抑制瘢痕形成的方法

专利名称：抑制瘢痕形成的方法
抑制瘢痕形成的方法本发明涉及提供用于抑制形成于人伤口愈合中瘢痕形成的新方法。本发明也提供 了 TGF-β 3的新用途、选择合适的抑制与伤口愈合有关的瘢痕形成的治疗方案的新方法和 用于抑制与伤口愈合有关的瘢痕形成的试剂盒。转化生长因子β (TGF-β s)为具有多种生物学活性的细胞因子家族。TGF-β家族 包括 TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4 和 TGF- β 5 共 5 种亚型。TGF- β 家族成员以包 含双肽链的二聚体形式天然存在。活性TGF-β 二聚体的分子量大约为25. 4KDa。已表明，TGF-β 3在预防、减少或抑制全身各部位的瘢痕形成中是有用的。这一效 应在TGF-β 3抑制与伤口愈合有关的瘢痕形成能力方面特别有利。人TGF-β 3的氨基酸序 列显示于序列ID No. 1中，且编码TGF-β 3的核酸序列显示于序列ID No. 2中。伤口愈合的瘢痕形成反应在所有的成年哺乳动物中是常见的。瘢痕形成反应在 大多数的组织类型间是保守性的，而且在所有情况下都导致同样的结果，即称为瘢痕”的纤 维化组织的形成。瘢痕可被定义为“在体内任何组织的损伤或病患部位形成的纤维结缔组
幺口，，就伤口愈合产生的瘢痕而言，瘢痕构成了作为修复反应结果所产生的结构。这一 修复过程已经作为预防受伤动物死亡的生物学需要的进化性解决方案出现。为降低由于感 染或出血引起的死亡风险，机体快速反应以修复受损区域，而不是试图使受损组织再生。既 然受损组织没有再生以获得与受伤前存在的结构相同的组织结构，从而可借助瘢痕与未受 伤组织相比的异常形态学来鉴定瘢痕。在宏观上观察时，瘢痕可以是凹陷的、低于周围组织表面，或者是隆起的、高于它 们未受损周围表面。瘢痕着色可比正常组织相对更深(色素沉着过度)或具有与它们周围 组织相比更苍白的颜色(色素沉着不足)。就皮肤瘢痕而言，任一色素沉着过度的或色素沉 着不足的瘢痕都构成了显而易见的外观缺陷。还已知皮肤瘢痕可比未受伤的皮肤更红，这 使得它们显而易见和在外观上无法接受。已经证明瘢痕的外观表现是促成瘢痕对患者心理 影响的主要因素之一，而且这些效应能够在导致瘢痕的伤口已愈合后长期存在。除了它们的心理学影响外，瘢痕还对患者产生有害的身体影响。这些影响通常是 由于瘢痕与正常组织间机械差异导致的。瘢痕的异常结构和组成意味着它们通常比其正常 的组织对应物的柔韧性更差。因此，瘢痕可能是造成正常功能削弱的原因(诸如就覆盖关 节的瘢痕而言，其可限制可能的运动范围)而且如果自幼年时出现可能延缓正常生长。根据上文，可以认识到TGF-β 3在伤口愈合时出现的瘢痕形成的临床治疗方面具 有很大的效用，但是仍需要新的和改进的用于抑制与伤口愈合有关的瘢痕形成的治疗方 法。本发明一些方面的目的是提供抑制形成于伤口愈合的瘢痕形成的改进的方法。本 发明其他方面的目的是提供TGF- β 3的新用途。这些TGF- β 3的新用途可构成对现有技术 中所熟知的用途的替代用途，但是优选地它们可能构成与那些目前已知的用途相比的改进 的用途。本发明某些方面的目的是提供选择合适的用于抑制与伤口愈合有关的瘢痕形成的 治疗方案的新方法。本发明其它方面的目的是提供用于抑制与伤口愈合有关的瘢痕形成的试剂盒。这些试剂盒可用于治疗方法中，其提供了与现有技术中所熟知的那些相比增强的 瘢痕形成的抑制作用。在本发明的第一方面提供了抑制形成于人伤口愈合的瘢痕形成的方法，这一方法 包括治疗瘢痕形成待被抑制的身体部位在第一次治疗中提供给伤口边缘的每一厘米或将要形成伤口部位处的每一厘米 量大约为350-1000ng的TGF-β 3 ；以及在伤口形成后发生且第一次治疗后8-48小时发生的第二次治疗中，向所述伤口 提供量为每厘米瘢痕形成待被抑制的伤口边缘大约为350-1000ng的TGF-β 3。在第二方面，本发明提供了抑制形成于人伤口愈合的瘢痕形成的方法，这一方法 包括治疗瘢痕形成待被抑制的身体部位在第一次治疗中，向将要形成伤口的部位的每一厘米提供量为大约350-1000ng 的TGF-i3 3 ；以及在发生在第一次治疗后8-48小时的第二次治疗中，向所述伤口提供量为每厘米 瘢痕形成待被抑制的伤口边缘大约350-1000ng的TGF-β 3。在第三方面，本发明提供了抑制形成于人伤口愈合的瘢痕形成的方法，这一方法 包括治疗瘢痕形成待被抑制的身体部位在第一次治疗中，向伤口边缘的每一厘米或未来伤口边缘的每一厘米提供量为大 约 350-1000ng 的 TGF- β 3 ；以及在发生在第一次治疗后8-48小时的第二次治疗中，向所述伤口提供量为每厘米 伤口边缘约350-1000ng的TGF-β 3，在所述伤口边缘瘢痕形成待被抑制。在本发明的各个方面和实施方案中，根据提供到所述部位每一厘米(例如，被创 伤部位的每一厘米或伤口边缘或未来伤口边缘的每一厘米)的量，本发明公开内容确定了 提供给身体部位的TGF-β 3的量。应了解，虽然这些段落确定了待提供给这些部位TGF-β 3 的量，它们并没有限制这一量的提供方式。尤其不应该认为这些段落要求TGF- β 3给药到 待治疗部位的每一厘米(尽管这可以是优选的实施方案)。必需的TGF-i3 3可以通过存在 的多种给药方式提供给任一部位，从而允许特定量的TGF-β 3被提供到瘢痕形成待被抑制 的部位。本发明基于发明人的发现能够通过利用两部分治疗方案而出乎意料地有效抑 制瘢痕形成(其否则会在人类患者伤口愈合时出现)，其中对将减少瘢痕形成的部位在伤 口或伤口闭合周围一次用350-1000ng TGF-β 3治疗，然后8_48小时后再次使用同样量的 TGF-β 3治疗。这些在本发明公开中首次描述的治疗方案使瘢痕与那些利用已知的治疗方 法获得的那些瘢痕相比大大地减小。不希望受任何假说约束，发明人相信伤口或将要形成伤口部位处的细胞暴露于在 第一次治疗中所提供的TGF-β 3能够降低瘢痕形成反应(尽管，如下文所述，如果在单个 的发生治疗中提供的话，本发明中所考虑的剂量并不具有最强的抗瘢痕形成效应)而且在 第二次治疗中提供的TGF-β 3可用来对抗否则其会在伤口部位出现的促瘢痕形成“级联反 应”的生物学活性。这在抑制瘢痕形成方面具有令人惊讶的有益效果，其显著强于利用目前 所考虑的其它TGF-β 3治疗方案可能实现的效果。应了解尽管本发明公开内容中提到的每一次治疗中所提供的量是基于每一厘米所提供的量，但本发明公开内容并不限制于此，而且可用来确定合适的剂量，其可应用于以 任一合适的单位所衡量的伤口。基于本发明的发现非常令人惊讶，因为不但所获得的抗瘢痕形成结果特别有效， 而且现有技术使得本领域技术人员相信利用两个相对高剂量的TGF-β 3的这一治疗方案 将不会像利用已知的更小剂量的方案一样有益。本领域技术人员先前已了解TGF-β 3抗瘢痕形成反应表现为“钟形”剂量反应曲 线，如

