌林中高度保守的PD载体蛋白，在相当大的程度上有助于诱导针对Hi的保护作用。伴随对AOM疾病的作用的是对鼻咽携带的作用，这对于疫苗血清型肺炎球菌和流感嗜血菌而言具有类似的程度(图1)。在PD-缀合物疫苗接种者中，流感嗜血菌鼻咽携带的这种减少支持PD-缀合物疫苗对流感嗜血菌的直接保护作用的假设，即使在用ELISA测定时，保护性功效可能与抗PDIgG免疫应答并不相关。在下列实验中，栗鼠(chinchilla)中耳炎模型使用得自用本实施例的11价制剂或用实施例2的IO价疫苗(也可参见表1和表2以及表下注释)免疫的婴幼儿血清库。与免疫前血清库相比，这两种血清库都引起患中耳炎动物的比率显著降低。10价和ll价免疫血清库之间没有显著差异。这就表明这两种疫苗都具有类似的诱导针对该模型的由未分型流感嗜血菌引起的中耳炎的保护潜力。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>NP=未公开；N-ATP功效组中的受试者数目，n=发作数目*疫苗肺炎球菌血清型对于llPn-PD=11种血清型，对于Prevnar和7v-OMP=7种血清型MEF-中4积液，Prevnar-肺炎球菌7价结合疫苗实施例4:针对血清型19F选择载体蛋白釆用的ELISA测定22F抑制ELISA法主要根据的是2001年Concepcion和Frasch才是出的实验以及Henckaerts等人的报告(Henckaerts等，2006,ClinicalandVaccineImmunology13-356-360)。简单地讲，将纯的肺炎球菌多糖与曱基化人血清白蛋白相混合，并使之吸附到NuncMaxisorp(Roskilde,DK)高结合微量滴定板中于4。C过夜。各板用10%胎牛血清(FBS)的PBS溶液在室温下搅拌1小时使之封闭。血清样品用PBS稀释，PBS含有10。/。FBS、10(ng/ml细胞壁多糖(SSI)和2)ag/ml血清型22F(ATCC)的肺炎球菌多糖，血清样品在微量滴定板中用同一緩冲液进一步稀释。针对标准血清89-SF标定的内部参比，用不同浓度的血清型特异性IgG/89-SF按相同方式进行处理，并使每块板都包含内部参比。洗涤后，用稀释于10。/。FBS(PBS的溶液)的过氧化物酶缀合的抗人IgG单克隆抗体(StratechScientific有限公司，Soham,UK)检测结合抗体，在室温搅拌下温育l小时。采用现成的单一成分四甲基耳关苯胺过氧化物酶免疫测定底物试剂盒(BioRad,Hercules,CA,US),在室温下避光使之显色。用H2SO40.18M终止反应，于450nm读耳又光密度。参照内部参比血清曲线规定范围内的光密度点，计算样品的血清型特异性IgG浓度(单位吗/ml)，用SoftMaxPro(MolecularDevices:Sunnyvale,CA)软件计算得出的4参数逻辑斯谛对数方程使所述曲线模块化。鉴于检出限和定量限，对于所有血清型ELISA的截止值(cut陽off)为0.05吗/mlIgG。调理吞噬实验在2003年6月的WHO评议会议上，Romero-Steiner等人提出的OPA测定受到推荐(Romero-Steiner等，ClinDiagnLabImmunol200310(6)，第1019-1024页)。在下列试验中使用该方案测定了各血清型的OPA活性。缀合物的制备在研究11Pn-PD和Di-001及11Pn-PD和Di-007时，包括了3种11价疫苗制剂(表4)，其中3呢的19F多糖与白喉类毒素缀合(19F-DT)而不是l吗多糖与D蛋白缀合(19F-PD)。11Pn-PD、11Pn-PD和Di-001及11Pn-PD和Di-007研究的缀合参数分别见表5、表6和表7。初次接种这些19F-DT制剂后一个月，针对血清型19F的抗肺炎球菌抗体应答和OPA活性分别见表8和表9。表10表示22F-ELISA抗体浓度和23价单纯多糖加强免疫之前和之后受试者达到0.2pg/ml阈值的百分比。对于这些19F-DT制剂诱导的抗体，调理吞噬活性得到明显改进，较高的血清阳性率(调理呑噬效价2l:8)和初次接种疫苗后一个月的OPAGMT证实了这一点(表9)。对于先使用19F-DT制剂的儿童，23价单纯多糖加强免疫后一个月，19F抗体的调理吞噬活性保持得更好沐ll)。表12表示先使用19F-DT或19F-PD缀合物给初学步婴儿4妾种11Pn-PD加强剂量后与第4次连续使用/Vev加應剂量相比的免疫原性数据。据报导美国引进iVewaHS后取得了一定的突破，因此当与DT载体蛋白缀合时针对血清型19F的调理吞噬活性得到改进，这可能有利于备选疫苗。表13提供了对于交叉反应血清型19A的19F-DT缀合物的ELISA和OPA数据。我们发现19F-DT诱导针对19A的OPA活性较低但却十分明显。表4.临床研究中采用的肺炎球菌缀合物疫苗制剂<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表6.11Pn-PD和Di-001研究中肺炎链球菌PS-蛋白D/DT缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表7.11Pn-PD和Di-007研究中肺炎链球菌PS-蛋白D/DT缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>表8.在初次接种lfig19F-PD、3照19F-DT或Prevnar(2;ig19F-CRM)疫苗一个月后19F抗体浓度^0.20照/ml的受试者百分比以及19F抗体几何平均抗体浓度(GMC:照/ml，95%置信区间(CI))(总群组)<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>r:不同制剂的组成见表4，肺炎球菌7价结合疫苗。表9.初次接种ljig19F-PD、3照19F-DT或Prevnar(2jig19F-CRM)疫苗一个月后19FOPA效价21:8的受试者百分比以及19FOPAGMT(总群组)<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>r:不同制剂的组成见表4，iVev"『肺炎球菌7价结合疫苗。表10.先接种l照19F-PD、3jig19F-DT或Prevnar(2jig19F-CRM)的儿童在23价单纯多糖加强免疫前以及加强免疫后一个月19F抗体浓度》0.20ng/ml的受试者百分比以及19F抗体GMCQig/ml)(总群组)<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>:不同制剂的组成见表4，肺炎球菌7价结合疫苗。表11.先接种ljig19F画PD、3ng19F-DT或Prevnar(2pg19F-CRM)的儿童在23价单纯多糖加强免疫前和加强免疫后一个月19FOPA效价>1:8的受试者百分比以及19FOPAGMT(总群组)<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>r:不同制剂的组成见表4，/Vewar:肺炎球菌7价结合疫苗。