专利名称：：从麻疯树枝叶中提取抗病毒成分和麻疯树酚的方法及其它们的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于从大戟科植物麻疯树中提取抗病毒成分及其麻疯树酚
技术领域：
，具体涉及一种从麻疯树枝叶中提取抗病毒成分和麻疯树酚的方法及其它们作为抗流感甲3型病毒(A3)和I、II型单纯疱疹病毒(HSV-I、HSV-II)的应用。
背景技术：
：麻疯树C/3^印/73cwrca^为大戟科，麻疯树属植物，广泛分布在热带、亚热带地区。在我国，云南、广东、广西、贵州、福建以及四川等多个省份都具有丰富的资源。麻疯树是一种传统的药用植物，据《中药大辞典》记载"治跌打肿痛、骨折、创伤，皮肤瘙痒、湿疹，急性胃肠炎"。《常用中草药彩色图谱》记载"清热，解痉，止吐，止血，排脓生肌。内服治急性胃肠炎腹痛，霍乱吐泻；外用止血，治伤口溃疡，瘙痒"。《广西中草药》记载"散瘀消肿、止血、止痛、杀虫止痒"。其树叶可治疗风湿、性病、心绞痛；树枝乳汁则对疣、皮肤创伤等有很好的疗效；根可用于散淤消肿、止血叶可作为泻药。从以上文献报道来看，麻疯树虽具有较广泛的药用价值，但目前报道的药用价值仅限于一些民间的习惯用法，从未进行过系统的药学研究，迄今为止，也未见用麻疯树枝叶为原料开发的药品，更未见在麻疯树枝叶中提取酚类化学成分进行抗流感甲3型病毒和I、II型单纯疱疫病毒的研究报道。
发明内容本发明的目的是针对现有技术状况，首先提供一种从麻疯树枝叶中提取抗病毒成分的方法。本发明的次要目的是提供一种从麻疯树枝叶的抗病毒成分中提取麻疯树酚的方法。本发明的目的之三是提供一种从麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分的应用。本发明的目的之四是提供一种从麻疯树枝叶的抗病毒成分中提取的麻疯树酚的应用。本发明提供的从麻疯树枝叶中提取抗病毒成分的方法，该方法的提取步骤和工艺条件如下1)先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计10-30倍的蒸馏水或去离子水，在温度70-100'C下浸提8-24小时，重复提取1-3次，过滤，合并滤液，或将麻疯树枝叶千燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计10-30倍的乙醇，在温度25-55'C下浸提24-72小时，重复浸提1-3次，过滤，合并滤液，乙醇的体积浓度为30-85%;2)将水滤液在温度50-90°C，压力0.075-0.095MPa的条件下减压浓縮，至含生药2-5g/ml，即得抗病毒成分浓缩液，或将乙醇滤液在温度30-70°C,压力0.075-0.095MPa的条件下减压浓縮，至含生药2-5g/ml，即得抗病毒成分浓縮液。上述方法的工艺条件优选如下1)先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计15-20倍的蒸馏水或去离子水，在温度75-85'C下浸提10-20小时，重复提取1-3次，过滤，合并滤液，或将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计15-20倍的乙醇，在温度25-30'C下浸提48-36小时，重复浸提l-3次，过滤，合并滤液，乙醇的体积浓度为50-70%;2)将水滤液在温度70-8(TC，压力0.080-0.090MPa的条件下减压浓縮，至含生药2-5g/ml，即得抗病毒成分浓缩液，或将乙醇滤液在温度40-60°C，压力0.080-0.090MPa的条件下减压浓縮，至含生药2-5g/ml，即得抗病毒成分浓縮液。本发明提供的从麻疯树枝叶抗病毒成分中提取麻疯树酚的方法，该方法的提取步骤和工艺条件如下1)将从麻疯树枝叶中提取的生药量浓度为2-5g/ml的抗病毒成分浓缩液加稀盐酸调节pH至4.0-6.5，优选5.0-6.5,然后采用大孔树脂柱层析方式分离，即先用蒸馏水或去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%的乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集乙醇洗脱液；2)将经柱层析分离后收集的乙醇洗脱液，在30-60°C,压力0.075-0.095MPa，优选0.08-0.09MPa下减压浓縮1-4小时，然后在《-8(TC下，优选在-80-85'C下，冷冻干燥^45h，优选45-55h即得麻疯树酚粗提物；3)将麻疯树酚粗提物溶解于体积浓度为30-45%，优选35-40%的甲醇溶液中，然后用体积浓度30-70%甲醇在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化，分部收集洗脱液,将体积浓度40-60%甲醇洗脱部分的洗脱液，在30-60。