专利名称：人源性脂联素球状片段用于治疗糖尿病缺血性心脏病药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用细胞因子治疗心血管疾病领域，更抖体地说，涉及人源性脂联素球状片段(globular domain of adiponectin, gAd)在治疗糖尿病缺 血性心脏病药物的应用。
背景技术：
.心血管疾病，尤其是缺血性心脏病是导致糖尿病患者死亡的主要原因。 糖尿病患者血液内的高糖、高脂状态可致血管损伤诱发缺血性心脏病的发 生，另外，近期的研究表明，它还可直接损害心肌细胞。因此糖尿病患者不 仅缺血性心脏病的发病率高于普通患者，而且心肌的易损性明显增加。心肌 梗死发生后，在通过溶栓或介入手术开通血管的过程中，常由于自由基的产 生、离子分布的异常等，造成心肌损伤进一步加重，即所谓的缺血/再灌注 损伤。而糖尿病患者本身的心肌易损性增加会使其发生更广泛的心肌梗死和 更严重的心力衰竭。因此如何减轻这缺血/再灌注过程对心肌梗死患者，尤 其是糖尿病心肌梗死患者的损伤对于患者的预后非常重要。脂联素是一种由脂肪细胞分泌并释放入血液循环而发挥作用的细胞因 子，它由22个胶原重复序列的柄和高度保守的gAd组成，正常人血浆中脂 联素含量丰富，是一种与机体代谢密切相关的激素，具有降血糖、降血脂、 胰岛素增敏等作用。近年的研究发现，它与动脉粥样硬化以及由此引发的缺 血性心脏病之间也有一定关联。临床观察表明，血浆中脂联素水平与心肌梗 死的发病危险性明显呈负相关，而糖尿病患者血浆中脂联素的水平会显著降 低，另外，还发现脂联素具有直接的抗细胞凋亡的作用。这些结果提示脂联 素可能具有直接的心脏保护作用，糖尿病患者发生心肌缺血时心肌易损性增加的原因可能与其脂联素水平降低有关，导致糖尿病心肌梗死患者在进行血 运重建治疗时发生更严重的缺血/再灌注损伤。而给这类患者补充外源性脂 联素可能成为一种心肌保护的治疗手段。虽然目前临床上可以通过溶栓或介入的方法恢复糖尿病心肌梗死患者 缺血心肌的血供，但尚没有一种针对减轻缺血/再灌注损伤的药物应用于临 床，使得糖尿病患者在发生心肌梗死后即使开通血管，预后也明显差于普通 心肌梗死患者。因此，急需开发一类效果可靠、副反应较少、应用简单的药 物填补这一领域的空白。发明内容本发明的目的在于，提供脂联素球状片段用于治疗糖尿病缺血性心脏病 药物的应用，特别是对糖尿病患者在发生心肌梗死后接受血管再通治疗对， 通过外源性给药，以减轻糖尿病患者缺血心肌损伤。申请人研究表明，与全长的脂联素相比，其水解以后的脂联素球状片段 有着更强的生物学活性，而且给药后反应迅速，生物利用度好，有着更好的 临床应用前景。申请人在研究中发现1. 给予脂联素基因敲除(ADN^)小鼠(模拟糖尿病患者体内脂联素水 平低下的状态)gAd治疗，可明显减小其缺血/再灌注时的梗死范围，改善 心功能。2. 给予ADN一小鼠gAd治疗可减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡。3. 给予ADN;小鼠gAd治疗可抑制缺血/再灌注诱导的过氧亚硝基阴离 子(ONOO')的产生，从而抑制氧化/硝化应激对心肌的损害。
图1是给予ADN^小鼠gAd腹腔注射，可以明显减小其缺血/再灌注时 梗死范围的直方图。其中A图表示对不同处理组的心肌组织伊文思蓝/TCC双染，并进行统计分析的结果；B图表示gAd减小心梗范围的剂量依赖性。 图中，*P<0.05， **尸<0.01 vs.WT; ##P<0.01 vs.ADN、 §户<0.05， §§尸<0.01 vs. l|ig/ggAd。图2是给予ADN一小鼠gAd腹腔注射，可以明显改善其缺血/再灌注时 心功能的直方图。图中，*尸<0.05， **尸<0.01 vs. WT; ##尸<0.01 vs.ADN一。图3是给予ADN;小鼠gAd腹腔注射，可以减少缺血/再灌注诱导的心 肌细胞凋亡的直方图。其中A图表示TUNEL荧光染色的结果，绿色荧光代 表凋亡细胞；B图表示不同处理组TUNEL荧光染色的阳性率；C图表示不 同处理组Caspase-3的活性。图中，*P<0.05， **P<0.01 vs. WT; ##尸<0.01 vs. ADN一。图4是给予ADN"〃小鼠gAd腹腔注射，可以抑制缺血/再灌注诱导的一 氧化氮产生的直方图。图5是给予ADN;小鼠gAd腹腔注射，可以抑制缺血/再灌注诱导的超 氧阴离子产生的直方图。 '图6是给予ADN^小鼠gAd腹腔注射，可以抑制缺血/再灌注诱导的过 氧化亚硝基(ONOCT)产生的直方图。图4、 5、 6中，**尸<0.01 vs.WT; ##P<0.01 vs.ADN一。图l-6中，Sham (MI/R):表示假手术对照组；Vehicle:表示安慰剂处 理组；WT:表示野生型；ADN—A:表示脂联素基因敲除纯合型；ADN^: 表示脂联素基因敲除杂合型；AND一+gAd:表示脂联素基因敲除纯合型+脂 联素球状片段处理。以下结合附图和发明人给出的实验及其结果对本发明作进一步的详细 说明。