表13.初次接种l吗19F-PD、3照19F-DT或Prevnar(2照19F-CRM)后一个月针对19A肺炎球菌的抗体浓度^0.2jig/ml、OPA21:8的受试者百分比以及GMC/GMT(总群组)<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>r:不同制剂的组成见表4，肺炎球菌7价结合疫苗。实施例5:临床前模型中的佐剂实验肺炎球菌ll价多糖缀合物对老年猕猴免疫原性的影响为了使老年人群对缀合物肺炎球菌疫苗所诱导的应答最优化，GSK公司制备了含有新佐剂-C佐剂的ll价多糖(PS)缀合物疫苗-参见下文。在第0天和第28天，用500^1吸附到315昭A1P04的11价PS缀合物或500^1与C佐剂混合的11价PS缀合物经肌内注射(IM)对各组5只老年猕猴(14-28岁)进行免疫。这两种疫苗制剂中，11价PS缀合物各自由以下缀合物组成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-PD、PS19F-PD、PS23F-DT和PS6B-DT。所用疫苗剂量为表6条件(实施例4)下缀合的疫苗人用剂量(剂量为5pg/糖/人，只是6B为10吗除外)的1/5,只是19F按照以下CDAP方法的条件制备经减小的糖9mg/ml,PD5mg/ml，PD/PS最初比率1.2/1,CDAP浓度0.75mg/mgPS，pHa，Hc^pHq9.0/9.0/90,偶联时间60分钟。在第42天，对所收集血清的抗PSELISAIgG水平和调理吞噬效价进行测量。对第42天收集的外周血细胞，通过Elispot测定抗PS3记忆B细胞频率。下面所示结果表明，在老年猴中，与ll价PS缀合物加上A1P04相比，C佐剂显著改进11价PS缀合物的免疫原性。新的佐剂提高了对PS的IgG应答(图l)以及调理吞噬抗体效价(表14)。还为通过使用C佐剂增加了PS3特异性记忆B细胞的频率提供了支持性证据(图2)。表14.老年猕猴的缀合物免疫原性(两次免疫后的调理吞噬效价)<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>B细胞酶联免疫斑点测定实验原理依据的事实是与CpG体外培育5天后，记忆B细胞成熟成为浆细胞。可以容易地;险测出体外产生的抗原特异性浆细月包，因此可用B细胞酶联免疫斑点测定(elispotassay)对抗原特异性浆细月包进行统计。特异性浆细胞的数目反映出记忆B细胞在开始培养时出现的频率。筒单地讲，将体外产生的浆细胞放入用抗原包^l的培养寺反中孵育。抗原特异性浆细胞形成抗体/抗原斑点，这些斑点可用常规免疫酶法进行检测并记录作为记忆B细胞的数目。在本项研究中，为了记录相应的记忆B细胞，各种多糖被用来包被培养板。结果用百万记忆B细胞内PS特异性记忆B细胞的频率表示。研究显示，C佐剂可能减少已知的PS3强化力(boostability)的问题(参见5thInternationalSymposiumonPneumococciandPneumococcalDiseases(第五届肺炎球菌和肺炎球菌疾病国际研讨会))，2006年4月2-6日，AliceSprings,CentralAustralia,Specificitiesofimmuneresponsesagainstaserotype3pneumococcalconjugate(针对血清型3肺炎球菌缀合物免疫应答的特异性).SchuermanL,PrymulaR,PoolmanJ.文摘，第245页，PO10.06)。实施例6.Balb/c幼小鼠中，脱毒肺炎链球菌溶血素(dPly)作为蛋白载体提高PS19F的免疫原性的功效在第0天、第14天和第28天，用50)il4价单纯PS或50pl4价dPly缀合的PS(两种都与C佐剂相混合)经肌内注射对各组40只雌性Balb/c小鼠(4周龄)进行免疫。两种疫苗制剂都由0.1吗(糖含量)以下各种PS组成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。在第42天，对所采集血清的抗PSELISAIgG水平进行测定。如图3中的实例所示，与用单纯PS免疫的小鼠相比，给予4价dPly缀合物的小鼠中抗PS19F应答得到极大的提高。对于抗PS8、12F和22FIgG应答，也观察到相同的改进(数据未显示)。实施例7.Balb/c幼小鼠中，肺炎球菌组氨酸三联体D蛋白(PhtD)作为蛋白载体提高PS22F的免疫原性的功效在第0天、第14天和第28天，用50i!l4价单纯PS或50pl4价PhtD缀合的PS(两种都与C佐剂相混合)经肌内注射对各组40只雌性Balb/c小鼠(4周龄)进行免疫。两种疫苗制剂都由O.liig(糖含量)以下各种PS组成PS8、PS12F、PS19F和PS22F。在第42天，对所采集血清的抗PSELISAIgG水平进行测定。如图4中的实例所示，与用单纯PS免疫的小鼠相比，给予4价PhtD缀合物的小鼠中抗PS22F应答得到极大的提高。对于抗PS8、12F和19FIgG应答，也观察到相同的改进(数据未显示)。实施例8.老年C57BI小鼠中含有19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物的免疫原性在第0天、第14天和第28天，用50lilll价PS缀合物或50^113价PS缀合物(两种都与C佐剂相混合)(参见下文)经肌内注射对各组30只C57BI老年小鼠(〉69周龄)进^f亍免疫。ll价疫苗制剂由0.1吗糖的以下各缀合物组成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F扁PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PSMF-PD(参见表1和表2下面对11价疫苗的注释)。13价疫苗制剂另含有O.l吗PS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1和表2下面对13价疫苗的注释[采用直接缀合的22F])。在第2组和第4组中，肺炎链球菌溶血素载体用GMBS处理进行脱毒，在第3组和第5组中用曱醛进行。在第2組和第3组中，用PhtD与PS22F缀合，在第4组和第5组中，采用PhtD—E融合物(得自WO03/054007的构建体VP147)。在第6组中，19A与白喉类毒素缀合，22F与D蛋白缀合。在第42天，对所采集的各个血清的抗PS19A和22FELISAIgG水平进行测量。在合并血清中对其它PS产生的ELISAIgG应答进行测定。13价缀合物疫苗制剂内所加入的19A-dPly和22F-PhtD在C57BI老年小鼠中具有免疫原性(表15)。与用ll价制剂免疫的小鼠相比，针对其它PS所诱导的免疫应答对给予13价制剂的小鼠并没有负面影响。