专利名称：用作诊断和治疗靶标的Sgk和Nedd的制作方法
用作诊断和治疗耙标的Sgk和Nedd本发明涉及用于诊断性检测Sgk (血清和糖皮质激素依赖性激酶)特 别是Sgkl和/或Sgk3、和/或蛋白激酶B (PKB )和/或Nedd (神经前体细 胞表达的发育下调基因)特别是Nedd4-2的物质的用途。本发明还涉及影 响葡萄糖转运的活性化合物的用途，特别是用于治疗性治疗与葡萄糖吸收 紊乱相关的疾病，以及用于在增肥期使动物变重。本发明也涉及诊断试剂 盒。上皮细胞顶端膜内的Na、偶联转运蛋白Sgltl (钠葡萄糖转运蛋白) 负责葡萄糖肠和肾的转运。这种葡萄糖转运中的紊乱将导致多种疾病，例 如肥胖症和糖尿病。直到今天，关于sgiti的调控了解得很少。最a现了一种调控肾上皮Na+通道ENaC的新机制泛素连接酶Nedd4-2将通道泛素化，并因此 使所述通道易于内化和分解[Debonneville C, Flores SY， Kamynina E， Plant PJ， Tauxe C， Thomas MA， M腿ter C, Chraibi A， Pratt JH， Horisberger JD， Pearce D， Loffing J， Staub O.通过Sgkl磷酸化Nedd4-2 而调控上皮Na+通道的细胞表面表达，EMBO J. 2001; 20: 7052-7059。 Nedd4-2通过血清和糖皮质激素诱导的激酶1 (Sgkl)得以磷酸化，并且 因此失活。所以，Sgkl是肾上皮Na+通道的有效刺激剂[De la Rosa等人. 1999， Boehmer等人.2000， Chen等人.1999， N d ray國Fejes-T 6 th等人. 1999， Lang等人.2000， Chigaev等人.2000， Wagner等人.2001]。最近，双胞胎研究显示sgkl基因中某些单核苷酸多态性(SNPs) (E8CC/CT; I6CC )与高血压有关[Busjahn A， Aydin A， Uhlmann R.等人， 血清和糖皮质激素调控的激酶(SGK1 )基因和血压.Hypertension 2002; 40: 256-260。在一般意义上，激酶是转运磷酸基团到单个底物的蛋白。血清和糖皮质激素依赖的激酶(Sgk)最初从大鼠乳癌细胞克隆得到[Webster MK， Goya L， Firestone GL， Y. Biol. Chem. 268(16): 11482-11485,1993; Webster MK， Goya L， Ge Y， Maiyar AC， Firestone GL， Mol. Cell. Biol. 13(4): 2031-2040， 1993]。Sgkl起初作为糖皮质激素敏感基因得以克隆[Webster MK， Goya L， Ge Y, Maiyar AC, Firestone GL:通过糖皮质激素和血清诱导转录的丝氨 ^/苏氨酸蛋白激酶基因家族的一个新成员Sgk的表征，Mol Cell Biol 1993; 13: 2031-2040]。许多研究已经表明Sgkl受到大量刺激物的影响[Lang F， Cohen P.血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶同工型的调控和生理作用. Science STKE. 2001年11月13日；2001(108): RE 17],其中所述刺激物例 如盐皮质激素的刺激Chen SY, Bhargava A， Mastroberardino L， Meijer OC， Wang J， Buse P， Firestone GL， Verrey F， Pearce D:醛固酮诸导的蛋白 Sgk调控上皮钠通道,Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 2514-2519; N d ray画Fejes-T 6 th A， Canessa C， Cleaveland ES， AWrich G， Fejes-T 6 th G: Sgk是肾集合管中的由醛固酮诱导的激酶.对上皮Na+通道的作用，J Biol Chem 1999; 274: 16973-16978; Park J， Leong ML, Buse P， Maiyar AC, Firestone GL， Hemmings BA:血清和糖皮质激素诱导的激酶(Sgk)是PI3 激酶刺激的信号通路的靶标，EMBO J 1999; 18: 3024-3033; Brenan FE， Fuller PJ.