具体实施方式
1.脂联素球状片段(gAd)的制备用Trizol (Invitrogen公司产品)从人脂肪组织提取总RNA，使用 Invitrigen Superscript III试剂盒反转录成cDNA第一链(#18080-51)，以反 转录后的cDNA为模板，使用脂连素球状区特异引物PCR得到脂连素球状 区DNA片断(gAdi Kpnl F: 5 ， CCTGGAGAAGGTACCTATGTA 3 ， ； gAdi Xhol R 5， GAGTTAGTGGCTCGAGGTTGGTGTCATG 3，)。 所得到的 DNA片断经Kpnl和Xhol双酶切后联入同样用Kpnl和Xhol双酶切得到的 pET45b片断，连接产物用热激法转入XL10-GOLD感受态细胞，所得到的 表达载体经测序验证后，用热激法转化入BL21 (DE3)原核表达载体。 含有pET45b-gAdi载体的宿主菌经在LB培养基中37°C ， 200rpm培养过夜后，以IPTG终浓度为lmM诱导4-5小时；5000g离心收集细菌，按每克细菌加入4ml裂解液(50mMNaH2PO4， 300mMNaCl， 20mM Imidazole),将细菌悬浮后，加入Lysozyme至lmg/ml，室温200rmp振荡30min后以超声波处理(2SX20)。14000g, 20min， 4'C离心，取上清，上Ni-NTA柱；.以>4倍柱床体积的WashingBuffer (50mMNaH2PO4， 300mMNaCl， 20 mMImidazole)洗柱后，以1-2ml的Elution Buffer洗脱。Ni-NTA柱按照保养手册清洗或再生，存于浓度为30%的乙醇中。洗脱后的蛋白以Millipore centricon Plus-20浓縮并除去Imidazole(Imidazole对BCA法测定的蛋白浓度有影响)。蛋白内毒素的去除使用ActiCleanEtox内毒素亲和柱(Sterogene公司产品)，去除内毒素后的蛋白以LAL (CAMBREX)试剂盒检测内毒素含量。所得到的脂联素球状片段的基因序列与已知的基因序列完全相符，满足 设计要求，其基因序列如下atgctgttgctgggagctgttctactgctattagctctgcccgggcatgaccaggaaaccacgactcaagggcccggagtcctgcttcccctgcccaagggggcctgcacaggt.tggatggcgggc atcccagggcatccgggccataatggggccccaggccgtgat.ggcagagatggcacccct;ggtga g朋,gggtgagaimggagatccaggt;ctt.attggtccta.agggeigac.atcggtgaEUiccgga.gtac ccggggctgaaggtccccgaggctttccgggaatccaaggcaggaaaggagaacctggagaaggt gcctatgtataccgctca_gcattcagtgtggg￡ittggagacttax;gtt:gictatccccaa.catgcc ca.ttcgcttt.accaagatcttct.acaa;tcagca,aaaccactatgatggctccgLctggtaaattcc actgcaacattcctgggctgtactacttt.gccta_ccacatcgicagtctatatgaaggatgtg￡igig gtcagcctcttcaagaaggacaiiggctEitgctcttcacctatgatcagtaccaggaaEiataatgt gga,c caggc c t c c ggc t c t gt gc t c c t gca t c t ggaggt gggc gac c aag t c t ggc 't c caggt. g t atggggaaggagagcgtaa.tgg￡ictctatgctgata.atgacaatga_ctccaccttciacaggcttt cttc.tct.accatgacaccaactga。