图1和2中所示的类型。这一曲线的顶端或底端剂量不像位于剂量反应中间的那些 剂量一样有效，衍生于伤口愈合动物模型的数据表明高剂量的TGF-β 3甚至可能增加胶原 蛋白的产生，其在某种程度上被预期为会加重瘢痕形成。基于这些发现，优选的给药于患者 瘢痕形成待被抑制部位每一厘米的TGF-β 3的治疗有效量已鉴定为大约200ng。更低剂量 (IOOng左右)或更高剂量(诸如500ng)不会产生如200ng所产生的有效减少瘢痕形成。 本发明人的研究以及本领域中其他人的工作已经确定，当受伤之前或伤口形成后对伤口边 缘给药时，200ng剂量的TGF-β 3会有效抑制人患者的瘢痕形成。一旦TGF-β 3的抗瘢痕形成有效性研究已经鉴定出最佳使用剂量为200ng，进一 步的研究考虑能否通过重复将这一剂量给予到疤痕形成待被减少的部位带来任何优势。这 些结果显示重复给予伤口 200ngTGF-i3 3在观察到的抗瘢痕形成效应方面没有提供任何益 处。鉴于已经发现，单次更大剂量的TGF-β 3，诸如500ng，在实现减少瘢痕方面不如 更小剂量有效，以及包含这些优选低剂量多次给药的治疗方案已经显示，不会提供任何优 于单一治疗的治疗优势，，已引导本领域技术人员相信本发明第一、第二和第三方面所描述 的方案类型没有任何显著的抑制瘢痕形成的效用。这些发现意味着本领域技术人员没有动 机去考虑本文所描述的治疗类型，其中在重复的治疗中对同一部位提供相对高的剂量，实 际上技术人员会考虑到这种治疗很可能比在现有技术中已知的那些治疗更加昂贵和复杂， 并且有效性低。因此可以看出本文所提供的发现对可以用于临床上抑制伤口疤痕形成的治 疗范围提供了 一种出人意料但有价值的补充。以前人类研究或非人类动物中进行的实验性研究都没有提示通过本发明的药物 或方法、利用重复的高剂量TGF-β 3提供令人惊讶的优势。实际上以前的人类或动物研究 的报告中没有甚至暗示本发明所提供的有益效果的内容。可以利用本发明的方法和药物而实现的有益效果的认识也引起了本发明的许多 其它方面，这也在本文中进行了阐述。因为本文所公开的治疗方法需要至少两次治疗，其发生彼此间隔至少8-48小时， 从而它们不适用于那些不能够完成第二次或更进一步的治疗的患者。这一观察结果产生了 本发明的其它方面，其中提供了一种选择合适的治疗方案以抑制与伤口愈合有关的瘢痕形 成的方法，这一方法包括确定需要这种瘢痕形成抑制的个体是否能够完成发生在第一次治疗后8-48小时 的第二次治疗；以及如果个体能够完成发生在第一次治疗后8-48小时的第二次治疗，选择一种治疗 方案，其包含与任一本发明的前三方面一致的一种治疗方法，或者如果个体不能够完成发生在第一次治疗后8-48小时的第二次治疗，选择一种治疗方案，其包含在单次治疗中向待抑制瘢痕形成的伤口边缘每一厘米或将要形成伤口部位的每 一厘米提供量大约为150-349ng TGF-β 3 在该单次治疗中每一厘米所提供的TGF-β 3的 量优选为大约200ng。在本发明的其它方面，提供了 TGF-β 3用作治疗伤口或将要形成伤口的部位的 药物以抑制疤痕形成的用途，其中在第一次治疗中所提供的药物使得大约350-1000ng的 TGF-β 3被提供给伤口边缘的每一厘米或将要形成伤口的部位的每一厘米，以及其中在随 后的治疗中所提供的药物使得在前一次治疗后8-48小时大约350-1000ng的TGF-β 3被提 供给伤口边缘的每一厘米。本发明的这一方面的药物可以为可复水的药物，诸如冻干的可注射的组合物。此外，本发明人已经发现了用于实现本发明方法的手段，包括按照本发明生产的 药物，可以试剂盒的形式被有效提供用于抑制与伤口愈合有关的瘢痕形成，这一试剂盒包 含至少第一和第二小瓶，其包含用于在彼此间隔8-48小时的时间对伤口或要形成伤口的 部位给药的TGF-β 3。本发明的另一方面提供了用于抑制与伤口愈合有关的瘢痕形成的试剂盒，这一试 剂盒包含第一量的含有TGF-β 3的组合物，该第一量在第一次治疗中对伤口或将要形成伤 口的部位给药；第二量的含有TGF-β 3的组合物，该第二量在第二次治疗中对伤口给药；关于第一量和第二量的组合物在彼此间隔8-48小时的时间给药的说明书；其中配制的组合物提供给其给药组织或器官的每厘米大约350-1000ng的 TGF- β 3 的量。可优选组合物包含浓度大约为500ng/100 μ 1的TGF- β 3。用于这一试剂盒中其他 浓度包括约350ng/100y 1至约lOOOng/lOOy 1范围内任一浓度。这一试剂盒中所提供的组合物可以以适合于使用前复水的形式(诸如冻干的可 注射组合物)来提供。在本发明的另一实施方案中，通过用于脉冲式递送TGF-β 3到伤口或将要形成 伤口部位的皮下植入或储存药物系统提供TGF-β 3以抑制瘢痕形成，其中在第一次治疗 中所提供的药物使得提供给伤口边缘的每一厘米或将要形成伤口部位的每一厘米大约 350-1000ng的TGF-β 3，并且其中在随后的治疗中所提供的药物使得在前一次治疗后8_48 小时提供给伤口边缘的每一厘米大约350-1000ng的TGF-β 3。按照本发明的这一方面，药物可以配制在例如整体侵蚀系统(bulk-eroding system)中，诸如包含TGF-β 3的基于聚乳酸和乙醇酸共聚物(PLGA)的微球或微囊剂系统， 或者PLGA 乙基纤维素混合物系统也可以使用。按照本发明的这一方面，其它药物可以配 制在表面侵蚀系统中，其中TGF-β 3包埋在易蚀基质中，诸如其中聚合物的水解是快速的 聚(邻)酯的和聚酐基质。按照本发明的这一方面，药物也可以通过如上文所述的脉冲传 递系统与诸如如上文所述的冻干的可注射组合物的即刻释放系统的组合来配制。应了解虽 然在每一次治疗中TGF-β 3可通过同一途径和同一形式给药，但是不同次的治疗可通过不 同的药物和/或不同的给药途径来提供TGF- β 3。在本发明的优选实施方案中，初次治疗可借助诸如皮内注射的注射方式来提供TGF-β 3，而第二次(和任何随后的)治疗可通过诸如 局部制剂的替代途径来提供TGF-β 3。通常本发明的药物和方法中使用的TGF-β 3优选的是野生型同型二聚体 TGF-β 3，其包含两个二聚体，而每一个又包含序列ID No. 1中所示的氨基酸残基序列。利 用这种形式的TGF-β 3产生了本说明书别处报道的实验性研究结果。本发明人相信本发明衍生出的优势可以适用于全身各部位的伤口。然而，优选的 是，将要抑制与其有关的瘢痕形成的伤口为皮肤伤口。出于示例性目的，本发明的实施方案 一般结合皮肤伤口进行描述，尽管它们还适用于其它的组织和器官。仅为举例，另一个优选 的实施方案中伤口可能为循环系统的伤口，特别是血管的伤口(在这种情况下治疗可以抑 制再狭窄)。根据本发明，其它其中可以抑制瘢痕形成的伤口在说明书别处中被考虑到。伤 口可以为外科手术(诸如选择性外科手术)的结果，而且这构成了本发明的优选实施方案。本发明的方法可以任选地包含第三次或更进一步的治疗。如有必要，这样更进一 步的治疗可以继续直到负责照管患者的临床医师确定已实现期望的抑制瘢痕形成为止。每 一次治疗都应该在前一次的治疗后8-48小时发生。更多的关于第三次或更进一步治疗的 时机的指导可自本文所公开的有关第一和第二次治疗的相对时机中获取。第一次治疗优选的是发生在创伤之前，在这种情况下可将TGF-β 3提供到将要形 成伤口的部位，如果TGF-β 3是通过局部注射到皮肤的方式提供的(诸如皮内注射)，这可 能会产生水泡，其是由于包含TGF-β 3的溶液注射到皮肤所致。在一优选实施方案中，这一 水泡可能发生在将要形成伤口的部位，而且实际上伤口可能通过切割水泡而形成。在这种 情况下，根据待形成伤口的部位的长度来确定第一次治疗中所提供的TGF-β 3的量。可选择地，两个水泡可以出现在将要形成伤口的部位的每侧。这些水泡优选地定 位于将要形成伤口边缘0.5厘米以内。在这种情况下，根据以未来伤口边缘的厘米数测量 的要形成的伤口长度(在下文中定义)来确定第一次治疗中所提供的TGF-β 3的量。优选地，用于将TGF-β 3提供到创伤前的部位的水泡可以基本上覆盖了将要形成 伤口的部位的全长。更优选地，水泡可以延伸超过了将要形成伤口部位的长度。适宜地，这 样的水泡可以延伸超过将要形成的伤口的末端约0. 5厘米(或更多)。按照本发明的这些实施方案，皮内注射可借助于基本上与将要形成的伤口中线 平行或与将要形成的伤口边缘平行的插入的皮下注射针进行给药。注射部位可以沿着 TGF-β 3将被提供给的区域的长度，彼此间隔大约1厘米。或者，优选地第一次治疗涉及将TGF-β 3提供到现有伤口。本发明人认为无论细 胞在创伤之前还是伤伤之后暴露于TGF-β 3，抗瘢痕形成活性相关的生物学机制是一样的。 