体内通过皮质类固醇快速上调血清和糖皮质激素调控的激酶(Sgk )基因表达，Mol Cell Endocrinol. 2000; 30: 166: 129-36; Cowling RT， Birnboim HC.人粒细胞中的GM-CSF和其它促炎调节剂上调血清和糖皮 质激素调控的激斷Sgk )mRNA的表达，J Leukoc Biol. 2000; 67; 240-248， 以及其它。胰岛素样生长因子IGF1通过胰岛素和氧化应激以信号级联方 式，以及通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3-激酶)和磷酸肌醇依赖性激酶(Pdkl) 刺激Sgkl [Kobayashi T， Cohen P.激活磷脂酰肌醇3激酶的激动剂对血清 和糖皮质激素调控的蛋白激酶的激活是由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-l(Pdkl)和pdk2介导的，Biochem J 1999; 339: 319-328; Park J, LeongML， Buse P， Maiyar AC， Firestone GL， Hemmings BA:血清和糖皮质激 素诱导的激酶(Sgk)是PI 3激酶刺激的信号途径的靶标，EMBO J 1999; 18:3024-3033; Kobayashi T， Deak M， Morrice N， Cohen P.血清和糖皮质 激素诱导的蛋白激酶的两种新同工型的结构和调控特点，Biochem. J. 1999;344:189-197。Pdkl激活Sgkl涉及422位丝氨酸的磷酸化。将这个 丝氨酸突变为天冬氨酸(S422DSgkl )产生一种组成型活化的激酶 [Kobayashi T， Cohen P:激活磷脂酰肌醇3激酶的激动剂对血清和糖皮质 激素调控的蛋白激酶的激活是由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-l (Pdkl)和 pdk2介导的，Biochem J 1999; 339: 319-328。此后，Sgkl的两种同工型即Sgk2和Sgk3得以克隆[Kobayashi T， Deak M， Morrice N， Cohen P. 1999.血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶的两种新 同工型的结构和调控特点，Biochem. J. 344:189-197。Sgk的全部三种同工 型和蛋白激酶B( PKB )经由PI3激酶和Pdkl激活[Kobayashi T和Cohen P. 1999,激活磷脂酰肌醇3激酶的激动剂对血清和糖皮质激素调控的蛋白 激酶的激活是由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-l (Pdkl)和pdk2介导的， Biochem J 1999; 339: 319-328]。本发明的目的在于提供新型的诊断和治疗应用以调节葡萄糖的摄取。 本发明的另一个目的是通过调控葡萄糖摄取来增加动物的体重。令人吃惊的是，在双电极电压钳实验中已经证明Nedd4-2也能使肾和 肠 3+-葡萄糖转运蛋白Sglt失活，而且这种作用可通过抑制Sgkl和/或 Sgk3和/或PKB而进行。既然加速的葡萄糖吸收促i^巴胖的^A,举例来 说，它意味着Nedd4-2、 Sgkl、 Sgk3和PKB在肥胖t艮中起到因果关系 的作用。通过检测Nedd4-2和/或Sgkl和/或Sgk3和/或PKB,可例如确定 肥胖的原因，并能通过适当的治疗和预防措施进行治疗或预防。由加速的 肠葡萄糖吸收诱导的肥胖症以及高血糖症也有助于糖尿病的发生。最后， 肾Na+通道的同时调节异常将导致高血压的发生。肥胖、高血压和糖尿病 的发生是称为代谢综合征的主要特点。反过来，抑制Sgkl和/或Sgk3和/或PKB导致了对肾和肠 3+-葡萄糖转运蛋白Sglt的抑制。因此，通过独立权利要求l、 10、 13、 23、 28、 30、 31、 32、 34和46 的主题达到了本发明的目的。优选的实施方案在从属权利要求中具体指出。 所有权利要求中的措辞在此处引用作为参考。本发明要求至少一种检测活化的和/或失活的Sgk (特别是Sgkl和/或 Sgk3 )和/或PKB和/或Nedd (特別是Nedd4-2 )的表达和/或功能的物质 的用途。