专利名称：：一种脊髓管膜、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医学、医学生物材料学以及医学组织工程学
技术领域：
，具体涉及一种脊髓管膜、其制备方法及应用。
背景技术：
：二十世纪末随着整体医学的高速发展，细胞生物学、分子生物学、遗传基因学以及组织工程学也随之不断的进步与发展。具有良好性能的生物材料也同时在被迅速的发现与利用。近年来组织工程学在医学临床中的快速掘起就证明了这一点。使用I型胶原蛋白做为载体的组织工程产品获得了显著的发展与应用。如中国专利号为021212779，名称为医用胶原蛋白材料及其制造工艺的专利就公开了一种高纯度的医用胶原蛋白材料，该文献在此全文引用作为参考。以牛肌腱组织为基料，经除杂，清洗，酸，碱，酶处理，硫酸软骨剂交联、冷冻干燥及环氧乙垸灭菌等工序制成的具有特定大小孔隙的片状的医用胶原蛋白材料，具有结构稳定、生物相容性好、可吸收的特点。目前，已在临床上用于硬脑膜、硬脊膜的再生修复和防止粘连。脊髓在外伤以及髓内肿瘤侵及时，可形成不同程度的脊髓损伤，造成阶段性脊髓功能障碍，严重的损害可导致脊髓断裂甚至缺损，将彻底阻断破坏脊髓神经中枢系统的功能，导致截瘫的发生。由于神经胶质细胞和其它非神经系统组织的侵入生长，阻止受损脊髓神经组织的再生，同时导致未受损伤的正常脊髓组织的变性与退化从而使截瘫难以得到修复。综上所述，因此对于外伤性脊髓损伤而致的截瘫病人，即使早期经手术治疗，但效果往往不佳，截瘫很难治愈。本发明的特点是在早期进行外科手术的时候，在损伤的脊髓段使用具有一定强度与三维结构的脊髓管膜在修整后的脊髓表面进行部分包裹，必要时可将自体骨髓干细胞移植于管膜的内表面，同时将具有特定功能的生物膜在生物管膜上再进行保护性的覆盖，这样不仅机械性的保护脊髓受损部位的组织不受外周其他组织的侵入干扰，同时还建立了受损脊髓部位的中枢神经组织的再生内通道，防止脑脊液和其内的生长因子过度丢失，保持受损脊髓内环境的相对稳定，为受损的脊髓中枢祌经组织的再生提供最佳环境。如何利用生物材料/细胞为基础修复受损的脊髓神经组织是本发明要解决的课题。
发明内容本发明的一个目的是提供一种脊髓管膜，该脊髓管膜由复合胶原管膜和胶原膜组成，可以协以自体骨髓干细胞的脊髓组织修复材料，用于修复再生受损的脊髓中枢神经组织。本发明的第二个目的是提供上述脊髓管膜的制备方法。本发明的第三个目的是提供上述脊髓管膜的应用。本发明提供的一种脊髓管膜，包括复合胶原管膜和胶原膜，其中胶原膜覆盖在复合胶原管膜外部，复合胶原管膜包括致密单一纵向孔隙的胶原外层和疏松的具有单一纵向孔隙的胶原内层，胶原膜是单一的有散状排列(即分散排列)孔隙的片状胶原膜。复合胶原管膜与胶原膜是各自独立的，可复合或单独使用。胶原实称为胶原蛋白，有21种之多，每种胶原蛋白在人体的组织器官内有其特定的功能，由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质。1型胶原蛋白占体内的总胶原量的90%，所以通常所指的胶原泛指I型胶原蛋白，在体内以胶原纤维形式存在。在高等动物机体中含量丰富，约占蛋白质总量的1/3。主要分布在结缔组织中。是人体皮肤、血管、骨胳、筋腱、牙齿和神经组织内结缔组织的主要基质。可以理解的是，I型胶原蛋白可从动物体内含量丰富的组织中用各种不同的方法提取，这是本领域的已知技术。本发明提供的一种脊髓管膜，由I型胶原蛋白制成，优选由高纯度I型胶原蛋白制成，更优选由0.5-5%的纯度为98%以上的I型胶原蛋白制作，更优选为0.5%的1型胶原蛋白，更优选为5%的I型胶原蛋白。本申请所述I型胶原蛋白可由商业渠道购得，也可以根据现有技术记载的技术手段制备获得。本发明提供的一种脊髓管膜，为中空结构，两端不封闭。脊髓管膜在长度上无限制，依据应用需要可制备成不同长度规格的产品，优选长度为0.1—50cm。脊髓管膜的横切面为有缺口的圆环(亦称为U形)，具体切口大小无特定要求，依据应用需要可制备成不同切口大小的产品，本发明保护范围不受产品长度和横切面形状的限制。具体形状可参见附图l一5。脊髓管膜内径为5-20毫米；其中复合胶原管膜厚度为0.1-5.0毫米，优选0.5-4.0毫米，更优选1.0-3.0毫米，更优选1.5-2.5毫米。复合胶原管膜的致密胶原外层厚度为0.75-1.75毫米，优选1-1.5毫米，最优选1,25毫米，胶原外层管壁孔隙大小为1-50阿，优选20-40nm，更优选25-35pm，更优选30pm。复合胶原管膜的疏松胶原内层厚度大，孔隙大且密度疏松，其中孔隙成轴向纵向排列，优选孔隙为狭长形结构。