C，压力0.055-0.075MPa，优选0.065-0.075MPa下减压浓縮1-4小时，然后在《-8(TC下，优选在-80-85'C下，冷冻干燥》45h,优选45-55h即得麻疯树酚。所得的麻疯树酚显示出如下酚类化合物的特性1)外观为浅棕黄色粉末，溶于水；易溶于甲醇、乙醇；2)本品与三氯化铁试剂反应，溶液颜色由红色变为红褐色，有暗紫色反应；3)本品与重氮化试剂反应，溶液变红色；4)紫外检测最大吸收波长Anm:270，340，见附图1;5)高效液相色谱仪(HPLC)检测麻疯树酚相对含量，见附图2-7。高效液相色谱(HPLC)的检测条件为固定相为SpherisorbC18色谱柱，以甲醇一tR(40:60)为流动相，检测波长为274nm,流速为1.0mL/min，柱温25'C，进样量10uL。上述方法所用的大孔树脂可为D-101型大孔树脂、D-102型大孔树脂、DM-301型大孔树脂、AB-8型大孔树脂、HPD-450型大孔树脂或HPD-600中的任一种。其中优选D-101型大孔树脂、DM-301型大孔树脂或HPD-450型大孔树脂中的任一种。上述方法采用的制备型液相色谱条件为色谱柱采用SpherisorbCw柱，柱温25-30°C，流速36ml/min，波长274nm,溶液浓度10mg/ml,流动相30-70%的甲醇溶液。本发明提供的从麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分的应用是将其作为抗流感甲3型病毒和I、II型单纯疱疹病毒药物的应用。本发明提供的从麻疯树枝叶的抗病毒成分中提取的麻疯树酚的应用是将其作为抗流感甲3型病毒和I、II型单纯疱疹病毒药物的应用。作为从麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分和麻疯树酚能抑制单纯疱疹病毒(HSV-IHSV-II)病毒和流感甲3型(A3)病毒，本发明做了如下实验验证，其具有较强的抗病毒作用(一)体外抗单纯疱疹病毒(HSV)实验(1)HSV对Vero细胞的毒力测定将Vero细M胰酶液消化，以细胞生长液调整细胞数至8.0X1041111—、按每孔0.1ml加入96孔细胞培养板内，放在37'C、C02孵箱中培养24h。取上述制备好的HSV—I和HSV—n毒株，用维持液将其分别做10倍系列稀释(10—110—10)，然后按0.1ml/孔接种于细胞培养板内的Vero单层细胞中，同时鄉,照。置37'C、CO游箱中培养7d，观察并记录细胞病变(cytopathiceffect,CPE)，按照Reed—Muench氏法计算，病毒对细胞的半数感染量(TCIDBo),HSV—I的TCIDso为l(TVinl;HSV—II的TCIDa)为10—3Vml。(2)麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚对Vero细胞的毒性试验用维持液分别将麻疯树枝叶总提取物和麻疯树酚作系列倍比稀释，药液浓度梯度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125mg/ml，加入96孔细胞培养板的Vero细胞中，6O.lml/孔，同时设细胞对照和阿昔洛韦对照(阳性对照)。置37'C、C02孵箱中培养7d，观察CPE，并记录各提取物的半数有毒浓度(TCs。)和最大无毒浓度(TC。)，麻疯树枝叶提取的抗病毒成分浓缩液的TC。和TCs。为0.25rag/ml和0.56mg/ml;麻疯树酚的TC。和TC幼为0.125mg/ml和0.14mg/ml。麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分浓缩液和麻疯树酚对细胞的毒性都较小。以最大无毒浓度(TC。)