这因此也使得所述物质可以，特别是，诊断与葡萄糖转运紊乱相 关的疾病。此物质优选地至少为一种选自抗体和/或核苷酸的物质。例如， 这种物质可以是一种抗Sgkl、 Sgk3、 PKB和/或Nedd4-2的抗体并且可以 用于本领域技术人员熟悉的检测方法例如ELISA(酶联免疫吸附试验)中。 在这些免疫测定法中，将4十对待测定抗原(如Sgkl、 Sgk3和/或PKB)的纤维素或聚^乙烯)，在支持物;上与样5^"育后免疫复合物得以形成。在 随后步骤中，向这些免疫复合物提供经标记抗体。通过向反应混合物中添 加发光底物，能看见结合免疫复合物的酶/底物复合物，或者通过光度检测 结合免疫复合物的标记酶与已知酶活性的标准品比较来确定样本中的抗原 浓度。如上面已经提到的，也可用核苷酸特别是寡核苷酸进行诊断性检测， 其中所述寡核苷酸适于例如通过分子遗传方法使用聚合链式反应定量检测 Sgkl,其中特异DNA片段得以选择性扩增。优选使用抗Nedd蛋白中至少一种磷酸化和/或非磷酸化激酶共有序列 的抗体。就此而论，"共有序列，，应理解为激酶的底物位点，也就是磷酸 化位点的M酸序列。Nedd蛋白中的Sgkl共有序列在本上下文中是特别 优选的。也可检测Nedd蛋白中的失活突变，特别是在激酶共有序列中的突变 (例如,腦Nedd4-2或謹Nedd4-2)。另外，在病人DNA中可检测活 化突变，例如S422DSgkl和/或T308D，S473DPKB。在进一步的用途中，在病人 RNA中检测相应的突变。最后，在病人的Sgk特别是Sgkl和/或Sgk3、 PKB、和/或Nedd蛋白特别是Nedd4-2蛋白中检测相应突变。优选使用或者合适的抗体和/或合适的核苷酸、特别是寡核苷酸，作为这些检测的探针。 与葡萄糖转运紊乱相关的和待诊断的疾病特别的是代谢综合征或肥胖症。本发明进一步包括了 一种用于诊断易患肥胖或肥胖症体质的方法。此i貪断方法的特点在于，在Sgk特别是Sgkl和/或Sgk3中，在PKB、 nedd 特别是nedd4-2的基因中，和/或在sglt特别是sgltl中，检测至少一种多 态性。就此而论，优选检测Sgkl中的E8CC/CT; I6CC多态性。这种多态 性与体重指数直接相关，因此它是突出易患肥胖的体质的特别合适标志。 所述缩写代表外显子8的一个SNP (C —T)和在距离551个>5^对处外显 子7的供体位点(内含子6 )的第二个SNP ( T —C )。为了检测相应多态 性，优选从合适的实验动物或病人中移出血液，并利用其中包含的基因材 料通过适当的测序方法或通过使用其它本领域技术人员熟悉的方法来测定 相应位点的序列。除血液外，可以从其中分离基因材料的其它所有生物样 品在原则上也是合适的。本发明还要求了至少 一种用于影响葡萄糖转运、特别是肠和/或肾葡萄 糖转运的活性化合物的用途。葡萄糖转运蛋白Sglt，特别是Sgltl优选地至 少部分负责这种葡萄糖转运。根据本发明，可以通过影响Sglt，特别是Sgltl 的表达和/或活性来影响葡萄糖转运。活性化合物优选地影响至少一种Sgk, 特别是Sgkl和/或Sgk3，和/或PKB，和/或影响至少一种Nedd,特别是 Nedd4-2。活性化合物优选地针对Sgk、特别是Sgkl和/或Sgk3，和/或PKB, 和/或Nedd、特别是Nedd4-2。在本发明的另一优选实施方案中，活性化 合物针对Sgk，特别是Sgkl和/或Sgk3，和/或PKB和/或Nedd，特别是 Nedd4-2的活化剂、抑制剂、调节剂和/或生物前体。在本发明的一个优选实施方案中，活性化合物是多核苷酸。这种多核 苷酸例如可包含降低或抑制至少 一种上述蛋白质表达的反义序列。在另一 个优选实施方案中，这种多核苷酸编码肽、优选多肽，这种肽影响Sgk， 特别是Sgkl和/或Sgk3，和/或PKB,和/或Nedd，特别是Nedd4-2的表 达和/或功能。另外，活性化合物能本身优选地为影响上述蛋白的表达和/或功能的肽或多肽。活性化合物可以是"小分子化合物"，优选具有分子量〈1000的"小分子化合物"。根据目标是治疗与葡萄糖转运紊乱相关疾病还是目标为与增肥相关的 提高动物的体重，必须以不同方式影响各种酶。为了防止或治疗与葡萄糖吸收紊乱相关的疾病，活性化合物应该抑制至少一种Sgk，特别是sgkl和 /或sgk3，和/或PKB,和/或刺激至少一种Nedd，特别是Nedd4-2。因为 Sgk和PKB是激酶，则本领域技术人员熟悉的激酶抑制剂，例如星形孢菌 素和/或白屈菜to咸，或至少一种它们的类似物，是特别适合的。因为Nedd 是连接酶，则连接酶活化因子适于刺激它们。