胶原内层膜壁厚度为1.5-3毫米，优选1.7-2.8毫米，更优选1.9-2.6毫米，更优选2.1-2.8毫米，更优选2.3-2.6毫米，最优选2.5毫米。胶原内层孔隙大小为100-300|am，优选120-28(Him，更优选140-260(xm，更优选160-240nm，更优选180-220nm，最优选200nm，易于神经细胞生长。在复合胶原管膜外部的胶原膜壁厚为0.1-3.0毫米，优选0.5-l毫米;并具有10-20(Hun，优选35-175nm，更优选60-150pm，更优选85-125pm大小的无特殊结构孔隙。该复合材料是由2-3次冷冻程序完成的，复合胶原管膜是由两层相同材料组成的，但是孔隙的方向性和大小都是不同的。两层胶原组织之外层的厚度薄，孔隙小而且致密，孔隙排列不规整。本发明提供的一种脊髓管膜，其能在6个月特定时间内降解。本发明提供的一种脊髓管膜，所述脊髓管膜是双开口结构。本发明还提供一种脊髓管膜的制备方法，包括如下步骤将1型胶原蛋白制成0.5-10%浓度的胶原蛋白悬浊液(优选5%浓度)，注入到开放管型的模具内，经1-2毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-80到-100摄氏度以内，使其形成符合要求的复合胶原管膜的疏松胶原内层；将1型胶原蛋白制成0.5-10%浓度的胶原蛋白悬浊液(优选5%浓度)，注入到上述保留有疏松胶原的开放管型的模具内，经1-2毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-80至lj-100摄氏度，经二次冷冻，使其形成符合要求的复合胶原管膜的致密胶原外层将制备得到的疏松胶原内层和致密胶原外层经复合常规冷冻干燥，制成复合胶原管膜；将1型胶原蛋白制成0.5-10%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入常规冷冻干燥仪器内，常规冷冻，制成片状胶原膜。上述冷冻环境优选为液态或气态环境，更优选为液态环境。I型胶原蛋白可以以牛肌腱组织为基料，经选材、取材、酸、碱、酶处理制备得到，也可以以目前已知的任何技术制备得到。优选I型胶原蛋白浓度为0.5%-5%，纯度为98%以上。上述开放管型的模具为本领域的常用器具，可通过商业购得。在本发明的一个方面，提供了一种脊髓管膜在制备脊髓组织修复材料中的用途。在本发明的一个方面，提供了一种脊髓管膜在制备修复再生受损的脊髓中枢神经组织的材料中的用途。在本发明的一个方面，提供了一种脊髓管膜在制备治疗或预防因外伤和肿瘤造成阶段性脊髓损伤或缺损的材料中的用途。在本发明的一个方面，提供了一种脊髓管膜在制备治疗或预防脊髓神经障碍的材料中的用途。在本发明的一个方面，提供了一种脊髓管膜在制备治疗或预防截瘫的材料中的用途。在本发明的一个方面，提供了一种脊髓管膜在制备促进脊髓中枢神经组织再生的材料中的用途。本发明提供一种脊髓管膜，可以促进干细胞在提供的胶原组织上分化生长，转移，千扰非神经元性胶质细胞的增生，减少斑痕的形成，提供良好的脊髓再生环境，再生修复受损的脊髓组织，有效的治疗因外伤和肿瘤造成阶段性脊髓损伤或缺损，治疗不同程度的脊髓神经障碍而形成的截瘫，使病人的症状得到不同程度的改善。图1:(A)复合胶原管膜的横切面。黑色部分代表致密排列不规则小孔隙的胶原外层结构；珠状表示疏松纵向排列且孔隙较大的胶原内层。(B)覆盖在复合胶原管膜外部的胶原膜。图2:从在手术中病人的髂前上棘应用Jamshidi骨髓穿刺针采集20-60毫升的自体骨髓，经离心处理取得骨髓干细胞。图3:将获取的自体骨髓干细胞小心均匀的种植于脊髓管膜的内表面。图4:骨髓干细胞经内置物渗透生长受损的脊髓内，同时促使受损脊髓再生。图5:复合胶原管膜和胶原膜的复合实用示意图。具体实施方式以下结合具体实例，对本发明作进一步说明。实施例l将1型胶原蛋白制成0.5%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入到开放管型的模具内，经l毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-80摄氏度以内，使其形成符合要求的复合胶原管膜的疏松胶原内层；将I型胶原蛋白制成10%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入到上述保留有疏松胶原的开放管型的模具内，经1毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-80摄氏度，经二次冷冻，使其形成符合要求的复合胶原管膜的致密胶原外层将制备得到的疏松胶原内层和致密胶原外层经复合常规冷冻干燥，制成复合胶原管膜；将1型胶原蛋白制成5%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入常规冷冻干燥仪器内，常规冷冻，制成片状胶原膜。