专利名称：：具有抗肿瘤活性的香菇发酵口服液及制备方法
技术领域：
：本发明属于抗肿瘤药物领域，涉及来源于高级真菌经发酵后产物的制剂。
背景技术：
：真菌作为药物来源已有多年历史，以真菌为材料所生产的药剂在我国很早就应用于临床。香菇是世界名贵的食用兼药用真菌之一，具有很高的营养及药用价值。香菇化学成分复杂、药理活性强、临床应用范围广，其抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能引起国内外学者广泛关注(景军，等.中国食品卫生杂志.2001:13(2):46-47;ChiharaG，etal.CancerRes.1970:30:2776)。现代医学研究认为，多糖类作为生物应答调节剂(BRM)在香菇的抗肿瘤活性中起主要作用，香菇多糖的分离纯化，结构及药理作用都得到了深入的研究，并用于临床肿瘤的治疗，其疗效得到广泛的肯定。香菇多糖是通过剌激免疫细胞成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡从而使免疫状态由低下恢复到接近于正常能力，使肿瘤受抑制来实现其抗肿瘤的功能，但其无直接的抗肿瘤作用[RuanZheng,etaLInternationalImmunopharmacology5(2005)811-820]。除多糖外，香菇中含有大量蛋白质、氨基酸和多种微量元素。对香菇中其他生物学活性物质的研究水平去发掘其抗肿瘤活性的本质却鲜有报道。黄敏等在研究香菇C91一3菌株发酵液的抗肿瘤活性中，首次发现并证实了香菇的菌丝体发酵液具有体内抑制肿瘤生长作用，同时还具有显著的体外直接杀伤肿瘤细胞的作用，提示除了香菇多糖外还有其他重要的直接抗肿瘤活性物质，国内外还未见报道(黄敏，等.中国微生态学杂志.1996年8(3):38-40)。香菇菌株发酵液的抗肿瘤的制剂亦未见报道。
发明内容发明的目的是提供一种新的具抗肿瘤活性的香菇发酵口服液及制备方法。本发明公开的具抗肿瘤活性的香菇发酵口服液是以香菇C91-3菌株为发酵原料，采用深层发酵的技术，过滤后提取加工而成。本发明的香菇发酵口服液的制备方法包括以下述步骤l.香菇发酵液的制备(1)香菇发酵液培养基的制备由如下重量份原料构成的培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>将上述物品加到1000重量份蒸馏水中，混合后放入206(TC水浴中，使其完全溶解，调节PH5.08.0，分装至300ml三角烧瓶中，每瓶250ml，用4层纱布外盖一层牛皮纸封口，消毒灭菌1520分钟，冷却后备用。(2)取710天生长良好的香菇C91-3的菌丝体，接种到上述的培养基中，每瓶接种菌丝体0.515g。(3)置室温摇床上培养，前两天50100转/分，第三天开始逐渐加转速至100150转/分。每天观察生长情况，无菌取少量培养物观察孢子数，如果孢子数达到10Sl(T/ml时停止培养，即可收集发酵液备用。(4)将发酵液在08'C、3，000g/min离心10min，收集上清液，然后以单层滤纸过滤上清液(08°C)除去其中悬浮的杂质，即得到香菇发酵母液，在08'C的环境中保存。香菇发酵母液为不透明的淡褐色或土黄色的液体，pH5.08.0，其中主要含有18种氨基酸和人体所必需的8种氨基酸，其中天门冬氨酸ASP>40mg/ml，苏氨酸THR>20mg/ml，丝氨酸SER>20mg/ml，谷氨酸GLU>100mg/ml，甘氨酸GLY>50mg/ml，丙氨酸ALA>30mg/ml，胱氨酸CYS>lmg/ml，缬氨酸VAL>30mg/ml，蛋氨酸MET>5mg/ml,异亮氨酸ILE>20mg/ml，亮氨酸LEU>40mg/ml，酪氨酸TYR>40mg/ml，苯丙氨酸PHE>20mg/ml，赖氨酸LYS>30mg/ml，氨NH3〉3mg/ml，组氨酸HIS>9mg/ml，精氨酸ARG>20mg/ml，脯氨酸PRO>40mg/ml，色氨酸TRP>lmg/ml;多糖>50mg/ml。2.香菇发酵口服液的制备将上述香菇发酵母液与蒸馏水按照1:38的比例混合，同时加入310%的白糖或木糖醇即制成口服液，利用现有的技术分装入瓶，消毒灭菌后于一208'C冰箱保存。