表15.C57BI老年小鼠的PS免疫原性(三次免疫后的IgG水平)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>实施例9.Balb/c幼小鼠中含有19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物的免疫原性在第0天、第14天和第28天，用50i!lll价PS缀合物或50^113价PS缀合物(两种都与C佐剂相混合)(参见下文)经肌内注射对各组30只Balb/c幼小鼠(4周龄)进行免疫。ll价疫苗制剂由0.1吗糖的以下各缀合物组成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1及表2下面对11价疫苗的注释)。13价疫苗制剂另含有O.l吗PS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1及表2下面对13价疫苗的注释[采用直接缀合的22F])。在第2组和第4组中，肺炎链球菌溶血素载体用GMBS处理进行脱毒，在第3组和第5组中，用甲醛进行。第2组和第3组中，用PhtD与PS22F缀合，在第4组和第5组中，采用PhtD—E融合物(得自WO03/054007的构建体VP147)。在第6组中，19A与白喉类毒素缀合，22F与D蛋白缀合。在第42天，对所采集的各血清中的抗PS19A和22FELISAIgG水平进行测定。在合并血清中对其它PS所产生的ELISAIgG应答进行测定。Balb/c幼小鼠中，131"介缀合物疫苗制剂内所加入的19A-dPly和22F-PhtD具有免疫原性(表16)。与用11价制剂免疫的小鼠相比，针对其它PS所诱导的免疫应答对给予13价制剂的小鼠没有负面影响。表16.Balb/c幼小鼠的PS免疫原性(三次免疫后的IgG水平)<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>实施例10.豚鼠中含有19A-dPIy和22F-PhtD的13价PS缀合物的免疫原性在第0天、第14天和第28天，用125(il11价PS缀合物或125(il13价PS缀合物(两种都与C佐剂相混合)(参见下文)经肌内注射对各组20只幼豚鼠(Hartley品系；5周龄)进行免疫。11价疫苗制剂由0.25昭糖的以下各缀合物组成PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F誦PD(参见表1和表2下面对11价疫苗的注释)。13价疫苗制剂另含有0.1|igPS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表1及表2下面对13价疫苗的注释[采用直接缀合的22F])。在第2组和第4组中，肺炎链球菌溶血素载体用GMBS处理进行脱毒，在第3组和第5组中用甲醛进行。在第2组和第3组中，用PhtD与PS22F缀合，在第4组和第5组中使用PhtD—E融合物(得自WO03/054007的构建体VP147)。在第6组中，19A与白喉类毒素缀合，22F与D蛋白缀合。在第42天，对所采集的各血清中的抗PS19A和22FELISAIgG水平进行测定。在合并血清中对其它PS所产生的ELISAIgG应答进行测定。表17.Balb/c幼小鼠的PS免疫原性(三次免疫后的IgG水平)<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>实施例ll:制剂制备与检验a)制备以下制剂(使用得自表1的13价疫苗及得自表5的血清型连接基缀合的22F])。用磷酸铝和3D-MPL按照下述方法制备糖类。14价25腿MPLBAC铝含量总计—>FF每剂<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>b)在相同的糖制剂中加入下列各佐剂-下表中表示每500)il剂量的乳液成分浓度。A2佐剂125^1水包油乳剂5.94mg5.35mg2.43mgA3佐剂50^1水包油乳剂2.38mg2.14mg0.97mg成分a生育酚角鲨烯吐温80成分a生育酚角鲨烯吐温803D-MPLAl佐剂250|al水包油乳剂11.88mg10.7mg4.85mgA4佐剂250)^1水包油乳剂11.88mg10.7mg4.85mg50ngA5佐剂250^1水包油乳剂11.88mg10.7mg4.85mg25昭A6佐剂125|il水包油乳剂5.94mg5.35mg2.43mg25(agA7佐剂50(xl水包油乳剂2.38mg2.14mg0.97mgIO昭c)糖类用两种基于脂质体的佐剂来配制:佐剂Bl的组成定性定量(每0,5ml剂量)脂质体—DOPClmg-胆固醇0.25mg3DMPL50pgQS2150吗KH2P043.124mg緩冲液Na2HP040.290mg緩沖液NaCl2.922mg(lOOmlVQ注射用水适量，加至0.5ml溶剂pH6.1P04总浓度=50mM佐剂B2的组成定性定量(每0.5ml剂量)脂质体一DOPC0.5mg一胆固醇0.125mg3DMPL25fxgQS2125吗KH2P043.124mg緩冲液Na2HP040.290mg緩冲液NaCl2.922mg(100mM)注射用水适量，加至0.5ml溶剂pH6.1d)糖类另用C佐剂来配制(见上述使用该佐剂的其它组成):定性定量(每O.Sml剂量)水包油乳液50^1一角鲨烯2.136mg-a-生育酚2.372mg一吐温800.97mg-胆固醇0.1mg3DMPL50昭QS2150昭KH2P040.470mg缓沖液Na2HP040.219mg緩冲液NaCl4扁mg(137mM)KC10.101mg(2.7mM)注射用水适量，加至0.5ml溶剂pH6.8实施例12.Balb/c小鼠中缀合化学反应对22F-PhtD缀合物免疫原性的影响在第0天、第14天和第28天，用含有PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13价PS制剂(剂量对于PS4、18C、19A、19F和22F为0.3pg糖/PS,对于其它PS为0.1吗糖/PS)通过肌内(IM)途径对各組30只雌性Balb/c小鼠进行免疫。使PS18C与破伤风类毒素缀合，19F与白喉类毒素缀合，19A与曱醛脱毒的Ply缀合，22F与PhtD缀合，其它PS与PD缀合。对两种制剂进行比较，这两种制剂由直接CDAP化学法或22F-AH-PhtD(ADH衍生的PS)制备的22F-PhtD构成。参见实施例2、表1及表2下面对于用22F直接缀合或者通过ADH间P鬲基缀合物制备的13价疫苗特征的注释。该疫苗制剂中补加了C佐剂。在第42天，对所采集的血清中的抗PS22FELISAIgG水平和调理吞噬效价进行测定。就IgG水平(图5)和调理吞噬效价(图6)而言，22F-AH-PhtD具有比22F-PhtD大得多的免疫原性。实施例13.