作为抗病毒实验药物的最高浓度。(3)麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚对HSV在细胞内增殖的抑制作用将100TCIDs。/0.lml的HSV—I接种于96孔细胞培养板的Vero细胞中，0.lml/孔，置37'C孵箱内吸附lh。同时，以TC。为各药的起始浓度，将麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚作系列倍比稀释，备用。待病毒吸附后，取出孵箱内的细胞培养板，用维持液洗涤，再分别加入预先稀释的各药液，0.lml/孔，同时设细胞对照、病毒对照以及阿昔洛韦对照。置37'C、C02孵箱中培养，每日观察CPE，当病毒对照组的0￡达++++时，终止实验。按照上述方法，以HSV—II进行相同实验操作，结果见表l。表l对单纯疱疹病毒在细胞内增殖的抑制作用病麟型样品样品浓度Cmg/mD复孔数'阳性CPE阴性阳性孔掛总复碰感染率(％)HSV—I0.254040/40分,液0.1254404/41000.06254404/4100麻綱酚0.06254040/400.03134131/4250.01564404/4100阿昔絲2X1(T34040/40HSV—II0.254040/40分鄉液0.1254311/4750.06254404/4100麻,酚0.1254040/400.06254040/400.03134404/4100阿昔歸1X1(T34040/40HSV—l对照04404/4.100HSV—ll对照04404/4100细舰照04040/40从麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚对不同病毒的ECso(半数有效浓度)，以治疗指数(TI，therapeuticindex)来评价提取物抑制病毒在细胞内增殖的作用，记为TL，TI产TC5。/EC5。，结果见表2。由表l可见，麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚均能抑制HSV在细胞内的增殖。麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分浓縮液在0.25mg/ml时會辦100%抑制病毒的增殖，麻疯树酚在0.0625mg/ml即可达到完全抑制病毒增殖的作用。由表2可见，麻疯树酚对HSV—I的治疗指数(效果与毒性的比率)为7.00，麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分浓縮液为3.11。麻疯树枝叶中提取的抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚对HSV—II的治疗指数相同，均为3.50。表2抑制单纯疱疹病毒增殖的治疗指数样品病型Teso￡"KCmg/mD(mg/mD0.163,500.027.000.140.043.50繊毒成分繊液麻,酚HSV—IHSV—IIHSV—IHSV一II(4)麻疯树枝叶中iit^毒成分浓縮液和麻疯树酚对HSV的直接灭活作用将预先稀释的麻疯树枝叶抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚溶液与100TCID50/0.lml的HSV—I病毒液等量混合，置37'C温箱内lh。然后接种于96孔细胞培养板的单层Vero细胞中，0.2ml/L每个实验组4个复孔，同时设细胞对照、病毒对照以及阿昔洛韦对照。再放入37'C孵箱吸附lh。取出，用维持液洗两7條，将维持液按O.lml/孔加到细胞培养板内，置37'C、5%002孵箱中培养，每日观察记录CPE，当病毒对照组的〔6达++++时，终止实验。按照上述方法，以HSV—n进行相同实验操作，结果见表3。结果显示，麻疯树枝叶抗病毒成分浓缩液和麻疯树酚对病毒的半数有Jt浓度，记为ECw。同样以治疗指数来评价对病毒的直接，作用，记为TI"TI2=TC50/ECM，结果见表4。