该口服液为土黄色或淡褐色的不透明液体，有特定的香味，口味甜，其中主要含有18种氨基酸和人体所必需的8种氨基酸及多糖。本发明的实验证明在体外抗肿瘤试验中，香菇C91-3发酵制剂对H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞株)及S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)的72小时后的抑瘤率分别为71.11%、72.85%、76.81%，表明该菌株发酵液具有有较强的直接杀伤肿瘤细胞的作用。在体内抗肿瘤试验中，香菇C91-3发酵制剂具有治疗肿瘤作用。对H22荷瘤鼠治愈率35%，对S180荷瘤鼠治愈率为40%。实验组即使死亡鼠的存活期也比对照组延长，具有明显抑制肿瘤的作用。另外发现该发酵液对革兰氏阴性菌有明显抑制作用，但对革兰氏阳性菌无效。动物毒性实验急性毒性实验和长期毒性实验证明无毒副作用，安全可靠。具体实施例方式下面结合实施例来对本发明进一步说明。实施例l:香菇发酵液的制备(1)香菇发酵液培养基的制备<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>将上述物品加到1000ml蒸馏水中，混合后放入5(TC水中水浴，使其完全溶解，调节PH7.5，分装至300ml三角烧瓶中，每瓶250ml，用4层纱布外盖一层牛皮纸封口，消毒灭菌15分钟，冷却后备用。(2)取第7天生长良好的香菇C91-3的菌丝体，接种到上述的培养基中，每瓶接种菌丝体lg。(3)置室温摇床上培养，前两天75转/分，第三天开始逐渐加转速至100转/分。每天观察生长情况，无菌取少量培养物观察孢子数，如果孢子数达到10Vml时停止培养，收集发酵液备用。(4)将发酵液在4。C、3，000g/min离心10min，收集上清液，然后以单层滤纸过滤上清液(4'C)除去其中悬浮的杂质，并将所得的上清液放入4。C的环境中保存。实施例2:香菇发酵口服液的制备(1)将上述香菇发酵母液与蒸馏水按照1:5的比例混合，同时加入4%的木糖醇即制成口服液，利用现有的技术分装入瓶，消毒灭菌后并于4'C冰箱保存。(2)将上述香菇发酵母液与蒸馏水按照1:6的比例混合，同时加入6%的木糖醇即制成口服液，利用现有的技术分装入瓶，消毒灭菌后并于4'C冰箱保存。(3)将上述香菇发酵母液与蒸馏水按照1:7的比例混合，同时加入8%的木糖醇即制成口服液，利用现有的技术分装入瓶，消毒灭菌后并于4"C冰箱保存。实施例3:香菇发酵制剂体外抗肿瘤活性试验(1)细胞株的选用H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞株)、S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)。(2)MTT法测定香燕发酵制剂体外抗肿瘤的抑瘤率选各种瘤细胞对数生长期的细胞调整浓度至lxl()S个/ml，并接种于96孔培养板内，每孔100W。对照组没孔加入IOOW无菌生理盐水，实验组加入香菇发酵口服液100W。每组设3个复孔，置于37°C，5XC02孵箱中培养24、48和72小时后，加入MTT(1Mg/ml)IOOW，再继续培养4小时，离心弃上清，然后每孔加100ulDMSO，震荡混匀，使结晶充分溶解，用酶标仪测定各孔吸光度值，(测定波长595nm，参考波长655nm)，并按下面公式计算抑瘤率。抑瘤率=1-实验组OD值、xl00%.对照组OD值^香菇发酵液体外抗肿瘤活性试验数据如表-1所示。实施例4:香菇发酵口服液体内抗肿瘤活性试验(1)细胞株的选用本试验H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞株)、S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)。(2)模型动物的选用t纯系615小鼠、Balb/c小鼠、昆明系小鼠若干只，体重2022g，由本校实验动物中心提供。(3)细胞系的动物模型的制备将瘤细胞配制成1乂106细胞悬液，取该细胞悬液以0.5ml/只注入小鼠腹腔。