新佐剂对肺炎链球菌荚膜PS缀合物免疫原性的影响在第0天、第14天和第28天，用含有PS1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13价PS制剂(剂量对于PS4、18C、19A、19F和22F为0.3pg/PS，对于其它PS为0.1昭/PS)通过肌内途径对各组40只雌性Balb/c小鼠进行免疫。使PS18C与破伤风类毒素缀合，19F与白喉类毒素缀合，19A与曱醛脱毒的Ply缀合，22F与PhtD缀合，其它PS与PD缀合。参见实施例2、表1和表2下面对于用22F直接缀合制备的13价疫苗的注释。对分别补充了A1P04、Al佐剂、A4佐剂或A5佐剂的四种制剂进行比较。在第42天，对所采集血清中的抗PS、Ply、PhtD和PDELISAIgG水平进行测定并将每组血清合并。计算出各个抗原的下述比率所测试的新佐剂诱导的IgG水平/用A1P04诱导的IgG水平。与经典A1P04制剂相比，所有所测试的新佐剂对13价缀合物的免疫应答"l是高了至少2倍(图7)。实施例14.肺炎球菌猴肺炎模型中PhtD/脱毒Ply组合的保护性功效在第0天和第28天，用11价PS缀合物(即PS1、3、5、6B、7F、9V、14和23F各l(ig以及PS4、18C和19F各3吗)或PhtD(IO吗)+甲醛脱毒的Ply(IO吗)或仅佐剂经肌内注射对各组6只猕猴(3-8岁)进行免疫，所选用的猕猴为先前存在的抗19F抗体水平为最低的猕猴。使PS18C与破伤风类毒素缀合，19F与白喉类毒素缀合，其它PS与PD缀合。参见实施例2、表1及表2下面有关11价疫苗特征的注释。所有制剂均补充了C佐剂。在第42天时，将19F型肺炎球菌(5.108cfii)接种到右肺。在受到攻击后第1天、第3天和第7天，统计支气管肺泡灌洗物的菌落数。结果用受到攻击后第7天每组死亡、肺定居或清除的动物数目表示。如图8所示，与仅用佐剂组相比，用11价缀合物和PhtD+dPly组合获得接近统计显著性的良好保护(p<0.12，费希尔正合检验(FisherExacttest))，尽管所采用的动物数目较少。实施例15.缀合化学反应对抗PhtD抗体应答和针对由22F-PhtD缀合物诱导的4型攻击的保护性功效的影响在第0天和第14天，用3吗22F-PhtD(用直接CDAP化学法制备)或22F-AH-PhtD(ADH衍生的PS)或仅用佐剂经肌内途径对各组20只雌性OFl小鼠进行免疫。通过实施例2的方法制备两种单价22F缀合物(同样参见表1和表2)。各种制剂均补充了C佐剂。对第27天所采集的血清的抗PhtDELISAIgG水平进行测定。在第28天，用5.106cfu的4型肺炎球菌经鼻内攻击小鼠(即肺炎球菌血清型不会被存在于测试疫苗制剂中的PS掩蔽)。监测所引起的死亡率直到攻击后第8天。22F-AH-PMD比22F-PhtD引起明显较高的抗PhtDIgG应答和更好的针对4型攻击的保护。权利要求1.一种肺炎链球菌免疫原性组合物，所述组合物包含9种以上、10种以上、11种以上、13种以上或14种以上得自不同肺炎链球菌血清型并与两种以上不同的载体蛋白缀合的荚膜糖，其中所述组合物包含与白喉类毒素(DT)或CRM197缀合的血清型19F荚膜糖，任选其中19F是组合物中唯一与白喉类毒素(DT)或CRM197缀合的糖。2.权利要求1的免疫原性组合物，其中血清型19F与白喉类毒素缀合。3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含得自流感嗜血菌的D蛋白。4.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中19F荚膜糖与载体蛋白直接缀合。5.权利要求3中任一项的免疫原性组合物，其中19F荚膜糖通过连接基与载体蛋白缀合。6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述连接基是双官能的。7.权利要求5或6的免疫原性组合物，其中所述连接基是ADH。8.权利要求5、6或7中任一项的免疫原性组合物，其中所述连接基通过碳二亚胺化学法、优选采用EDAC与载体蛋白连接。9.权利要求5-8中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖与连接基缀合后，所述载体蛋白再与连接基缀合。10.权利要求5-8中任一项的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白与连接基缀合后，所述糖再与连接基缀合。11.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中19F糖采用CDAP化学法与载体蛋白缀合或与连接基缀合。12.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中载体蛋白与19F糖的重量比介于5:1和1:5、4:1和1:〗、2:1和1:1或者1.5:1和1.4:1之间。13.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中19F糖的平均大小例如Mw为100kDa以上。14.权利要求13的免疫原性组合物，其中19F糖的平均大小例如Mw介于100-750kDa、110-500kDa、120-250kDa或者125kDa和150kDa之间。15.权利要求13或14的免疫原性组合物，其中19F糖是天然多糖或者其大小按不超过5倍的因数减小。16.权利要求13、14或15中任一项的免疫原性组合物，其中19.F糖的大小通过微流化法减'J、。17.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中19F糖缀合物中糖的剂量介于l-10吗、l-5jig或l-3吗之间。18.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少8种荚膜糖与同一载体蛋白缀合。19.权利要求18的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白不是白喉类毒素和/或不是CRM197。20.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括两种不同的载体蛋白。21.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括3、4、5或6种不同的载体蛋白。22.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中一种以上的载体蛋白或所有载体蛋白选自DT、CRM197、TT、C片段、dPly、PhtA、PhyB、PhtD、PhtE、PhtDE、OmpC、PorB和流感嗜血菌D蛋白。23.权利要求22的免疫原性组合物，其中一种载体蛋白是D蛋白。24.权利要求22的免疫原性组合物，其中一种载体蛋白是TT。25.