这些活性化合物优选地用于 产生药物或药物组合物。待治疗的疾病优选地为代谢综合征，特别是肥胖 症。另一方面，如果与上面描述的目的在于降低葡萄糖转运而进行的疾病 预防或治疗相反，目的在于获得葡萄糖转运的提高，例如用于与增肥相关 的增加动物体重，则活性化合物优选地刺激至少一种Sgk，特别是sgkl和 /或sgk3，和/或PKB，和/或抑制至少一种Nedd,特别是Nedd4-2。刺激 Sgkl例如导致Nedd4-2例如被抑制，这样结果导致葡萄糖转运蛋白Sgltl 的分解净皮推迟。结果导致增加葡萄糖转运。在本发明的一个优选实施方案 中，这种活性化合物至少是一种Sgk活化剂和/或PKB活化剂，特别是生 长因子，优选IGFl和/或胰岛素。在本发明的另一优选实施方案中，这种活性化合物至少是sgkl和/或 sgk3,和/或PKB基因的转录的一种刺激物，优选至少一种糖皮质激素、 盐皮质激素、促性腺激素和/或细胞因子，特别是TGFP。本发明进一步涉及诊断试剂盒。此试剂盒包括至少一种用于检测活化 和/或失活Sgk，特别是sgkl和/或sgk3，和/或PKB和/或Nedd，特别是 Nedd4-2的表达和/或功能的物质，用于诊断与葡萄糖转运紊乱有关的疾病。 这些疾病优选地为代谢综合征，特别^J巴胖症。该试剂盒特别地可包含抗 体和/或寡核苷酸以用于检测相应的蛋白和/或核酸。例如，这些抗体和/或 寡核苷酸能用来分析不同蛋白或酶的量和/或活性。另外检测基因中的相应突变也是可能的。关于该试剂盒的更多特征读者可以参考以下的描述。除此之外，本发明包括抗Nedd蛋白中的至少一种磷酸化激酶共有序 列的抗体。这种激酶共有序列是被相应激酶特别是被Sgkl磷酸化的序列。 抗体优选地识别Nedd4-2蛋白中的激酶共有序列。使用这种抗体，可分析 Nedd4-2是否被Sgkl磷酸化并因此失活。这因此使得研究Nedd4-2的活性 状态成为可能。本发明还包括抗Nedd蛋白中相应的非磷酸化激酶共有序 列的抗体。特别优选的是在一个测试方案中根据本发明结合这两种抗体， 由此使得获取关于Nedd活性状态的信息结果成为可能。本发明也包括抗Nedd蛋白中至少一种突变的激酶共有序列的抗体。 这种共有序列优选地为被相应突变的Sgkl共有序列。该激酶共有序列优 选位于Nedd4-2蛋白中。就此而论，在此特别优选的突变是s"8DNedd4-2 和/或S444DNedd4-2。相应突变的效果是相关激酶特别是Sgkl再也不能磷 酸化Nedd。这样一种抗体可用作研究相关突变的有用工具。本发明的抗体可使用本领域技术人员熟悉的方法得以制备。特别地， 可制备单克隆或多克隆抗体，而单克隆抗体被优选因为它们通常具有高特 异性。在本发明的诊断试剂盒中特别有利的是使用所描述的抗体。另外，所 描述的抗体也可非常有利地用于检测Sgk、 PKB和/或Nedd的表达和/或功 能的本发明用途中。在此上下文中，这些抗体可依据常规的免疫学方法使 用。特别地，可使用这些抗体以实施上面已经提到的ELISA。本发明还包含组合物，优选药物组合物，其中包含至少一种活性化合 物，所述活性化合物影响葡萄糖转运，特别是肠和/或肾葡萄糖转运，而且， 根据需要，所述药物组合物还包含可药用赋形剂。特别优选地是，该活性 化合物影响至少一种Sgk和/或PKB，和/或至少一种Nedd。在另外优选的 实施方案中，这种活性化合物影响Sgk，特别是sgkl和/或sgk3，和/或PKB 和/或Nedd，特别是Nedd4-2中的活化因子、抑制剂、调节剂和/或生物前 体。所述活性化合物有利地是多核苷酸。该多核苷酸可以包含降低或抑制相关基因表达的反义序列。也可通过本领域技术人员熟悉的显性阴性(dominant negative)法，选择一种相关多肽，以抑制单个基因或多个基 因的表达，或限制相应基因产物的功能。另外，所述多核苷酸可编码肽， 优选多肽，其中所述肽影响Sgk，特别是sgkl和/或sgk3,和/或PKB和/ 或Nedd，特别是Nedd4-2的表达和Z或功能。本领域技术人员可以获得这 些方法所需的相应分子生物学操作。在另一优选实施方案中，该活性化合 物是所描述的肽本身。这种活性化合物优选地是"小分子化合物"，优选 分子量<1000的"小分子化合物"。特别地为了治疗与葡萄糖转运紊乱相关的疾病，所述活性化合物抑制 至少一种Sgk和/或PKB和/或刺激至少一种Nedd。为了治疗这些疾病， 所述活性化合物特别优选地为至少一种激酶抑制剂，优选星形孢菌素和/ 或白屈菜红碱或一种它们的类似物，和/或至少一种连接酶活化因子。