次日随机分成对照组、试验组。对照组每只小鼠灌胃lml生理盐水，试验组每只小鼠灌胃上述发酵制剂lml。连续灌胃5天，观察小鼠存活期，计算存活率和生命延长率。香菇发酵液体外抗肿瘤活性试验数据如表-2所示。实施例5:动物毒性实验(1)急性毒性实验取昆明小鼠40只(雌雄各半)，体重2022g，于24小时内灌胃3次，使累计的服用量为上述用药的225倍，连续观察小鼠14天，无死亡现象及不良反应，说明此剂无毒副作用。(2)长期毒性实验取体重适宜的大鼠40只(雌雄各半)，随机分为两组，一组为香菇发酵口服液实验组，以上述实验剂量的100倍连续灌胃60天；另一组为加等量蒸馏水对照组，结果发现，在此期间两组动物均无死亡及不良反应，两组动物食欲、大小便及体重在统计学上均无显著性差异(p>0.05);血液白细胞、红细胞及血小板等血常规指标两组间无显著性差异(p>0.05);两组动物脏器解剖病理观察均无异常病理现象，说明此剂长期服用安全可靠。整个实验结果表明，香菇发酵口服液对肿瘤有直接的杀伤作用(也是国内外首次发现)，并具有明显的治疗肿瘤作用；并且无毒副作用，安全可靠。表1香菇发酵制剂体外抗各种瘤细胞结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>存活率观察60天以上未长肿瘤。权利要求1.一种具有抗肿瘤活性的香菇发酵口服液，是以香菇C91-3菌株为发酵原料，经深层发酵、过滤后提取加工而成，为淡褐色或土黄色的透明液体，水溶液的pH5.0～8.0；该口服液为土黄色或淡褐色的不透明液体，有特定的香味，口味甜，其中主要含有18种氨基酸和人体所必需的8种氨基酸及多糖，含有发酵母液15～30％、甜味剂5～10％。2.如权利要求1所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵口服液的制备方法，其特征在于工艺步骤为(1)香菇发酵液培养基的制备由如下重量份原料构成的培养基新鲜啤酒酵母8庶糖6全脂奶粉1蛋白胨1磷酸二氢钾0.3维生素B10.01维生素B20.01将上述物品加到1000重量份蒸馏水中，混合后放入5(TC水中水浴，使其完全溶解，调节PH7.5，分装至300ml三角烧瓶中，每瓶250ml，用4层纱布外盖一层牛皮纸封口，消毒灭菌15分钟，冷却后备用；(2)取第7天生长良好的香菇C91-3的菌丝体，接种到上述的培养基中，每瓶接种菌丝体lg;(3)置室温摇床上培养，前两天75转/分，第三天开始逐渐加转速至100转/分。每天观察生长情况，无菌取少量培养物观察孢子数，如果孢子数达到10々ml时停止培养，收集发酵液备用；(4)将发酵液在4。C、3,000g/min离心10min，收集上清液，然后以单层滤纸4'C下过滤上清液除去其中悬浮的杂质，即得香恭发酵母液，放入4t:的环境中保存；(5)按发酵母液1530%、甜味剂510%、水为余量的比例，在配料容器中混合均匀而成。 全文摘要具有抗肿瘤活性的香菇发酵口服液，是以葡萄糖、新鲜啤酒酵母、蔗糖、全脂奶粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、维生素B1和B2加到蒸馏水中制成培养基，以香菇C91-3的菌丝体接种，经深层发酵、4℃离心、再过滤，即得香菇发酵母液，加入甜味剂而成。实验证明体外抗肿瘤试验中对H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞株)及S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)的72h后的抑瘤率分别为71.11％、72.85％、76.81％，表明具有有较强的直接杀伤肿瘤细胞的作用。在体内抗肿瘤试验中，对H22荷瘤鼠治愈率35％，对S180荷瘤鼠治愈率为40％。即使死亡鼠的存活期也比对照组延长，具有明显抑制肿瘤的作用。文档编号A61K36/06GK101167760SQ20071015791公开日2008年4月30日申请日期2007年11月5日优先权日2007年11月5日发明者宁安红,婧曹,钟民涛,敏黄申请人:大连医科大学