在任一情况下，只要在受伤之前或受伤之后使待被抑制瘢痕形成部位的细胞暴露于大约 350-1000ng治疗有效量的TGF-β 3都可以达到所必需的生物学活性。在本发明将TGF-β 3提供到现有伤口的实施方案中，根据以伤口边缘的厘米数测 量(如下文所讨论的)的伤口的长度来确定需要的量。TGF-β 3应该优选沿着每一伤口边 缘的全长来提供，甚至超过受创伤的区域来提供。在一优选的实施方案中，可以沿着超过伤 口边缘末端延伸大约0. 5厘米(或更多)的长度提供TGF-β 3。皮内注射也代表了可以将TGF-β 3提供到现有伤口的优选途径。根据这一实施方 案，提供的皮内注射应给药于每一伤口边缘。注射部位可以优选在伤口边缘的半厘米内。注射可借助于插入的基本上平行于伤口边缘的皮下注射针来给药。注射部位可沿着治疗区域 的长度，彼此间隔大约1厘米。在上述段落中所阐明的与在第一次治疗中将TGF-β 3提供到伤口有关的注意事 项也适用于其在第二次(或更进一步的)治疗中的提供。因为第二次治疗发生在创伤已经 发生后，因此其总是涉及将TGF-β 3提供到现有伤口。伤口可以是开放的或闭合的，这取决 于将要应用的伤口处理策略。当第一次治疗涉及提供TGF-β 3到将要形成伤口部位时，优选这一提供发生在创 伤开始前1小时或更短的时间，优选创伤开始前半小时或更短的时间，还更优选地创伤开 始前15分钟或更短的时间，而且最优选地创伤开始前10分钟或更短的时间。如果第一次治疗涉及将TGF-β 3提供到现有伤口，提供这一治疗的时间可以根据 伤口已经形成后经过的时间进行选择。在这种情况下，优选按照本发明的第一次治疗在创 伤2小时之内开始，优选创伤1. 5小时之内、更优选创伤1小时之内、还更优选创伤半小时 之内、而且最优选创伤15分钟之内开始。可选择地或另外地，第一次治疗的时机可根据待治疗的伤口闭合后所经过的时间 来进行选择。在这种情况下，优选按照本发明的第一次治疗在伤口闭合完成的2小时之内 开始，优选伤口闭合完成的1. 5小时之内、更优选伤口闭合完成的1小时之内、还更优选伤 口闭合完成的半小时之内、而且最优选伤口闭合完成的15分钟之内开始。在由于临床原因 (例如如果有必要维持伤口内部位的通路)伤口没有完全闭合的情况下，一旦伤口闭合到 会作为所采取的过程的部分而闭合的最大程度，仍然可以认为伤口闭合是完全的。应了解，根据伤口闭合后所经过的时间进行第一次治疗时机的选择与长时间外科 操作的情况尤其相关，在这种情况下，伤口必须保持长时间地开放以允许接近外科手术的 操作部位。治疗之间所经过的时间为8-48小时。更优选所经过的时间应该为至少、更优选至 少10小时、甚至更优选至少12小时、仍更优选至少14小时、还更优选至少16小时、仍更优 选仍为至少18小时、更优选仍为至少20小时、甚至更优选至少22小时、以及最优选大约为 24小时。治疗之间所经过的时间可长达48小时，但是优选长达约44小时，更优选长达约40 小时，甚至更优选长达约36小时，仍更优选长达约32小时，还更优选长达约28小时，以及 最优选为约24小时。提供给待治疗区域(即将要形成伤口的部位，未来的伤口边缘或现有伤口的周 边)每一厘米的TGF- β 3的量为约350至约lOOOng。提供的量可以优选为大约350ng、400ng 或450ng。提供的量可以优选为多于350ng、更优选多于400ng、甚至更优选可以多于450ng。 提供的量可以优选为大约1000ng、900ng、800ng、700ng或600ng。提供的量可以优选为少于 IOOOng,更优选少于900ng，还更优选少于800ng，甚至更优选少于700ng而且还更优选少于 600ng。提供的量的上限和下限可自上述句子中所列举的那些中独立地进行选择。最优选 地提供的TGF-β 3量为大约500ng。无论提供的TGF-β 3量是多少，优选在每一次治疗中对待被抑制瘢痕形成的机体 部位的每一厘米所提供的量基本上是相同的。特别是，优选在每一次治疗中对待被抑制瘢 痕形成的机体部位的每一厘米提供量为大约500ng的TGF-β 3。
在本发明方法的实践中，待被抑制瘢痕形成的区域的细胞应该“沐浴”在包含大约 350-1000ng TGF-β 3的药学上可接受的溶液中。这可以创造一个局部环境，其中细胞暴露 于充足的TGF-β 3以预防瘢痕形成。可用于实现这一目的的治疗有效量的TGF-β 3的详细 内容已在本发明的第一、第二和第三方面中被确定。那些否则会参与瘢痕形成的细胞接受治疗有效量的TGF-β 3，无论TGF-β 3是通 过注射到伤口边缘(或沿着未来伤口的周边-图11的图面B中所显示的技术)还是通过 直接注射到将要形成伤口的部位(例如，通过形成覆盖受创伤部位的水泡-图11的图面A 中所显示的技术)来给药。这些给药途径的任一种都能够确立TGF-β 3在细胞周围区域中 的抗瘢痕形成浓度。然而，应了解，必须提供给机体部位以实现细胞所必需的局部环境的 TGF-β 3的总量根据使用的给药途径而不同。当第一次治疗使用直接到达受创伤部位的注射时，通过沿着未来伤口的线路并覆 盖受创伤区域给予的单次注射(或连续“单次”注射)的给药(图11的图面A中所示的技 术)来确立细胞周围TGF-i3 3的必需量。当第一次治疗利用达伤口每一边缘的“成对的”注 射(或沿着每一未来伤口边缘注射-图11的图面B中所示的技术)时，应了解所要提供的 TGF-β 3总量要比经由单次注射途径所提供的(上文所述的)TGF-β 3量大，因为需要对每 一边缘进行注射以治疗同一区域。然而，尽管提供的TGF-β 3总量有差别，但对靶细胞生物 学效应，以及由此的治疗效应在这两种给药途径间没有差别。优选的是，在本发明方法中TGF-β 3借助于合适的药物组合物给药被提供给必需 的身体部位。通常，可以使用任一药学上可接受的溶液，但是本发明人发现用于本发明的组 合物可以有利地包含诸如麦芽糖或海藻糖的糖类。这些糖类可用于稳定组合物，也可以增 加如此组成的TGF-β 3的生物学活性。优选的组合物可以是适用于注射尤其适用于皮内注 射的那些。许多可以用于TGF-β 3通过皮内注射给药的组合物的制剂为本领域中技术人员 熟知。发明人共同待决的公布号为WO 2007/007095的专利申请中描述了合适制剂的实例， 并在这一申请中描述的这类制剂被用于本说明书的实验研究结果部分中所报道的研究中。为避免疑义，现将对本发明公开内容中所使用的各种术语进行进一步的描述。应 了解，为了简便起见，对这些术语中的一些可能只根据本发明某些方面进行描述。然而，除 了上下文另有要求，这些术语的下列描述都适用于本发明的所有方面。TGF- β 3含量、效价和给药量的计算包含TGF-β 3(特别是重组的人TGF-β 3，其为用于本发明的TGF-β 3的优选 形式)溶液的蛋白含量可以优选通过定量酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定，所述测定 利用英国国立生物标准与控制研究所(the United Kingdom National Institute for Biological Standards andControl, NIBSC)转化生长因子 β3(人 rDNA 衍生的)参考试 剂代码98/608进行校准。通过这种方式进行的蛋白含量的确定允许技术人员计算出溶液 浓度并因此计算出通过特定体积溶液向身体部位的每一厘米提供的TGF-β 3的量。这一实 验设计已被用于确定实验结果部分使用的溶液的蛋白含量。如果技术人员不能获取NIBSC参考试剂代码98/608的参考样品，发明人已发现利 用他们自己拥有的 TGF-β 3 产物(Lonza Bulk DrugSubstance Lot 205-0505-005)作为标 准品的ELISA产生的值大约为利用NIBSC参考试剂代码98/608所获得的值的52%。如果 希望使用这一替代标准品代替NIBSC参考试剂代码98/608，应该由此确定TGF-β 3的必需