为增强葡萄糖转运，特别是与动物增肥有关时，所这活性化合物优选 刺激至少一种Sgk和/或PKB和/或抑制至少一种Nedd。为增强葡萄糖转 运，所述活性化合物有利地是一种Sgk活化因子，特别是生长因子，优选 IGF1和/或胰島素。在本发明的另一优选实施方案中，所述活性化合物是 sgkl和/或sgk3和/或PKB的转录刺激物，优选地为至少一种糖皮质激素、 盐皮质激素、促性腺激素和/或细胞因子，特别是TGFP。所描述的不同可能性可以相互结合。本发明还包括一种用于产生转基因动物的方法，其中所述转基因动物 表现出脂肪組织中脂肪沉积增加。本发明的此方面不包括人类。特别地， 因为这些动物体重长得较快，这些动物对食物生产4艮有前途。用这些动物 可以更快和更有效地实施增肥。用于产生这些动物的方法的特点在于这些 动物中的Sglt，特别是Sgltl的表达和/或功能得到了增强。这样就加速了 葡萄糖的肠吸收，因此导致血浆中葡萄糖浓度增长更快。这导致分泌更高 水平的胰岛素，因此最后导致脂肪組织中的脂肪沉积被刺激。本发明这方面的一个特别优选的实施方案中，Sglt特别是Sgltl为此目 的在动物中得到过量表达。其中所述Sglt特别是Sgltl的过量表达例如是通过将携带有位于合适Sglt序列上游的合适功能性强启动子的合适基因构 建体特别是载体导入而实现的。也优选的是表现出适当的强Sglt特别是 Sgltl表达的克隆动物。其实施方法步骤为本领域技术人员可获得的。在另一个优选实施方案中，Sgk，特别是sgkl和/或sgk3，和/或PKB 的表达和/或功能得以增强。在最后的结果中，这因此也增强了Sglt，特别 是Sgltl的活性或蛋白量，这意味着葡萄糖转运得到了增强。为了做到这 些，用常规分子生物学方法可以过量表^目关基因。另一方面，也可将表 达适当组成型活化突变体的基因构建体导入或整合入生物体中。就此而论，尤其优选突变体S422DSgkl和/或T，D，SWDpj^。这些突变体的活性与其它酶活性特别是激酶活性无关，并且所述突变体因而总是有活性的。它们抑 制由于泛素连接酶Nedd特别是Nedd4-2引起的Sglt特别是Sgltl的分解， 这是，因而导致葡萄糖转运得到增强。在另 一个优选实施方案中，泛素连接酶Nedd特别是Nedd4-2的表达 和/或功能降低。这对葡萄糖转运的增加产生影响，原因在于Sglt特别是 Sgltl被分解而降低。使用常规分子生物学方法，如反义或显性阴性法同样 也可实现适当降低Nedd的表达和/或功能。特别优选的是稳定地将nedd 特别是nedd4-2的适当突变体整合到生物体中或抑制Nedd基因以l更以这 种方式在一个长时期内降低或抑制这种酶的表达。适当的方法步骤为本领 域技术人员所知。在此方面，特别优选的是插入至少一种失活突变到Nedd 特别是Nedd4-2中。在此上下文中可以非常有利地使用S338DNedd4-2和/ 或S444DNedd4-2突变体。本发明也包括可通过本发明方法产生的动物。已经描述的特征和本发明的其它特征，由下面与从属权利要求以及附 图结合的优选实施方案的描述产生。就此而论，每种情况下单个特征可以 它们自己或和几个相互结M来实现。附图简迷
图1:显示了 Nedd4-2和Sgkl对 3+-偶联的葡萄糖转运蛋白Sgltl的 调控。上部原始测量数据；下部算术平均± SEM(n=6-15)。注射sgltl、nedd4-2和/或sgkl cRNA到非洲瓜檐卵母细胞中。Nedd4-2下调表达Sgltl 的卵母细胞中由20mM葡萄糖诱导的电流，Sgkl刺激电流并且反转了 Nedd4-2的作用。A表示与在^l^达Sgltl的卵母细胞中测定的电流相比存 在明显差异。#表示与在表达Sgltl和Nedd4-2的卵母细胞中的相应值相 比存在明显差异。图2:显示Nedd4-2、组成型活化的S422DSgkl和失活的K127NSgkl对 3+-偶联的葡萄糖转运蛋白Sgltl的调控。上部原始测量曲线；下部 算术平均± SEM(n=8-71)。注射sgitl， nedd4画2和/或S422DSgkl或K127NSgkl cRNA到非洲瓜蟾卵母细胞中。Nedd4-2显著地下调表达Sgltl的卵母细胞 中由20mM葡萄糖诱导的电流，S422DSgkl而不是K127NSgkl刺激电流并且 反转了 Nedd4-2的作用。*表示与自身表达Sgltl的卵母细胞中测定的电 流相比存在明显差异。#表示与表达Sgltl和Nedd4-2的卵母细胞中相应 值相比存在明显差异。图3:显示Nedd4-2、 T卿D，s^Dp^和Sgk3对^+-偶联的葡萄糖转运蛋白Sgltl的调控。