权利要求22、23或24中任一项的免疫原性组合物，其中TT和D蛋白均作为载体蛋白存在。26.权利要求22、23、24或25中任一项的免疫原性组合物，其中至少8种荚膜糖与D蛋白缀合。27.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含与TT缀合的荚膜糖18C,任选其中18C是组合物中唯一与破伤风类毒素(TT)缀合的糖。28.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中18C荚膜糖与载体蛋白直接缀合。29.权利要求1-27中任一项的免疫原性组合物，其中18C荚膜糖通过连接基与载体蛋白缀合。30.权利要求29的免疫原性组合物，其中所述连接基是双官能的。31.权利要求29或30的免疫原性组合物，其中所述连接基是ADH。32.权利要求29、30或31中任一项的免疫原性组合物，其中所述连接基通过碳二亚胺化学法、优选采用EDAC与载体蛋白连接。33.权利要求29-31中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖与连接基缀合后，所述载体蛋白再与连接基缀合。34.权利要求29-31中任一项的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白与连接基缀合后，所述糖再与连接基缀合。35.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中18C糖采用CDAP化学法与载体蛋白或连接基缀合。36.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中18C糖采用还原性胺化与载体蛋白或连接基缀合。37.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白与18C糖的重量比介于0.5:1-5:1、1:1-4:1、1.5:1-3:或2:1和2.5:1之间。38.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中18C糖的平均大小例如Mw为50kDa以上。39.权利要求38的免疫原性组合物，其中18C糖的平均大小例如Mw介于50-500kDa、60-400kDa、70-300kDa、75-200kDa或80kDa和100kDa之间。40.权利要求39的免疫原性组合物，其中18C糖是天然多糖或者其大小按不超过5倍的因数减小。41.权利要求38、39或40中任一项的免疫原性组合物，其中18C糖的大小通过^t流化法减小。42.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中18C糖缀合物中糖的剂量介于l-10呢、]-5(ig或l-3(ig之间。43.权利要求42的免疫原性组合物，其中18C糖缀合物中糖的剂量为3吗。44.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中存在血清型6B的荚膜糖缀合物，但是不与DT和/或CRM197缀合。45.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中存在血清型23F荚膜糖缀合物，但是不与DT和/或CRM197缀合。46.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F作为缀合外唐存在。47.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中存在血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F，并且它们全都与D蛋白缀合。48.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含血清型3作为缀合糖存在。49.权利要求48的免疫原性组合物，其中血清型3与D蛋白缀合。50.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含血清型6A和/或15B(的缀合荚膜糖)。51.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含血清型19A(的缀合荚膜糖)。52.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含血清型22F(的缀合荚膜糖)。53.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含血清型8(的缀合荚膜糖)。54.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含血清型12F(的缀合荚膜糖)。55.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种荚膜糖与载体蛋白直接缀合。56.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种荚膜糖通过连接基与载体蛋白缀合》57.权利要求56的免疫原性组合物，其中所述连接基是双官能的。58.权利要求56或57的免疫原性组合物，其中所述连接基是ADH。59.权利要求56、57或58中任一项的免疫原性组合物，其中所述连接基通过碳二亚胺化学法、优选采用EDAC与载体蛋白连接。60.权利要求56-59中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖与连接基缀合后，所述载体蛋白再与连接基缀合。61.权利要求56-59中任一项的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白与连接基缀合后，所述糖再与连接基缀合。62.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种荚膜糖采用CDAP化学法与载体蛋白缀合和/或与连接基缀合。63.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种荚膜糖采用还原性胺化与载体蛋白缀合和/或与连接基缀合。64.权利要求63的免疫原性组合物，其中荚膜糖3采用还原性胺化与载体蛋白和/或连接基缀合。65.权利要求63或64的免疫原性组合物，其中荚膜糖1采用还原性胺化与载体蛋白和/或连接基缀合。66.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中载体蛋白与糖的比率介于0.5:1-5:1、l:2和2.5:]、1:1-3.5:1或1.3:1-3.0:1之间。67.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中糖缀合物中糖的平均大d、例如Mw为50kDa以上，例如50-1600kDa、80-1400kDa、100-1000kDa、150-500kDa或200-400kDa。