11量。按照本发明，使用的TGF-β 3的生物学活性(例如效价)可以通过抑制貂肺上皮 细胞系(MLEC)(美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)目录号为CCL-64)来确定。在一优 选实施方案中，生物学活性可通过利用上文提及的英国国立生物标准与控制研究所参考试 剂代码98/608进行校准的测定进行定量。参考试剂代码98/608被认为每微克TGF- β 3蛋 白具有10000任意单位(AU)的特异生物学活性，而且通过比较感兴趣样品和参考试剂代码 98/608的MLEC抑制活性，以AU表示的感兴趣样品的生物学活性能够容易地确定。因此500ng剂量的TGF-β 3提供5000AU的TGF-β 3活性。发明人相信量为大约 3500-6500AU的TGF-β 3活性可以实现类似的治疗效应。可以由此分析出本发明公开中所 使用的500ng TGF-β 3的参照。要形成伤口的部位的厘米数为便于参照，要形成伤口部位的长度可以以厘米数来测量以便确定为减少本发明 所述的瘢痕形成而需要提供的TGF-β 3的量。优选的是，计算的待治疗的长度超出欲形成 伤口的预期长度，以确保治疗有效量的TGF-β 3被提供到伤口末端。因此优选计算出的将 要形成伤口的部位的长度(从而即待治疗部位的长度)延伸超过预期伤口每一末端大约 0.5厘米的距离。未来伤口边缘的厘米数出于本发明公开的目的，如以未来伤口边缘的厘米数测量的将要形成伤口部位的 长度应该计算为将要形成的伤口的每一边缘的长度总和(以厘米为单位)。优选计算出待 治疗的长度延伸超过要形成伤口的边缘的末端，这可以帮助确保治疗有效量的TGF-β 3被 提供到伤口末端。因此优选计算出的未来伤口边缘的长度(以及由此待治疗部位的长度) 在要形成的伤口的每一末端延伸大约0.5厘米(或更多)的距离。伤口边缘的厘米数出于本发明公开的目的，如以伤口边缘的厘米数测量的伤口长度应该计算为伤口 每一边缘长度的总和(以厘米为单位)。优选计算出的待治疗部位的长度延伸超过伤口边 缘的末端。这可以有助于确保治疗有效量的TGF-β 3被提供到伤口末端。因此优选本发明 中计算出的待治疗伤口边缘长度延伸超过伤口每一末端大约0. 5厘米(或更多)的距离。TGF-β 3出于本发明公开的目的，TGF-β 3可被视为包含含有如序列ID No. 1所示的氨基 酸序列的肽。TGF-β 3可以优选为二聚体的TGF-β 3，但是发明人相信也可以利用单体形式 的TGF-β 3来实现本文所描述的瘢痕形成的抑制作用。发明人相信也可以利用TGF-β 3的治疗有效片段或衍生物来实现本发明公开内 容所描述的瘢痕形成抑制作用。可根据序列ID No. 1中所提供的序列信息容易地确定 TGF-β 3片段，而且可利用本领域中技术人员所熟知的方法制备基于这一序列信息的衍生 物。发明人共同待决的公布号为WO 2007/104845的申请中公开了合适的衍生物的例子。可结合大量合适的实验模型的任一个容易地评估所述TGF-β 3片段或衍生物的 治疗有效性。这样的模型可包括指示生物学有效性(期望其与治疗有效性相关)的体外模 型或利用人类或非人类个体的体内研究。仅为了举例，为研究TGF-β 3片段或衍生物的治 疗有效性，可以使用或应用在说明书中别处所阐明的实验结果部分所描述的技术。
如果期望使用除了野生型二聚活性片段(其包含两个与序列IDNo. 1对应的肽链) 以外的TGF-β 3形式，应了解这类因子的分子量可能与天然存在形式的那些不同。因此，用 于本发明的药物或方法的这类因子的治疗有效量可能不同，以反映出分子量的差异。从而， 如果使用分子量为野生型二聚活性片段分子量一半的TGF-β 3形式，那么合适的治疗有效 量将为说明书在别处所阐明的那些的一半。预防/抑制/减少/最小化瘢痕形成应该理解，本发明上下文中瘢痕形成的抑制作用包括与对照治疗或未治疗伤口愈 合时发生的瘢痕形成水平比较，根据本发明方法(或本发明的试剂盒或药物)治疗的伤口 愈合时所实现的瘢痕形成的任何程度的预防、减少、最小化或抑制。为了简便起见，本说明 书主要涉及利用TGF-β 3 “抑制”瘢痕形成，然而，除了上下文另有要求外，应该认为这些涉 及处也包括利用TGF-β 3预防、减少、最小化瘢痕形成。药学上可接受的如本文所使用的，短语“药学上可接受的”指的是“通常认为是安全的”分子实体 和组合物，例如，其为生理学上耐受的、而且当给药于人体时，通常不会产生过敏性或诸如 胃部不适、眩晕等类似的不利反应。优选地，如本文所使用的，术语“药学上可接受的”表示 美国联邦或国会的监管机构批准的或美国药典或其它公认的用于动物和更特别用于人的 药典中所列举的。药物组合物和给药方法当可能使用本发明所提供的组合物用于现状治疗时，优选以药物制剂的形式将其 进行给药，例如以与结合预期给药途径和标准药学实践而选择的合适的药物赋形剂、稀释 剂或载体的混合物的形式。因此，在一方面，本发明提供了药物组合物或制剂，其包含至少 一种活性组分或其药学可接受的衍生物与药学可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体结合。 赋形剂、稀释剂和/或载体必须在如下意义上是“可接受的”与其它制剂成分相兼容并且对 其受者无害。本发明的组合物能够配制成以任一便利方式给药以用于人类或兽医医学。因此本 发明在其范围内包括包含适合用于人类或兽医医学的本发明产物的药物组合物。可接受的用于治疗用途的赋形剂、稀释剂和载体在药学领域中是被熟知的，而 且在例如 Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿药学禾斗学与实 践)· Lippincott Williams & Wilkins (A. R. Gennaro edit. 2005)中被描述。能够结合预 期给药途径和标准药学实践来进行药物赋形剂、稀释剂和载体的选择。伤 口发明人相信利用本发明的TGF-β 3的治疗的方法可以用于有益地抑制各种类型 伤口的瘢痕形成。其中利用本发明的药物和方法可以抑制瘢痕形成的具体伤口的例子包括，但不局 限于，独立选自下述的那些皮肤伤口，眼部伤口(包括抑制诸如LASIK外科手术、LASEK外 科手术、PRK外科手术、青光眼滤过外科手术、白内障外科手术或容易造成晶状体囊瘢痕形 成的外科手术的眼部外科手术导致的瘢痕形成)诸如产生角膜瘢痕化的那些，容易造成囊 性收缩的伤口(其常见于乳房植入物周围)，血管伤口，中枢和外周神经系统伤口(预防、减 少或抑制这一部位的瘢痕形成可增强神经元重接和/或神经元功能)，肌腱、韧带或肌肉伤口，包括嘴唇和上颚的口腔伤口(例如抑制唇裂或腭裂治疗导致的瘢痕形成)，诸如肝脏、 心脏、脑、消化组织和生殖组织的内脏器官伤口，诸如腹腔、骨盆腔和胸腔的体腔伤口(抑 制这一部位的瘢痕形成可以减少粘连形成发生的数目和/或形成粘连的大小)和外科手术 伤口(尤其是与诸如瘢痕修复的美容操作有关的伤口)。特别优选地，本发明的药物和伤口 用于预防、减少或抑制与皮肤伤口有关的瘢痕形成。瘢痕形成的评估瘢痕形成的程度和所实现的瘢痕形成的任何抑制可以通过对瘢痕的临床宏观性 评估进行评估。这可以通过对个体瘢痕的直接评估、或者通过瘢痕的摄影图像、或取自瘢痕 的硅模具或由这些模具制成的全压式石膏模型的评估来实现。出于本发明公开的目的，应 该认为“被治疗的瘢痕”包含本发明治疗的伤口愈合时所产生的瘢痕。当评估瘢痕形成时可以考虑的瘢痕的宏观特征包括i)瘢痕的颜色。与周围皮肤相比，瘢痕通常是低色素或色素沉着过度的。当被治 疗的瘢痕的色素沉着比未治疗的瘢痕的色素沉着更近似接近无瘢痕皮肤的色素沉着时，可 以证明抑制了瘢痕形成。瘢痕经常可比周围皮肤更红。