上部原始测量曲线；下部算术平均土SEM。注 射sgltl、 nedd4-2、 T3°8D,S473DPKB和/或Sgk3 cRNA到非洲瓜蟾卵母细胞 中。Nedd4-2显著下调表达Sgltl的卵母细胞中由20mM葡萄糖诱导的电 流。T3G8D，S473DpKB和Sgk3刺激电流并且反转了 Nedd4-2的作用。*表示与自身表达Sgltl的卵母细胞中测定的电流相比存在明显差异。 #表示与表达Sgltl和Nedd4-2的卵母细胞中相应值相比存在明显差异。图4:显示Nedd4-2和Sgkl对NaM禺联的葡萄糖转运蛋白Sgltl的调 控。算术平均± SEM(n=18)。注射sgltl， nedd4-2和/或S422DSgkl (SD) cRNA 到非洲瓜蟾卵母细胞中。同时表达的Nedd4-2减小了由加入的5mmo1葡萄 糖诱导的电流，而同时表达组成型活化的激酶s^DSgkl显著增加了电流。图5:显示Nedd4-2、Sgk3和PKB对 3+-偶联的葡萄糖转运蛋白Sgltl 的调控。算术平均士SEM (实验方法如图4)。实施例方法i. 非洲瓜蟾卵母细胞中的表达和双电板电压钳法编码野生型Sgkl [Waldegger S， Barth P， Raber G, Lang F:细胞体积 等压和变压变化中经转录调节的推定人丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的克隆和 描述，Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94; 4440-4445、编码组成型活化的 Sgkl ( S422DSgkl)和失活Sgkl ( K127NSgkl) [Kobayashi T， Cohen P.激活由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-l( Pdkl )和pdk2介导的，Biochem J 1999; 339: 319-328、野生型Sgk3和PKB[Kobayashi T， Deak M， Morrice N， Cohen P.血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶的两种新同工型的结构和调 控特点，Biochem. J. 1999;344:189-97、组成型活化的T3°8D，S473dpkb [Alessi DR， Cohen P.蛋白激酶B的激活机理和功能，Curr. Opin Gene Dev. 1998; 8: 55-62、野生型Nedd4-2 [Debonneville C， Flores SY， Kamynina E, Plant PJ， Tauxe C， Thomas MA， Munster C， Chraibi A， Pratt JH， Horisberger JD， Pearce D， Loffing J， Staub O.通过Sgkl砩酸化Nedd4-2而调控上皮 Na+通道的细胞表面表达，EMBO J. 2001; 20: 7052-7059和野生型Sgltl [Hediger MA， Coady MJ， Ikeda TS， Wright EM. Na十/葡萄糖共转运蛋白 的克隆表达和cDNA测序.Nature. 1987; 330: 379-381]的cRNAs在体外合 成[Wagner CA, Friedrich B， Setiawan I， Lang F, Br6er S:非洲瓜蟾卵母 细胞的用途，用于对异源表达的膜蛋白进行功能性描述，Cell Physiol Biochem 2000; 10: 1-12]。非洲瓜蟾卵巢的剥离以及卵母细胞的收集和处理 已有详细描述[Wagner CA， Friedrich B， Setiawan I， Lang F， Br6er S:非 洲瓜蟾卵母细胞的用途，用于对异源表达的膜蛋白进行功能性描述，Cell Physiol Biochem 2000; 10: l-12。用5ng的人sgltl、7.5ng人sgkl、K"7Nsgkl、 s422Dsgkl 、 sgk3 、 PKB或T3°8D，S473DPKB cRNA和/或5ng的非洲瓜蟾nedd4-2 cRNA注射卵母细胞。对照卵母细胞注射水。注射各种cRNA三天后室温 下实施电生理实验。