68.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型1，为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于100-1000kDa、200-800kDa、250-600kDa或300kDa和400kDa之间。69.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型4,为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于50-500kDa、60-300kDa、70-200kDa或75kDa和125kDa之间。70.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型5，为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于100-1000kDa、200-700kDa、300-500kDa或350kDa和450kDa之间。71.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型6B,为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于500-1600kDa、750-1500kDa或000kDa和1400kDa之间。72.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型7F,为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于50-1000kDa、100-750kDa、150-500kDa或200kDa和300kDa之间。73.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型9V，为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于50-1000kDa、100-750kDa、150-500kDa、200-400kDa或250kDa和300kDa之间。74.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型14,为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于50-1.000kDa、100-750kDa、50-500kDa或200kDa和250kDa之间。75.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型23F,为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于500-1500kDa、700-1300kDa、800-1100kDa或900kDa和1000kDa之间。76.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型19A,为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于50kDa和800kDa、110kDa和700kDa、i10-300kDa、120-200kDa、130-180kDa或140-160kDa之间。77.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型22F，为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于50和800kDa、110和700kDa、110-300kDa、120-200kDa、130-180kDa或150-170kDa之间。78.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型6A,为糖缀合物，糖的平均大小例如Mw介于500kDa和1600kDa或1100kDa和1540kDa之间。79.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型3，为糖缀合物，糖的平均大小例如.Mw介于50kDa和1000kDa、60kDa和800kDa、70kDa和600kDa、80kDa和400kDa、100kDa和300kDa或150kDa和250kDa之间。80.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型5、6B和23F,为天然糖。81.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中荚膜糖缀合物的剂量介于l-10昭糖/缀合物、l-5(ig糖/缀合物或l-3jig糖/缀合物之间。82.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型4、18C和19F的缀合物，剂量为3吗糖/缀合物。83.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F的缀合物，剂量为l呢糖/缀合物。84.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型6A和/或3的缀合物，剂量为1jig糖/缀合物。85.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型19A和/或22F的缀合物，剂量为3吗糖/缀合物。86.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包舍不同于缀合肺炎链球菌糖血清型的未缀合的肺炎链球菌糖血清型，使得缀合和未缀合糖的血清型的数目S23。87.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含一种或多种未缀合的或缀合的肺炎链球菌蛋白。88.权利要求87的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含一种或多种未缀合的肺炎链球菌蛋白。89.权利要求87或88的免疫原性组合物，其中所述一种或多种肺炎链球菌蛋白选自多聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、脱毒肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25和Sp133。90.