在这种情况下，当被治疗的瘢痕的 红色与未治疗的瘢痕相比消退地更早或更完全或更近似周围皮肤的外观时，可以证明抑制 了瘢痕形成。ii)瘢痕的高度。与周围皮肤相比，瘢痕通常是隆起的或凹陷的。当被治疗的瘢痕 的高度比未治疗瘢痕的高度更接近无瘢痕皮肤的高度(例如，既没有隆起又没有凹陷)时， 可以证明抑制了瘢痕形成。能够直接在患者身上(例如借助于轮廓测定法)或间接地(例 如通过对取自瘢痕的模具的轮廓测定法)测量瘢痕高度。iii)瘢痕的表面质地。瘢痕表面比周围皮肤相对更光滑(产生有“光泽”外观的 瘢痕)或比周围皮肤更粗糙。当被治疗的瘢痕的表面质地比未治疗的瘢痕的表面质地更接 近无瘢痕皮肤的表面质地时，可以证明抑制了瘢痕形成。也可以直接在患者身上(例如借 助于轮廓测定法)或间接地(例如通过对取自瘢痕的模具的轮廓测定法)测量表面质地。iv)瘢痕的硬度。瘢痕的异常组成和结构意味着它们通常比瘢痕周围未受损的皮 肤更硬。在这种情况下，当被治疗的瘢痕的硬度比未治疗的瘢痕的硬度更近似接近无瘢痕 皮肤的硬度时，可以证明抑制了瘢痕形成。优选地，被治疗的瘢痕显示了瘢痕形成的抑制，如根据本说明书中所阐述的用于 宏观评估的至少一个参数所评估的。更优选地，被治疗的瘢痕根据这些参数的至少两个、更 优选地这些参数的至少三个、最优选地这些参数的至少四个(例如，上文列出的所有四个 参数)可以显示抑制的瘢痕形成。瘢痕的高度、长度、宽度、表面积、凹陷和隆起体积、粗糙/光滑度能够直接在个体 身上测量，例如通过利用光学3D测量装置。瘢痕测量能够直接在个体身上或在代表瘢痕的 模具或模型上(这可以通过制造瘢痕压迹的硅模具复制品及随后从硅模具产生石膏模型 来形成)进行。所有这些方法都能够通过利用光学3D测量装置或通过瘢痕照片的图像分 析进行分析。3D光学测量沿所有轴的分辨率都在微米范围内，这保证了所有皮肤和瘢痕参 数的精确测定。技术人员也注意到另外的能够用于研究合适参数的非侵入性办法和装置， 其包括用于手动测量的卡尺、超声波、3D摄影(例如利用自Canfield Scientific, Lie得 到的硬件和/或软件)和高分辨率磁共振成像。
通过与未治疗的瘢痕相比，被治疗的瘢痕在其高度、长度、宽度、表面积、凹陷或隆 起体积、粗糙和光滑度的减少或其任意组合，可以证明抑制了瘢痕形成。用于宏观评估瘢痕的一个优选的方法是整体评估。这可以通过由专家组或非专业 小组(lay panel)对宏观照片进行评估或者临床上通过临床医师或患者自己的宏观评估来 实现。借助于VAS (视觉模拟评分)或分类量表的方式来记录评估。下文描述了合适的评估 瘢痕形成(和从而所获得的任何瘢痕形成的减少)的参数的例子。Duncan et al. (2006)， Beausang et al. (1998)和van Zuijlen et al. (2002)描述了其它合适的参数的实例和记 录这些参数评估的方式。利用视觉模拟评分(VAS)瘢痕得分的评估利用基于瘢痕形成的VAS可以记录瘢痕评估。合适的用于瘢痕评估中的VAS可基 于Duncan et al. (2006)或Beausang et al. (1998)所描述的方法。它通常是IOcm的线， 其中Ocm被认为是难以觉察的瘢痕而IOcm为非常不良的肥大性瘢痕。VAS以这种方式使用 使得瘢痕形成评估的记录和量化变得容易。VAS评分可用于瘢痕形成的宏观和/或微观评 估。仅为了举例，合适的瘢痕形成的宏观评估可利用由自左到右表示0(对应正常皮 肤)到10(预示为不良瘢痕)等级的O-IOcm线组成的VAS进行。基于瘢痕总体评估，评估 者可在IOcm线上做标记。这可以将诸如瘢痕的高度、宽度、轮廓和颜色的参数考虑在内。 最好的瘢痕(通常宽度小，其颜色、高度和轮廓如同正常皮肤)可在朝着比例尺“正常皮肤” 端处记下(VAS线的左侧)，而不良瘢痕(通常宽度大，隆起的侧面和不规则轮廓及苍白的颜 色)可以在朝着比例尺的“不良瘢痕”端处记下(VAS线的右侧)。然后这些标记可自左侧 测量以为瘢痕评估提供以厘米为单位的最终值(到一位小数)。瘢痕形成的替代评估(无论是宏观评估还是微观评估)包括比较两个瘢痕或两个 瘢痕片段(诸如一个治疗的片段和另一个未治疗的或对照治疗的片段)以确定哪一个具有 更优选的外观，这种替代评估可以利用包含被垂直线分割的两个IOOmmVAS线的VAS进行。 在这种类型的VAS中，这两个VAS线对应于比较的两个瘢痕，而垂直线表示0(提示比较的 瘢痕间没有可察觉的差异)。100%极端值(在每一 VAS线末端的100mm)提示一个瘢痕已 变得与周围皮肤相比是不可察觉的。以这种方式评估瘢痕宏观外观的特别优选方法称为全球瘢痕比较量表(The Global Scar Comparison Scale (GSCS))。这一量表已被欧洲药品管理局(EMEA)积极采纳， 并且被公认为是可以评估疤痕并确定与疤痕形成抑制有关的临床相关指标的优选量表。特 别是，可以优选使用基于临床专家组评估的GSCS版本，这被EMEA视为是特别相关的。当利用诸如GSCS这一类型的VAS比较成对瘢痕时，评估者首先要确定哪个瘢痕具 有优选的外观或是否这两者间没有可察觉到的差异。如果没有可察觉到的差异，通过在0 垂直线处做一标记来记录。如果存在可察觉的差异，评估者利用这两个瘢痕中更差的一个 作为锚定来确定在优选瘢痕中发现的改善水平，然后在量表的相关部分记上分数(即根据 瘢痕外观的比较设定一个等级)。标记的点表示相比锚定瘢痕改善的百分比。发明人已经发现在评估瘢痕宏观或微观外观中使用的这一类型的VAS测量提供 了很多优势。因为这些VAS实质上是直觉的，它们1)利用不同皮肤类型中严重程度不同 的瘢痕参照图像降低了大规模培训的需求，这使得这一工具在大的3期试验中使用相对简
15便；2)减少了数据的差异性与药物和安慰剂疤痕两次独立的评估不同，对每一瘢痕对进 行一次评估；3)并入了 VAS已确立的原则(即数据的连续性分布)与在同一量表分级的优 势；和4)使临床医师和患者就药物效应(改善百分比)的交流更加简单。现将根据所附的实验结果部分和附图对本发明进行进一步的描述，其中图1比较在单次治疗中提供到人伤口的不同剂量的TGF_i33的抗瘢痕形成的活 性。图2比较在彼此相隔大约1小时内给药的两次治疗中，提供到人伤口的不同剂量 TGF-β 3的抗瘢痕形成的活性。图3比较在彼此相隔大约24小时给药的两次治疗中，提供到人伤口的不同剂量 TGF-β 3的抗瘢痕形成的活性。两次500ng剂量的TGF-β 3治疗与本发明一致而且能够看 到其减少瘢痕形成显著强于其它研究的治疗方案。图4比较TGF-β 3治疗的瘢痕或安慰剂治疗对照瘢痕的宏观图像。在相隔大约24 小时的治疗中不同量的TGF-β 3被提供到这三个TGF-β 3治疗的瘢痕。图5示例TGF-β 3或安慰剂治疗的伤口愈合时所形成的瘢痕的三维模拟或瘢痕测量。图6示例TGF-β 3或安慰剂治疗的伤口愈合时所形成的瘢痕的三维模拟或瘢痕测量。图7示例用TGF-β 3(与本发明一致)或安慰剂治疗的伤口愈合时所形成的瘢痕 的三维模拟或瘢痕测量。图8比较用TGF-β 3的四种实验性方案(在相隔大约1小时的两次治疗中的每次 给药每厘米5ng、50ng、200ng或500ng的量)的一种治疗的伤口愈合时所形成的瘢痕随时 间变化所实现的抑制瘢痕形成的量值。图9比较使用TGF-β 3的四种实验性方案(在相隔大约24小时的两次治疗中的 每次给药每厘米5ng、50ng、200ng或500ng的量)的一种治疗的伤口愈合时所形成的瘢痕 随时间变化所实现的抑制瘢痕形成的量值。用500ng治疗的伤口已进行与本发明一致的治疗。图10示例使用全球瘢痕比较量表(The Global Scar ComparisonScale)比较发生 在使用TGF-β 3的四种实验性方案(在相隔大约24小时的两次治疗中的每次给药每厘米 5ng、50ng、200ng或500ng)的一种治疗的伤口愈合时所形成的瘢痕的抑制瘢痕形成的量值 所获得的结果。用500ng治疗的伤口已按照本发明进行治疗。使用GSCS的瘢痕形成评估 在创伤后进行12个月。标记为A的结果是由调查研究的外科医师在患者身上进行GSCS评 估所获得的那些，而标记为B的结果是由独立的临床专家组进行GSCS评估所获得的那些。图11显示示例了用于将TGF-β 3按照本发明提供到希望抑制疤痕形成的身体部 位的优选给药途径的照片。图面A显示包含TGF- β 3的组合物在待被创伤的部位的单次注 射给药。这一注射形成了覆盖伤口将要形成部位(两个内部圆点间)和覆盖延伸超过预期 伤口部位区域(外部圆点所界定的区域)的水泡。图面B显示包含TGF-β 3的组合物沿 未来伤口边缘的给药。实线示例了伤口将要形成的部位，而且围绕未来伤口的圆点显示了 TGF- β 3的可能给药部位。图面C和D示例了包含TGF- β 3的组合物给药于现有伤口(其 已经用缝线封闭)边缘。