用双电极电压钳法测定胞外施用20mM或5mM葡萄 糖所诱导的电流[Wagner CA， Friedrich B， Setiawan I， Lang F， Br6er S:非洲瓜蟾卵母细胞的用途，用于对异源表达的膜蛋白进行功能性描述，Cell Physiol Biochem 2000; 10: l-12并用作对葡萄糖转运的衡量。用MacLab 数字模拟转换器和相应的软件(AD Instruments, Castle Hill,澳大利亚) 在10Hz下过滤数据并分析。对照浴溶液(ND 96 )包含96mM NaCl 、 2mM KC1 、 1.8mMCaCl2 、 ImM MgCl2和5mM HEPES ， PH值为7.4。所 有物质在规定的浓度下使用。用HC1或NaOH滴定终溶液到规定的PH或 PH7.4。快速灌流溶液流速为20ml/分钟，在10秒钟之内实现溶液的全部 转变。为了计算，将数据提供为算术平均士SEM。 n是观测的卵母细胞数。 所有试验在卵母细胞的至少三不同组中进行。在所有重复实验中得到了质 量上相似的数据。用Studentt检验来检验结果的显著性差异。仅有P<0.05 的结果^L为具有统计学上的显著性。2.双力包胎研究征募了 126对同卵双生和70对异卵双生双胞胎以研究血压调控和心血 管表型。也包括了异卵双生双胞胎的父母。所有参与者是来自德国不同地 方的德国白种人。为了确定接合性和用于其它分子遗传学研究，从所有双 胞胎和异卵双生双胞胎的父母抽取血液。对每个参与者进行了医学和生理 检查。没有一个参与者具有家族史慢性医学疾病。在外显子8中(C —T) 中确定了一个单核苷酸多态性(SNP),并且在距离551个碱基对处外显 子7的供体位点(内含子6 )中确定了第二个SNP( T —C )[Busjahn A， Aydin A, Uhlmann R.等人，血清和糖皮质激素调控的激酶(SGK1)基因和血压， Hypertension 2002; 40: 256-260。分析这两个单独的SNPs，即内含子6(T —C)和外显子8 (C —T)。对这两种SNP的描述统计学显示作用的隐性模式。群丛分析因此基于 两組比较，即基于变体的纯合携带者与杂合携带者和非携带者。用chP检 验检验了这两种SNP的独立性。SNPs与表型之间的关系通过单维方差分 析(imidimensional ANOVA )检验，其中这两种多态性被同时引入。对异 卵双生双胞胎对的两部分和对同卵双生双胞胎对的随机选择部分进行了这种分析。这种检验比t检验更可靠，而且有可能同时考虑两种多态性并包 括它们的相互作用。另外，通过这种方法，减少研究的数量也是可能的。因为异卵双生双胞胎对的两部分并不是相互独立的，在ANOVA检验中将 家族影响以及年龄和性别包括在内以作为协变因子。显著性水平设为0.05。 在确认组中，通过单维ANOVA检验了同时使用两种SNP的相关性效果。 结果20mM葡萄糖的施用导致注射了 Sgltl mRNA的非洲瓜蟾卵母细胞而 不是注射水的卵母细胞中产生了 48.6±11.5nA(n=18)的内向电流(I，)。 经比较，葡萄糖处理导致注射水的卵母细胞产生了 1.3 ± 0.7nA ( n=6 )的 电流。在注射了 Sgltl mRNA和Nedd4-2 mRNA (共表达)的非洲瓜蟾卵 母细胞中，I一显著降低了 49.2±6.8% (n=15)。结果，sgltl受到泛素连 接酶Nedd4-2的下调(图1)。野生型Sgkl的共表达上调葡萄糖诱导的电流81.3 ±19.0% (n=15)， 并且反转了 Nedd4-2的作用。在表达Sgltl、 Sgkl和Nedd4-2的卵母细胞 中，葡萄糖诱导的电流比自身表达Sgltl的卵母细胞中观察的值高34.8± 11.8% (n=14)(图1)。组成型活化的S422DSgkl与野生型Sgkl有类似的效果(图2 )。S422DSgkl 的共表达提高了葡萄糖诱导的电流达72.4 ±9.1% (n=57)。在这一系列实 验中，Nedd4-2的共表达降低电流达35.3 ±4.4% ( n=46 )。此作用通过额 外共表达的S422DSgkl反转。在共表达Nedd4-2和S422DSgkl的卵母细胞中， 电流比本身表达Sgltl的卵母细胞高59.2 ±19.8 Q/n (n=16)(图2)。与野 生型或组成型活化的Sgkl相比，失活突变的K127NSgkl没有显著改变底物 诱导的电流(-2.0 ±5.3%, n=14)，并且没有反转Nedd4画2的作用。在 表达Sgltl及K127NSgkl和Nedd4-2的卵母细胞中，葡萄糖诱导的电流比本 身表达Sgltl的卵母细胞低54.9 ± 9.7 % ( n=8 )(图2 )。