2. 建立动物心肌缺血模型成年小鼠(野生型WT、纯和型ADN一型、杂合型ADN^型)先以2% 异氟烷麻醉，通过左胸部切口暴露心脏，以6-0丝线在冠状动脉左前降支根 部打一活结阻断血流，缺血30分钟后，松开活结，再灌注3小时或24小时 (只用于检测心梗范围及心功能指标)。gAd处理组为再'灌注10分钟之前给 予gAd (2pg/g)腹腔注射。3. 检测方法3小时再灌注结束后，利用TUNEL、 Caspase-3测定心肌细胞凋亡；利 用ELISA测定血清中脂联素的浓度以及测定硝基酪氨酸的含量反映ONOO-的生成；24小时再灌注结束后，利用侵入性的方法测定血流动力学参数， 包括左室舒张末压(LVEDP)、左心室等容期压力最大变化速率(+dP/d加ax、 -dP/d加ax)及心率(HR);利用伊文思蓝/TCC双染测定梗死面积。4. 结果①给予ADN一小鼠gAd腹腔注射，可以明显减小其缺血/再灌注时的梗死范围，改善心功能。
缺血/再灌注导致明显心肌梗死和心功能受损，而与野生型相比，在血
浆脂联素水平完全无法测出的ADN;小鼠(类似于糖尿病患者体内脂联素水 平低下的状态)，其心梗范围进一步扩大(图1A)，而心功能进一步降低(图 2)。给予杂合基因敲除小鼠(ADN^)缺血/再灌注处理，其心梗范围也较 野生型增加(图1A)，心功能减弱(图2)，而与ADN一相比程度则较轻。 再灌注前10分钟，给予ADN一小鼠腹腔注射人源性重组gAd，可以剂量依 赖性减小心梗范围(图1B)，而且其心梗范围小于未接受治疗的野生型组(图 1A)。另外，外源性gAd治疗可明显改善ADN一小鼠的心功能(图2)。
② 给予ADN^小鼠gAd腹腔注射可减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞 凋亡。
缺血/再灌注导致明显的心肌细胞凋亡，而与野生型相比，ADN一动物心 肌细胞凋亡显著增加(图3A)，表现为TUNEL染色阳性细胞增加(图3B) 和Caspase-3酶活性升高(图3C)， ADN^小鼠心肌细胞凋亡也进一步增加， 而与ADN^相比其程度较轻。给予外源性gAd治疗减少了 ADN'M、鼠缺血/
再灌注导致的细胞凋亡(图3A、 3B)。
③ 给予ADN一小鼠gAd腹腔注射可以抑制缺血/再灌注诱导的ONOCT
的产生。
缺血/再灌注可引起ONOCT的生成，导致心肌细胞凋亡，而与野生型相 比，ADN一动物ONOCT的生成进一步增加，表现为硝基酪氨酸产物的增多 (图6)。申请人还发现ONOCT的增加是由于一氧化氮和超氧阴离子的生成 增多引起，给予gAd可分别抑制二者的生成(图4、5)，从而减少产物ONOO-， 表现为硝基酪氨酸产物的减少(图6)。
综上所述，申请人利用ADN一小鼠(模拟糖尿病患者体内脂联素水平低 下状态)缺血/再灌注模型研究发现，该基因型小鼠缺血/再灌注时心肌损伤明显重于野生型小鼠。而给予人源性重组gAd腹腔注射可以很快使其在 ADN一小鼠血液中达到有效浓度(10、 60、 120分钟的浓度分别为9.9±0.7、 23.6士1.2、 20.1±1.9ng/ml)，进而抑制ONOCT的生成，减少心肌细胞凋亡， 从而明显减轻ADN^小鼠的缺血/再灌注损伤，有潜在的临床应用价值。
申请人很多年前就已经认识到，血管开通时的再灌注会对缺血心脏造成 进一步的损伤，尤其对于糖尿病患者，其心肌易损性在缺血时就己经增加， 再灌注会对心肌造成更严重的伤害，导致糖尿病患者发生缺血性心脏病时即 使很及时的开通血管，预后也往往不佳。然而，目前对于糖尿病患者心肌易 损性增加的机制尚不完全清楚，临床上也尚无对症药物。申请人研究发现的 人源性脂联素球状片段，其分子量小，生物利用度好；相比于动物源性制剂， 免疫原性小；腹腔注射，简单方便。因此，它在糖尿病缺血性心脏病的治疗 方面有着良好的应用前景。
本发明的使用对象是体内脂联素水平低下的缺血性心脏病患者，特别是 糖尿病患者。本发明简单易行，且无特殊禁忌症，可在大医院、小诊所等广 泛使用。人源性脂联素球状片段的基因序列