图12示例了皮内注射可用于按照本发明的TGF-β 3给药的优选方法。将TGF-β 3 经其进行给药的皮下针经皮内插入到部位B并行进到部位Α(与部位B相隔距离1cm)。然 后随着针回撤，将100 μ 1组合物均勻地注射到部位A和B间。然后针经皮内插入到部位C， 并向部位B的方向行进，并且重复这一给药过程。当完成伤口一个边缘的给药时，然后可以 在另一边缘重复给药。实验结果图 1图1显示了来自发明人所进行的临床实验的数据，其产生了表示利用在单次治疗 中给予各种不同剂量的TGF-β 3所实现的抗瘢痕形成效应的剂量反应曲线。将作为单一皮 内注射的TGF-β 3或安慰剂给药于1厘米实验性伤口。该图将TGF-β 3治疗效应显示为来 自以部位作为因子的方差分析(ANOVA)的最小二乘均数和95%置信区间。为检测治疗效 应，从每一个体另一只胳膊上的解剖学上匹配的安慰剂ToScar中减去给予TGF-β 3的瘢痕 的ToScar。ToScar计算为自第6周和第3、4、5、6和7月VAS分数(mm)的总和。在给药后 的6个时间点(第6周、第3-7月)，由独立的非专业小组利用IOOmmVAS线对瘢痕进行评 分。图1示例了伤口边缘的每一厘米单次应用50ng、200ng和500ng/100y 1 TGF-β 3 可有效抑制瘢痕形成。改善水平显示为典型的钟型剂量反应曲线，在200ng/y 1剂量处观 察到最大改善(TGF-i3 3治疗的伤口中瘢痕改善平均> 50mm)，并且药物功效在接近剂量范 围顶端即每厘米伤口边缘为500ng/100l·! 1时下降。图 2图2显示了来自发明人进行的临床实验的数据。在这一研究中，在两次单独的治 疗中分别给予TGF_i3 3和安慰剂(借助于两次皮内注射)。然而，不同于本发明的方法， 第一治疗就发生在创伤之前，而第二次治疗发生在伤口刚刚闭合后，即两次剂量的给药彼 此相隔大约1小时内(第一次剂量在创伤之前的10-30分钟，且第二次在创伤后10-30分 钟)。该图将TGF-β 3治疗效应显示为来自以部位作为因子的方差分析(ANOVA)的最小二 乘均数和95%置信区间。为检测治疗效应，从每一个体另一只胳膊上在解剖学上匹配的安 慰剂ToScar中减去给予TGF-β 3的瘢痕的ToScar。ToScar计算为自第6周和第3、4、5、 6和7月VAS分数(mm)的总和。由独立的非专业小组在给药后的6个时间点(第6周、第 3-7月)利用IOOmmVAS线对瘢痕进行评分。图2示例了伤口闭合前和刚刚闭合后(即两次剂量在在大约1小时内给药)，伤 口边缘的每一厘米应用两次5ng、50ng、200ng和500ng/100y 1 TGF-β 3可有效抑制瘢痕 形成。改善水平显示为典型的钟型剂量反应曲线，在200ng/y 1剂量处观察到最大改善 (TGF- β 3治疗的伤口中瘢痕改善平均> 40mm)，并且药物功效接近剂量范围顶端，即伤口 边缘每一厘米500ng/100 μ 1时下降。给予两次TGF-β 3治疗(大约1小时内)的改善程 度和剂量反应曲线与给予一次TGF-β 3治疗的改善程度和剂量反应曲线(见图1)是可比 较的，尽管总的抑制瘢痕形成程度略微低于单一给药方案。这显示了 TGF-β 3的重复给药 (不是以本发明所描述的方法)不会导致更强的瘢痕形成抑制而且若有区别的话其稍微减 弱了这一化合物的抗瘢痕形成功效。图 3
图3显示使用本发明方法所产生的数据，在两次治疗中给予TGF-β 3和安慰 剂(每一次通过皮内注射)，第一次在创伤之前而第二次在创伤后大约24小时。该图将 TGF-β 3治疗效应显示为来自以部位作为因子的方差分析(ANOVA)的最小二乘均值和95% 置信区间。为检测治疗效应，从每一个体另一只胳膊上在解剖学上匹配的安慰剂ToScar中 减去给予TGF-β 3的瘢痕的ToScar。ToScar计算为自第6周和第3、4、5、6和7月VAS分 数(mm)的总和。由非专业小组在给药后的6个时间点(第6周、第3-7月)利用IOOmmVAS 线对瘢痕进行评分。图3示例了创伤之前和创伤后大约24小时，伤口边缘的每一厘米应用两次5ng、 50ng、200ng和500ng/100l·! 1 TGF-β 3有效抑制了瘢痕形成。在这些实验性治疗方法中，按 照本发明的这种方法(即在相隔24小时的治疗中给予500ng TGF-i3 3的方法)明显比其 它方法更有效。根据图1和2中给出的上述数据，令人惊讶地，改善水平并没有显示出典型的钟 形剂量反应曲线。而且，最大程度的改善是两次(创伤前和创伤后大约24小时)给予 500ng/100y 1剂量的TGF-i3 3治疗所实现的这一发现是令人惊讶地(在以这种方式用 TGF-β 3治疗的伤口中产生了平均> 60mm的瘢痕改善)。图 4图4显示来自三个体的代表性宏观图像，示例了利用不同TGF-β 3治疗方案抑 制瘢痕形成所达到的不同程度。这些宏观图像来源于发明人所进行的临床实验中安慰剂 治疗和TGF-β 3治疗(相隔大约24小时对伤口边缘的每一厘米给予两次50ng、200ng和 500ng/100y 1 TGF-β 3)伤口愈合时所产生的个体内瘢痕。每一次治疗中给予同样量的 TGF- β 3，而且所使用的量显示在题注中(顶部左侧显示伤口边缘每一厘米50ng/100 μ 1 TGF-β 3，顶部右侧是同一个体使用安慰剂冲间左侧显示伤口边缘每一厘米200ng/100y 1 TGF-β 3，中间右侧是同一个体使用安慰剂；底部左侧显示伤口边缘每一厘米500ng/100y 1 TGF-β 3，底部右侧是同一个体使用安慰剂)。能够看到本发明方法治疗的伤口(底部左侧)受益于所实现的最强的瘢痕形成抑 制作用。图 5图5显示对来自疤痕的硅模具进行轮廓测定法分析所获得的3维模拟和瘢痕测 量，所述疤痕为在发明人所进行的临床实验中用安慰剂治疗和TGF-β 3治疗(相隔大约24 小时对伤口边缘的每一厘米给予两次100μ 1的50ng/100y 1的TGF-0 3或100μ 1安慰剂) 的伤口愈合时产生。注意这不是按照本发明的治疗方法，但是(连同图6)可用来提供可比 较的数据，其说明了按照本发明的治疗方法的令人惊讶的功效(其结果在图7中阐明)。顶部图面显示了初始的3维模拟，而为了清楚起见，底部图面示例了用白色箭头 划分的瘢痕界限，而图像剩余区域为瘢痕周围的正常皮肤。通过轮廓测定法对每一个瘢痕 的一系列量化参数进行分析，并证明与安慰剂相比TGF-β 3治疗的瘢痕表面积有30. 21% 的减少(TGF-β 3治疗的伤口瘢痕表面积=12. 823mm2 ；安慰剂治疗的伤口瘢痕表面积= 18. 375mm2)。图 6图6显示对来自疤痕的硅模具进行轮廓测定法分析所获得的3维模拟和瘢痕测