权利要求87、88或89中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含肺炎链^求菌溶血素。91.权利要求87-90中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含PhtX蛋白。92.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含肺炎链球菌溶血素，作为游离蛋白或载体蛋白。93.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含PhtX蛋白，作为游离蛋白或载体蛋白。94.权利要求93的免疫原性组合物，其中所述PhtX蛋白是PhtD或PhtBD或PhtDE融合蛋白。95.上述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含佐剂。96.权利要求95的免疫原性组合物，其中所述佐剂是Thl应答的优先诱导物。97.权利要求95或96的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含一种或多种选自QS21、MPL⑧或免疫刺激寡核苦酸的成分。98.权利要求95-97中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含QS21和MPL。99.权利要求95的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含脂质体载体。100.权利要求99的免疫原性纽合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含O.l画lOmg、0.2-7mg、0.3-5mg、0.4-2mg或0.5画lmg,例如0.4-0.6mg、0.9-Umg、0.5mg或lmg的磷脂,例如DOPC。101.权利要求99或100的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg，例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg的甾醇，例如胆固醇。102.权利要求99-101中争一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含5-60呢、10-;50昭或20-30昭，例如:5-15昭、40-50吗、IO吗、20吗、30吗、40jxg或50吗的脂质A衍生物，例如3D-MPL。103.权利要求99-102中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含5-60昭、10-50或20-30吗，例如5-15吗、40-50吗、lO(ig、20|ig、30吗、40吗或50吗的皂苷，例如QS21。104.权利要求95的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含水包油乳液。105.权利要求104的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含0.5-15mg、l-13mg、2-llmg、4-8mg或5-6mg,例如2-3mg、5-6mg或10-llmg的可代谢油，例如角鲨烯。106.权利要求104或105的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含O.l國lOmg、0.3-8mg、0.6画6mg、0.9画5mg、l画4mg或2-3mg，例如0.9-1.1mg、2-3mg或4画5mg的乳化剂,例如吐温80。107权利要求104-106中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含0.5-20mg、l-15mg、2-12mg、4-10mg、5-7mg,例如ll-13mg、5-6mg或2-3mg的母育酚，例如a生育酚。108.权利要求104-107中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含5-60昭、10-50吗或20-30吗，例如5-15吗、40-5O(ig、10吗、20吗、30昭、40吗或50吗的脂质A衍生物，例如3D-MPL。109.权利要求104-108中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1誦0.3mg或0.125-0.25mg,例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg的甾醇，例如胆固醇。110.权利要求104-109中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含5-60吗、10-50吗或20-30|ig，例如5-5吗、40-50jig、10jig、20(ig、30吗、40昭或50jLig的皂苷，例如QS21。111.权利要求95的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含金属盐和脂质A衍生物。112.权利要求111的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含100-750吗、200-500jig或300-400吗的Al,为磷酸铝。113.权利要求111或112的免疫原性组合物，其中所述佐剂每0.5ml剂量包含5-60吗、10-50吗或20-30jxg，例如5-15昭、40-50吗、10|ig、20吗、30吗、40jig或50(ig的脂质A衍生物，例如3D-MPL。114.一种疫苗盒，所述疫苗盒包括权利要求1-94中任一项的免疫原性组合物，还包括用于同时或序贯给药的权利要求96-113中任一项所限定的佐剂。115.—种疫苗，所述疫苗包含权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。116.—种制备权利要求116的疫苗的方法，该方法包括将权利要求1-113中任一项的免疫原性組合物与药学上可接受的赋形剂相混合的步骤。117.—种针对由肺炎链球菌感染引起的疾病为人宿主进行免疫的方法，该方法包括给予宿主免疫保护剂量的权利要求.1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求11'5的疫苗。118.权利要求117的方法，其中所述人宿主是老年人，所述疾病是肺炎或侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)之一，或者是肺炎及侵袭性肺炎球菌疾病。119.权利要求117或118的方法，其中所述人宿主是老年人，所述疾病是恶化的慢性阻塞性肺病(COPD)。120.权利要求117的方法，其中所述人宿主是婴幼儿，所述疾病是中耳炎。