实施例2将I型胶原蛋白制成10%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入到开放管型的模具内，经1毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-100摄氏度以内，使其形成符合要求的复合胶原管膜的疏松胶原内层；将I型胶原蛋白制成0.5%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入到上述保留有疏松胶原的开放管型的模具内，经2毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-100摄氏度，经二次冷冻，使其形成符合要求的复合胶原管膜的致密胶原外层将制备得到的疏松胶原内层和致密胶原外层经复合常规冷冻干燥，制成复合胶原管膜；将1型胶原蛋白制成1%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入常规冷冻干燥仪器内，常规冷冻，制成片状胶原膜。实施例3将1型胶原蛋白制成5%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入到开放管型的模具内，经l毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-90摄氏度以内，使其形成符合要求的复合胶原管膜的疏松胶原内层。将I型胶原蛋白制成5%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入到上述保留有疏松胶原的开放管型的模具内，经2毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-90摄氏度以内，经二次冷冻，使其形成符合要求的复合胶原管膜的致密胶原外层。将制备得到的疏松胶原内层和致密胶原外层经复合冷冻干燥，制成复合胶原管膜。将1型胶原蛋白制成0.5%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入常规冷冻干燥仪器内，常规冷冻，制成片状胶原膜。实施例4取2060毫升自体的骨髓，经离心分离将分析出的骨髓前质细胞/骨髓干细胞种植于复合胶原管膜内层；用手术方法将携带干细胞的复合胶原管膜包裹在脊髓损伤部位的表面，复合胶原管膜的包裹范围两侧要超过脊髓中线，再在植入的复合胶原管膜的上面再覆盖一层三维孔隙结构的片状胶原膜。复合胶原管膜内层的干细胞在胶原组织上生长分化成神经原性细胞并转移到收损脊髓部位。其功效可干扰非神经元性的胶质细胞的增生，使神经元细胞得以借助提供的修复通道使其从近端顺利地生长借以达到远端，同时保障硬膜内的脑脊液和其内的生长因子减少流失，得以保留，稳定脊髓生长的内环境，从而促进损伤内新生组织的生长。同时又隔绝了受损脊髓与外界的接触减少外周组织斑痕的形成，从而形成新的脊髓组织。细胞胶原脊髓组织的一期动物实验-复合胶原管膜的单一应用的动物实验自1998年起，在大白鼠的脊髓上进行脊髓缺损后的再生试验。暴露大白鼠(SpragueDawleyorLewisRats)胸椎7，8，9，10的脊髓，然后在其中间部位截取5毫米的脊髓，造成脊髓的完全缺损，然后应用复合胶原管膜对缺损部位进行环状包裹，具体为将复合胶原管膜在残留的脊髓组织上下端完全包裹覆盖受损的脊髓组织上，同时在已置入的复合胶原管膜上再覆盖另一胶原膜，术后对大白鼠进行特殊护理，6-9周后对其进行处死。将胸椎7-10部位的组织取出，进行组织学的检査和分析鉴定。对其内的再生的神经元组织进行定性和定量的分析，其结果表明其类管状的内置物对受损的脊髓可以起到阻碍对脊髓再生不利因素介入的作用。防止外界非神经元性组织的长入，减少巨大囊性变的产生，减少斑痕组织的过渡生成，提供有条理的和神经组织同向生长的修复组织。细胞胶原脊髓组织的二期动物实验-复合胶原管膜内层协以自体骨髓干细胞的"细胞胶原脊髓组织"复合物应用的动物实验，在上述试验的基础上在脊髓缺损部为植入复合胶原管膜，其内协以106数目的自体骨髓干细胞/神经干细胞，将细胞种植后的复合胶原管膜再培养24小时后植入包裹受损脊髓组织部位，并将另一胶原膜覆盖在复合胶原管膜的上方。