18量，所述疤痕为发明人所进行的临床实验中安慰剂治疗和TGF-β 3治疗(相隔大约24小时 对伤口边缘的每一厘米给予两次100 μ 1的200ng/100 μ 1 TGF-β 3或100 μ 1安慰剂)的 伤口愈合时所产生的瘢痕。正如图6中所显示的结果，这并不构成按照本发明的治疗方法， 但是可用来提供可比较的数据，其显示了按照本发明的治疗方法的令人惊讶的功效(其结 果在图7中阐明)。顶部图面显示了初始的3维模拟，而为了清楚起见，底部图面示例了用白色箭 头划分的瘢痕界限，而图像剩余区域为瘢痕周围的正常皮肤。通过轮廓测定法对每一个 瘢痕的一系列量化参数进行分析，并证明了与安慰剂相比，TGF-β 3治疗的瘢痕表面积有 75. 19%的减少(TGF-β 3治疗的伤口瘢痕表面积=3. 532mm2 ；安慰剂治疗的伤口瘢痕表面 积=14.239mm2)。轮廓测定法分析也证明，与安慰剂治疗相比，TGF-β 3治疗的瘢痕隆起体 积有73. 33%的减少(TGF-β 3治疗的伤口瘢痕隆起体积=0. 0008mm3 ；安慰剂治疗的伤口 瘢痕隆起体积=0. 003mm3)。图 7图7显示对来自疤痕的硅模具进行轮廓测定法分析所获得的3维模拟和瘢痕测量 以示例本发明的方法的令人惊讶的功效，所述疤痕为在采取的临床实验中用安慰剂治疗和 TGF- β 3治疗(相隔大约24小时对伤口边缘的每一厘米给予两次100 μ 1的500ng/100 μ 1 的TGF-β 3或100 μ 1安慰剂)的伤口愈合时所产生的瘢痕。顶部图面显示了初始的3维模拟，而为了清楚起见，底部图面示例了用白色箭头 划分的瘢痕界限，而图像剩余区域为瘢痕周围的正常皮肤。如所能见到的，TGF-β 3治疗后 没有可察觉到的瘢痕，即轮廓测定法技术不能将用本发明的治疗方法治疗的伤口愈合时产 生的伤口与周围未受伤的正常皮肤中区分。因此，通过轮廓测定法分析的量化参数证明与 安慰剂相比按照本发明的TGF-β 3治疗的瘢痕表面积和瘢痕隆起体积有100%的减少，因 为TGF-β 3治疗后没有可察觉到的瘢痕(安慰剂治疗的伤口瘢痕表面积=12. 71mm2)。图7中所阐明的结果清楚地显示了与使用TGF-β 3的其它(治疗有效的)治疗相 比，本发明方法的令人惊讶的抑制伤口愈合所形成的瘢痕形成功效。图 8图8示例了来自发明人所进行的临床实验的数据，其中在两次治疗中(每次包含 检测物质的皮内注射给药)给予TGF-β 3或安慰剂，第一次治疗发生在创伤前而第二次治 疗在伤口刚刚闭合后，即两次剂量大约在1小时内(创伤前10-30分钟和创伤后10-30分 钟)给药。应认识到这一实验性治疗方法以及图8中显示的其结果并不代表按照本发明的 治疗方法，而是一种替代的(治疗有效的)治疗方法，其说明了本发明方法的令人惊讶的功 效。图8将TGF_i3 3(此处标记为〃 Juvista")和安慰剂的治疗效应显示为视觉模拟 评分(VAS)的平均分数(mm)。由一个独立的非专业小组在给药后的6个时间点(第6周和 第3-7月)利用IOOmmVAS线对瘢痕进行评分。图8示例了通过在伤口闭合前和伤口刚刚闭合后(即两次剂量在大约1小时内) 伤口边缘每一厘米两次应用100 μ 1的5ng、50ng、200ng和500ng/ μ 1 TGF- β 3抑制瘢痕形 成。改善水平是剂量反应性的而且通常在早期的时间点(第6周往前)首先明显起来并且 维持在整个评估期(即在这一研究中直到第7个月)。
*显示TGF-β 3与安慰剂治疗间的显著性差异(ρ < 0. 05)。图 9图9示例了来自发明人所进行的临床实验的数据，其比较了按照本发明的治疗方 法和其它使用TGF-β 3的治疗有效的抗瘢痕形成治疗。这一结果示例了本发明的方法与其 它治疗相比的令人惊讶的功效。在两次治疗中借助皮内注射方式给予TGF-β 3和安慰剂，第一次在创伤前而第二 次大约在24小时后。该图将TGF_i3 3(再次标记为"Juvista")和安慰剂的治疗效应显 示为视觉模拟评分(VAS)的平均分数(mm)。通过一个独立的非专业小组在给药后的6个时 间点(第6周和第3-7月)利用IOOmmVAS线对瘢痕进行评分。图9示例了通过在创伤前和创伤后大约24小时伤口边缘每一厘米两次应用 100 μ 1的5ng、50ng、200ng和500ng/ μ 1 TGF- β 3抑制瘢痕形成。改善水平是剂量反应性 的，而且通常在早期的时间点(第6周往前)首先明显起来并且维持在整个评估期(例如 在这一研究中直到第7个月)。令人惊讶的是，效应强度远远大于以前数据所预期的。能够 看到本发明方法(其中在每一次治疗中机体治疗部位的每一厘米提供500ng TGF-β 3)比 其它治疗方法(其自身仍然是治疗有效的)更为令人惊讶地有效。*表示TGF-33与安慰剂治疗间的显著性差异(ρ < 0. 05)。图 10当利用欧洲药品管理局优选的瘢痕形成评估工具_全球瘢痕比较量表(GSCS)，将 本发明的方法所提供的抗瘢痕形成效应与实验性治疗方案所实现的抗瘢痕形成效应相比 较时，本发明方法和药物的令人惊讶的有益效应会更加明显。在说明书中别处描述了 GSCS，而且其包含“双重VAS”这使得它在抗瘢痕形成效应 评估中能够产生比传统的“单个的VAS”方法更高的灵敏度。图10显示了用按照本发明的治疗方法或三个实验性对照治疗之一治疗的伤口愈 合后发生的瘢痕形成的比较结果。利用彼此相隔大约24小时给药的两次治疗对患者外科 手术切口进行治疗。在每一次治疗中，通过皮内注射给予TGF-β 3的量为治疗处每一厘米 5ng、50ng和200ng(在实验性治疗中)或在按照本发明的治疗中给予每一厘米500ng。使 用GSCS，在外科手术后12个月评估瘢痕形成。Y轴上所达到的值越高，这一特定治疗抑制 瘢痕形成的能力越强。A中所显示的结果是调查研究的外科医师在比较患者身上治疗的和对照治疗的瘢 痕时所产生的那些。这些示例了用本发明方法治疗的伤口愈合所观察到的瘢痕形成的抑制 远远大于使用替代治疗方案对照治疗伤口愈合时所观察到的瘢痕形成的抑制。当独立的临床评估组使用GSCS (评估者和EMEA所批准的评估工具组合以进行瘢 痕抑制指标的临床评估)比较各种治疗的抑制瘢痕能力时所获得的结果更加令人印象深 刻。这些显示于B中，而且清楚地表明了本发明方法治疗所实现的瘢痕抑制效应几乎是使 用每一厘米200ng的TGF- β 3 (在现有技术中所建议的最为有效的剂量)实验性治疗伤口 时所实现的瘢痕抑制效应的2倍。这些结果清楚地表明了当使用经管理机构验证的临床评估工具进行评估时，本发 明的药物或方法对人伤口的治疗能够导致35%或更多的瘢痕形成的抑制。序列信息
TGF- β 3 (序列 ID No. 1) ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS序列ID No. 2-编码野生型人TGF- β 3的DNAGCTTTGGACACCAATTACTGCTTCCGCAACTTGGAGGAGAACTGC
TGTGTGCGCCCCCTCTACATTGACTTCCGACAGGATCTGGGCTGG
AAGTGGGTCCATGAACCTAAGGGCTACTATGCCAACTTCTGCTCA
GGCCCTTGCCCATACCTCCGCAGTGCAGACACAACCCACAGCACG
GTGCTGGGACTGTACAACACTCTGAACCCTGAAGCATCTGCCTCG
CCTTGCTGCGTGCCCCAGGACCTGGAGCCCCTGACCATCCTGTAC
TATGTTGGGAGGACCCCCAAAGTGGAGCAGCTCTCCAACATGGTG
GTGAAGTCTTGTAAATGTAGC
权利要求
抑制人伤口愈合时所形成的瘢痕形成的方法，所述方法包含治疗瘢痕形成待被抑制的身体部位在第一次治疗中向伤口边缘的每一厘米或将要形成伤口的部位的每一厘米提供量为大约350 1000ng的TGF β3；以及在伤口形成后并在第一次治疗后8 48小时发生的第二次治疗中，向所述伤口提供量为每厘米疤痕形成待被抑制的伤口边缘大约350 1000ng的TGF β3。