121.权利要求117或120的方法，其中所述人宿主是婴幼儿，所述疾病是脑膜炎和/或菌血症。122.权利要求117、120或i21中任一项的方法，其中所述人宿主是婴幼儿，所述疾病是肺炎和/或绵膜炎。123.用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的权利要求1,113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗。124.权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗在制备用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的用途。125.权利要求124的用途，其中所述疾病是老年人肺炎或侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)之一，或者是老年人肺炎及老年人侵袭性肺炎球菌疾病。126.权利要求124或125的用途，其中所述疾病是老年人中恶化的慢性阻塞性肺病(COPD)。127.权利要求24的用途，其中所述疾病是婴幼儿中耳炎。128.权利要求124或1.27的^途，其中所述疾病是婴幼儿脑膜炎和/或菌血症。129.权利要求124、127或128中任一项的用途，其中所述疾病是婴幼儿肺炎和/或结膜炎。130.包含血清型19F的荚膜糖缀合物但不包含血清型19A的荚膜糖的权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗在制备用于治疗或预防由肺炎链球菌血清型19A菌株感染引起的疾病的药物中的用途。131.—种针对由肺炎链球菌血清型19A感染引起的疾病为人宿主进行免疫的方法，该方法包括给予宿主免疫保护剂量的权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗的步骤，所述免疫原性组合物和疫苗包含血清型19F的荚膜糖缀合物但是不包含血清型19A的荚膜糖。132.儿体内诱导针对中耳炎保护性免疫应答的方法(i)权利要求1-1]5中任一项的免疫原性组合物或疫苗，和(ii)得自流感嗜血菌的D蛋白，所述D蛋白是游离和/或缀合的。133.—种在婴幼儿体内诱导针对肺炎链球菌的保护性免疫应答的方法，该方法包括给予上述权利要求中任一项的免疫原性组合物或疫苗。134.—种通过序贯或同时给予以下组合成分在老年人体内诱导针对肺炎链球菌的保护性免疫应^i^的方法(i)上述权利要求中任一项的免疫原性组合物或疫苗，(ii)一种或多种选自PhtX家族和肺炎链球菌溶血素的肺炎链球菌表面蛋白。135.—种通过给予上述权利要求中任一项的免疫原性组合物或疫苗在婴幼儿体内诱导针对中耳炎的保护性免疫应答的方法。136.分以诱导针对中耳炎的保护性免疫应答的方法(i)上述权利要求中任一项的疫苗，(ii)一种或多种选自PhtX家族和肺炎链球菌溶血素的肺炎《连球菌表面蛋白。137.权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗，所述免疫原性组合物或疫苗包含得自至少所有以下血清型的糖缀合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F,其中在已接种疫苗的人中针对疫苗成分4、6B、9V、14、18C、19F和23F中的一种或多种所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗诱导的GMC抗体效价。138.权利要求137的免疫原性组合物，其中在已接种疫苗的人中针对血清型4所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗诱导的GMC抗体效价。139.权利要求137或138的免疫原性组合物，其中在已接种疫苗的人中针对血清型6B所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗诱导的GMC抗体效价。140.权利要求137-139中任一项的免疫原性组合物，其中在已接种疫苗的人中针对血清型9V所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗诱导的GMC抗体效价。141.权利要求137-140中任一项的免疫原性组合物，其中在已才妾种疫苗的人中针对血清型14所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗诱导的GMC抗体效价。142.权利要求137-141中任一项的免疫原性组合物，其中在已接种疫苗的人中针对血清型18C所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗诱导的GMC抗体效价。143.权利要求137-142中任一项的免疫原性组合物，其中在已接种疫苗的人中针对血清型19F所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗诱导的GMC抗体效价。144.权利要求137-143中任一项的免疫原性组合物，其中在已接种疫苗的人中针对血清型23F所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由Prevnar⑧疫苗诱导的GMC抗体效价。145.权利要求137-144中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型3糖缀合物。146.权利要求137-145中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型6A糖缀合物。147.权利要求137-146中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型19A糖缀合物。148.权利要求137-147中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含血清型22F糖缀合物。全文摘要本发明涉及肺炎球菌荚膜糖缀合物疫苗领域。具体地讲，本发明提供含有多种缀合荚膜糖的多价肺炎链球菌免疫原性组合物，所述荚膜糖得自不同的肺炎链球菌血清型并与两种以上不同的载体蛋白缀合，其中所述组合物包含与白喉类毒素(DT)或CRM197缀合的血清型19F荚膜糖，任选其中19F是组合物中唯一与白喉类毒素(DT)或CRM197缀合的糖。文档编号A61K39/09GK101378778SQ200680053111公开日2009年3月4日申请日期2006年12月20日优先权日2005年12月22日发明者J·普尔曼,M·P·范梅歇伦,N·M·-J·加孔,P·V·赫尔曼德,R·L·比曼斯申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司