atgctgttgctgggagctgttctactgctattagctctgcccgggcatgaccaggaaaccacgac tcaagggcccggagtcctgcttcccctgcccaagggggcctgcacaggttggatggcgggcatcc cagggcatccgggccataatggggccccaggccgtgatggc卿gatggcacccctggtgagaag ggtgagaaaggagatccaggtcttattggtcctaagggagacatcggtgaaaccggagtacccgg ggctgaaggtccccgaggctttccgggaatccaaggcaggaaaggagaacctggagaaggtgcct atgtataccgctcagcattcagtgtgggattggagacttacgttactatccccaacatgcccatt cgctttaccaagatcttctacaatcagcaaaaccactatgatggctccactggtaaattccactg caacattcctgggctgtactactttgcctaccacatcacagtctatatgaaggatgtgaaggtca gcctcttcaagaaggacaaggct8itgctcttcacctatgatcagtaccaggaaaataatgtg.gac caggcctccggctctgtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaagtctggctccaggtgtatgg ggaaggagagcgtaatggactctatgctgataa.tgacaal:gactccaccttcacaggctttcttc t c t ac c at gacac caac t ga
权利要求
1.人源性脂联素球状片段用于治疗糖尿病缺血性心脏病药物的应用。
2. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述的脂联素球状片段的 基因序列如下atgctgttgctgggagctgttctactgctattagctctgcccgggcatgaccaggaaacca cgactcaagggcccggagtcctgcttcccctgcccaagggggcctgcacaggttggatggcgggc atcccagggcatccgggccataatggggccccaggccgtgatggcagagatggcacccctggtga gaagggtgagaaaggagatccaggtcttattggtcctaagggagacatcggtgaaaccggagtac c c ggggc t gaaggt c c c c gaggc 111 c c gggaat c c aaggc aggaaaggagaac c t ggagaaggtcattcgctttaccaagatcttctacaatcagcaaaaccactatgatggctccactggtaaattcc actgcaacattcctgggctgtactac"tttgcctaccacatcacagtctatatgaaggatgtgaag gtcagcctcttcaagaagggicaaggctatgctcttcacctatgatcagtaccaggaaaataatgt ggaccaggcctccggctctgtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaagtctggctccaggtgt atggggaaggagagcgtaatggactctatgctgataatgacaatgactccaccttcacaggcttt cttctctaccatgacaccaactga。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为腹腔注射给药 制剂。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是指糖尿病患者 发生心肌梗死后接受血管再通治疗时，通过外源性给药，以减轻糖尿病患者 缺血心肌损伤。
全文摘要
本发明公开了一种人源性脂联素球状片段用于治疗糖尿病缺血性心脏病药物的应用，本发明所得到的脂联素球状片段的基因序列与已知的基因序列完全相符，与全长的脂联素相比，其水解以后的脂联素球状片段有着更强的生物学活性，而且给药后反应迅速，生物利用度好，有着更好的临床应用前景，特别是对糖尿病患者在发生心肌梗死后接受血管再通治疗时，通过外源性给药，以减轻糖尿病患者缺血心肌损伤。
文档编号A61K9/08GK101332294SQ20081001816
公开日2008年12月31日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者涛 尹, 王海昌, 凌 陶, 马新亮 申请人:中国人民解放军第四军医大学