结果表明其类管状的内置物除具有上述一期动物实验的功能外，自体骨髓干细胞在内环境相对稳定地条件下分化生长，分化后的细胞可转移到脊髓的受损部位，提供有条理的，有功能的神经元组织在脊髓内同向生长，形成新生的脊髓神经组织。本发明提供一种高纯度的单一成分的I型胶原蛋白的脊髓管膜，可以促进干细胞在提供的胶原组织上分化生长，转移，干扰非神经元性胶质细胞的增生，减少斑痕的形成，提供良好的脊髓再生环境，再生修复受损的脊髓组织，有效的治疗因外伤和肿瘤造成阶段性脊髓损伤或缺损，治疗不同程度的脊髓神经障碍而形成的截瘫，使病人的症状得到不同程度的改善。实施例5研究有关医学材料的生物学反应与功效的实验多位体外和体内良种，其不同的动物实验就是直接证实机体对各种生物材料，药物，生物化学介子的反应。而组织病理学的检测更是取得机体对上述物质反应的最直接的方法之一。再应用统计学的方法加以评价。实验动物组取1~5毫升大白鼠自体的骨髓，经离心分离将分析出的骨髓前质细胞/骨髓干细胞种植于复合胶原管膜内层；用手术方法将携带干细胞的复合胶原管膜植入脊髓损伤部位的表面，复合胶原管膜的包裹范围两侧要超过脊髓中线，再在植入的复合胶原管膜的上面再覆盖一层三维孔隙结构的片状胶原膜。对照组按照上述实验方法进行操作，区别在于无内置物。术后6周的动物实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由此可见，实验组相对于对照组具有显著性差异，表明本发明的脊髓管膜对于修复受损的脊髓组织、修复再生受损的脊髓中枢神经组织、治疗或预防因外伤和肿瘤造成阶段性脊髓损伤或缺损、治疗或预防脊髓神经障碍、治疗或预防截瘫以及促进脊髓中枢神经组织再生方面的有效性。权利要求1.一种脊髓管膜，其特征在于它包括复合胶原管膜和胶原膜，其中复合胶原管膜包括致密单一纵向孔隙的胶原外层和疏松单一纵向孔隙的胶原内层，胶原膜是有散状排列孔隙的片状胶原膜。2、如权利要求1所述的脊髓管膜，其特征在于它是由I型胶原蛋白制成。3、如权利要求1或2所述的脊髓管膜，其特征在于所述胶原膜覆盖在复合胶原管膜外部。4、如权利要求1或2所述的脊髓管膜，其特征在于脊髓管膜内径为5-20毫米；其中复合胶原管膜厚度为0.1-5.0毫米，胶原膜壁厚为0.1-3.0毫米。5、如权利要求l所述的脊髓管膜的制备方法，包括如下步骤将1型胶原蛋白制成0.5-10%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入到开放管型的模具内，经1-2毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-80到-100摄氏度以内，使其形成符合要求的复合胶原管膜的疏松胶原内层；将I型胶原蛋白制成0.5-10%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入到上述保留有疏松胶原的开放管型的模具内，经1-2毫米/分的速度慢速垂直冷冻于-80到-100摄氏度，经二次冷冻，使其形成符合要求的复合胶原管膜的致密胶原外层；将制备得到的疏松胶原内层和致密胶原外层经复合常规冷冻干燥，制成复合胶原管膜；将1型胶原蛋白制成0.5-10%浓度的胶原蛋白悬浊液，注入常规冷冻干燥仪器内，常规冷冻，制成片状胶原膜。6、如权利要求l一4任一项所述的脊髓管膜在制备脊髓组织修复材料中的用途。7、如权利要求l一4任一项所述的脊髓管膜在制备修复再生受损的脊髓中枢神经组织的材料中的用途。8、如权利要求l一4任一项所述的脊髓管膜在制备治疗或预防因外伤和肿瘤造成阶段性脊髓损伤或缺损的材料中的用途。9、如权利要求l一4任一项所述的脊髓管膜在制备治疗或预防脊髓神经障碍的材料中的用途。10、如权利要求1一4任一项所述的脊髓管膜在制备治疗或预防截瘫的材料中的用途。11、如权利要求l一4任一项所述的脊髓管膜在制备促进脊髓中枢神经组织再生的材料中的用途。全文摘要本发明公开了一种脊髓管膜、其制备方法及应用，所述脊髓管膜由复合胶原管膜和胶原膜组成，它由I型胶原蛋白制备，可用于保护脊髓受损部位，使受损的脊髓中枢神经组织再生，促进复合胶原管膜内形成新的脊髓组织。文档编号A61L27/56GK101264350SQ200810097809公开日2008年9月17日申请日期2008年5月15日优先权日2008年5月15日发明者许和平申请人:许和平