2.如权利要求1所述的方法，其中借助于局部注射提供所述TGF-β3。
3.如权利要求2所述的方法，其中在将要形成伤口的部位提供所述第一次治疗，而且 将基本上沿着将要形成的伤口的中线给予所述局部注射。
4.如权利要求2所述的方法，其中在将要形成伤口的部位提供所述第一次治疗，而且 其中将局部注射给予将要形成的伤口的每一边缘。
5.如权利要求2所述的方法，其中将所述第一和/或第二次治疗提供到伤口边缘，而且 在所述伤口边缘0. 5厘米内的位置给予所述局部注射。
6.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二次治疗包含将 TGF-β 3提供到延伸超过所述伤口每一末端至少0. 5厘米的区域。
7.抑制人伤口愈合时所形成的瘢痕形成的方法，所述方法包含治疗瘢痕形成待被抑制 的身体部位在第一次治疗中，向将要形成伤口的部位的每一厘米提供量为大约350-1000ng的 TGF-3 3 ；以及在第一次治疗后8-48小时发生的第二次治疗中，向所述伤口提供量为每厘米瘢痕形 成待被抑制的伤口边缘大约350-1000ng的TGF-β 3。
8.抑制人伤口愈合时所形成的瘢痕形成的方法，所述方法包含治疗瘢痕形成待被抑制 的身体部位在第一次治疗中，向伤口边缘的每一厘米或未来伤口边缘的每一厘米提供量为大约 350-1000ng 的 TGF-β 3 ；在第一次治疗后8-48小时发生的第二次治疗中，向所述伤口提供量为每厘米瘢痕形 成待被抑制的伤口边缘大约350-1000ng的TGF-β 3。
9.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中提供的TGF-β3的量在每一次治疗中基 本上相同。
10.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中在每一次治疗中，提供的每厘米伤口边 缘或潜在伤口边缘的TGF-β 3的量为大约500ng。
11.如上述权利要求中任一项所述的方法，还包含第三次或更进一步的治疗。
12.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中治疗间隔大约24小时。
13.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述伤口为皮肤伤口。
14.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述伤口为循环系统的伤口。
15.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述伤口为外科手术的结果。
16.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TGF-β3通过给予身体部位的局 部注射来提供。
17.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TGF-β 3在药学上可接受的溶液中给药，给予每厘米被治疗的身体部位大约100 μ 1所述药学上可接受的溶液。
18.如权利要求7至17中任一项所述的方法，其中所述第一次治疗发生在创伤前。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一次治疗发生在创伤前长达1小时。
20.如权利要求7至17中任一项所述的方法，其中所述第一次治疗发生在创伤后。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一次治疗发生在创伤后长达2小时。
22.如权利要求7至17中任一项所述的方法，其中所述第一次治疗发生在伤口闭合后。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述第一次治疗发生在伤口闭合后长达2小时。
24.选择合适的治疗方案以抑制与人伤口愈合有关的瘢痕形成的方法，所述方法包含确定需要这种瘢痕形成抑制的个体能否完成发生在第一次治疗后8-48小时的第二次 治疗；如果所述个体能够完成发生在第一次治疗后8-48小时的第二次治疗，选择包含治疗 瘢痕形成待被抑制的身体部位的治疗方案以使在第一次治疗中，向瘢痕形成待被抑制的伤口边缘的每厘米或将要形成伤口的部位的 每厘米提供量为大约350-1000ng的TGF-β 3 ；以及在第一次治疗后8-48小时发生的第二次治疗中，向所述伤口提供量为每厘米瘢痕形 成待被抑制的伤口边缘大约350-1000ng的TGF-β 3 ；或者如果个体不能完成发生在第一次治疗后8-48小时的第二次治疗，选择包含如下的治 疗方案在单次治疗中，向瘢痕形成待被抑制的伤口边缘的每厘米或将要形成伤口的部位的每 厘米提供量为大约150-349ng的TGF-β 3。
25.用作治疗人伤口或将要形成人伤口的部位以抑制瘢痕形成的药物的TGF-β3，其 中在第一次治疗中，提供所述药物以使大约350-1000ng的TGF- β 3提供到伤口边缘的每一 厘米或将要形成伤口的部位的每一厘米，而且其中在随后的治疗中，提供所述药物以使在 前一次治疗后8-48小时将大约350-1000ng的TGF-β 3提供到伤口边缘的每一厘米。
26.根据权利要求25所使用的TGF-β3，其中所述药物为可注射的药物。
27.根据权利要求26所使用的TGF-β3，其中所述药物用于皮内注射。
28.根据权利要求25至27中任一项所使用的TGF-β3，其中配制所述药物以使在 100 μ 1体积的所述药物中提供必需量的TGF-β 3。
29.用于抑制与人伤口愈合有关的瘢痕形成的试剂盒，所述试剂盒包含至少第一和第 二小瓶，所述小瓶包含用于在彼此间隔8-48小时的时间对伤口或将要形成伤口的部位给 药的 TGF-β 3。
30.用于抑制与人伤口愈合有关的瘢痕形成的试剂盒，所述试剂盒包含第一量的含有TGF-β 3的组合物，该第一量用于在第一次治疗中对伤口或将要形成伤 口的部位给药；第二量的含有TGF-β 3的组合物，该第二量用于在第二次治疗中对伤口给药；关于在彼此间隔8-48小时的时间给予所述第一量和第二量的组合物的说明书；其中所述组合物被配制为向每厘米它给药的组织或器官提供量为大约350-1000ng的 TGF-D0
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中所述组合物包含浓度约为500ng/100y 1的 TGF-D0
全文摘要
本发明提供了利用转化生长因子β3(TGF-β3)抑制人瘢痕形成的新的治疗方法和用于抑制人瘢痕形成的新用途的TGF-β3。在第一次治疗中向伤口边缘的每一厘米或要形成伤口的部位的每一厘米提供大约350-1000ng的TGF-β3；在发生在伤口形成后且在第一次治疗后8-48小时的第二次治疗中，向伤口提供量为每厘米瘢痕形成待被抑制的伤口边缘大约350-1000ng的TGF-β3。在每一次治疗中提供的TGF-β3的量可以是相同的。优选地在每一次治疗中每厘米提供的TGF-β3的量可为大约500ng。TGF-β3可经皮内注射途径提供。本发明也提供了选择合适的治疗方案用于抑制与人伤口愈合有关的瘢痕形成的试剂盒和方法。
文档编号A61P17/02GK101918023SQ200880121276
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月11日 优先权日2007年12月12日
发明者大卫·费尔兰, 尼克·奥克莱斯顿, 沙伦·奥凯恩, 特蕾西·梅森, 詹姆士·布什, 马克·威廉·詹姆斯·弗格森, 马克·库珀 申请人:瑞诺弗有限责任公司