T308D，S473DPKB的作用类似于sgkl的作用(图3 )。在这一系列实验中， Nedd4-2的共表降低电流达26.5 ±5.5% ( n=42 )。对表达Sgltl的卵母细胞，共表达组成型活化的T鄉D'M"Dpj^g显著增加葡萄糖诱导的电流达117.4 ±15.8% ( n=31 )，并且反转了 Nedd4誦2的作用。在共表达 T308D，S473DPKB、 Nedd4-2和Sgltl的非洲爪蟾卵母细胞中，电流比本身表达 Sgltl的卵母细胞中高106.5 ± 18.2 % ( n=27 )(图3 )。Sgk3与T3Q8D，S473DPKB和Sgkl以可比较的方式刺激葡萄糖诱导的电流 并且反转Nedd4-2的作用。与本身表达Sgltl的非洲爪蟾卵母细胞中葡萄 糖诱导的电流相比，在表达Sgltl和Sgk3的卵母细胞中葡萄糖诱导的电流 较之高123.6 ±15.0% (n=22)，在表达Sgltl 、 Nedd4画2和Sgk3的卵母细 胞中葡萄糖诱导的电流较之高112.4 ±19.4% (n=22)。图4显示sgltl和S442DSgkl ( SD )的共表达提高的Iglc值为77 ± 23 % 到65.4 ± 10.6nA ( n=18 )。在表达Sgltl、 Sgkl和Nedd4-2的卵母细胞中， 葡萄糖诱导的电流达到60.5 ± 8.9nA ( n=18 ),比只注射Sgltl的卵母细胞 中的相应值高61 ± 21 % ，比注射Sgltl和Nedd4-2 mRNA的卵母细胞高126 ±23%。这些实验中用5mM葡萄糖诱导电流。在另外一系列实验中，除组成型活化的s"^Sgkl (SD)外，还检测了 Sgk的同工型即Sgk2和Sgk3，以及蛋白激酶B ( PKB)。通过共表达 S442DSgkl，葡萄糖诱导的电流提高了 55±12% (n=44)，通过共表达Sgk3， 葡萄糖诱导的电流提高了 117 ±16。/。 (n=16)，通过共表达PKB,葡萄糖 诱导的电流提高了 101±18% (n=24),而Sgk2没有统计上的明显的效果。 尽管共表达Nedd4-2降低葡萄糖转运达23±4% (n=79)，但它不阻止通 过额夕卜共表达S442DSgkl ( + 48 ± 11 % ， n=48 ) 、 Sgk3 ( + 114 ± 26 % ， n=16 ) 和PKB ( +107±20%， n-24)产生的刺激。再一次地，Sgk2没有明显效 果。为研究体重调控中Sgltl与Sgkl的功能相关性，将具有Sgkl基因多 态性的双胞胎的体重指数关^来。带有多态性E8CC/CT; I6CC的双胞 胎的平均体重达到26.7±1.4kg/m2 (n=13)。这个值比双胞胎整体的相应 平均值(23.3±0.2kg/m2， n=263)明显要高(P<0.008 )。总之，实验表明Sgkl、 Sgk2和PKB对Sgltl有强刺激作用。Sgltl活 性的提高加快了葡萄糖的肠吸收，以至血浆中的葡萄糖浓度增加得较快。这增加了胰岛素的释放，并且因此刺激脂肪组织中脂肪的沉积。另一方面，Sgltl的抑制剂防止肥胖症。双胞胎研究表明与升高的血压相关的同一多态性也与高体重指数相关。
权利要求
1.一种诊断试剂盒，其包含至少一种用于诊断易患肥胖症的体质的抗体，其中所述抗体针对由sgk、PKB基因、nedd和/或sglt的至少一种多态性所引起的修饰。
2. 权利要求1的诊断试剂盒，其中sgk是sgkl和/或sgk3。
3. 权利要求1的诊断试剂盒，其中nedd是nedd4-2。
4. 权利要求1的诊断试剂盒，其中sglt是sgltl。
5. 权利要求1的诊断试剂盒，其中所述多态性是单核苷酸多态性。
6. 权利要求1的诊断试剂盒，其中所述多态性是sgkl中的E8CC/CT; 16CC。
7. 权利要求1-6的任一项的抗体的用途，其用于制备诊断易患肥胖症的 体质的诊断试剂盒。
全文摘要
本发明涉及用于诊断性检测Sgk特别是Sgk1和/或Sgk3、和/或PKB、和/或Nedd特别是Nedd4-2的物质的用途，本发明还涉及影响葡萄糖转运的活性成分的用途，用于治疗与葡萄糖吸收紊乱相关的疾病，以及用于使动物变胖。本发明也涉及诊断试剂盒及包含活性量的至少一种影响葡萄糖转运的活性成分的药物组合物。本发明还涉及用于产生转基因动物的方法。
文档编号A61P5/40GK101241127SQ20081008057
公开日2008年8月13日 申请日期2003年6月4日 优先权日2002年6月4日
发明者卡尔·朗, 弗洛里安·朗, 迈克尔·迪特尔 申请人:弗洛里安·朗