8表3对单纯疱疹病毒的直接灭活作用病毒样品样品浓度复孔数CPE阳性孔敬总^LJt感染率类型(mg/ml)阳性阴性(%)HSV—I抗病毒0.06254040/40成分浓缩液0.03134313/4750.01564404/4100麻疯树0.01564040/40酚0.00784313/4750.00394404/4100阿昔洛0,0254404/4100韦HSV—II抗病毒0.254040/40成分浓繊0.1254313/4750.06254404/4100麻疯树0.1254040/40酚0.06254040/400.03134404/4100阿昔洛0.0254404/4100韦HSV--I对照04404/4100HSV--II对照04404/4100细胞对照04040/40表4直接灭活单纯疱疹病毒的治疗指数样品TCso(mg/ml)TI2繊毒成分繊液麻細酚HSV—IHSV—IIHSV—IHSV—II0.560.140.040.160.010.0414.003.5014.003.50由表3可见，麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液在浓度为O.0625fflg/ml时能10W灭活HSV一I，0.25mg/ml时能l(m灭活HSV—I1。而麻疯树酚在O.0156mg/ml时能10(m灭活HSV—I,浓度达到0.0625呢/ml时能10TO灭活HSV—n。由表4可见，麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚对HSV—I直接灭活的治疗指数显著高于HSV—II。麻疯树枝叶中抗病毒成分浓缩液和麻疯树酚在对HSV—I的直接灭活中，治疗指数均为14.00。(二)麻疯树枝叶中抗病毒成分,液和麻疯树酚对体外抗流感甲3型病毒(A3)的实验(1)对鸡胚的毒力测定用生理盐水作10倍系列稀释(10—'10—，的病毒感染液，分别接种于九日龄鸡胚中，0.lml/胚，每浓度4个复胚，同时设空白对照。放33-C温箱中培养48h，然后置于4'C冰箱，次日取出，取尿囊液，用O.5%鸡红细胞作血凝试验。病毒血凝滴度结果，病毒致鸡胚半数感染量(EIDs。)为l(TVml。所配A3浓度为50EID50/0.lml。(2)麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚对鸡胚的毒性测定用生理盐水将麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚作系列倍比稀释，药液浓度梯度为40、20、10、5和2.5mg/ml。将不同浓度的样品溶液注入九日龄鸡胚中，0.lml/胚，每实验组4个重复，同时设空白对照和病毒唑对照(阳性对照)。放33'C温箱中培养48h后，取'出，观察记录鸡胚的存活情况。按照Reed—Muench氏法计算，麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚对鸡胚的TC。均为20mg/ml，TCs。为50和28.17mg/ml。(3)麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚对A3在鸡胚内增殖的抑制作用将50EIDs。/0.lml的A3接种于九日龄鸡胚中，0.lml/胚，放33'C吸附lh。同时，以20mg/ml为麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚的起始浓度，用生理盐水将麻疯树枝叶中抗病毒成分、目液和麻疯树酚作系列倍比稀释，浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25和0.625mg/ml，备用。待病毒吸附后，将稀释好的麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚注入鸡胚内，0.lml/胚，每实验组4个重复，同时设空白对照、病毒对照和病毒唑对照。放33"C温箱中培养48h，然后置于4'C冰箱，次日取出，取鸡胚尿囊液，用0.5%鸡红细胞测血凝，结果见表5。麻疯树枝叶中抗病毒成分,液和麻疯树酚的半数有效浓度EC5。，并以治疗指数(TI)来评价麻疯树枝叶中抗病毒成分浓缩液和麻疯树酚对病毒在细胞内增殖的抑制作用，记为TI"TI3=TC5。/ECM，结果见表6。由表5可见，麻疯树酚不能抑制A3在鸡胚内的增殖，麻疯树中抗病毒成分浓縮液在20mg/ml时可完全抑制A3的增殖。如表7所示，麻疯树中抗病毒成分浓縮液对流感甲3型病毒的治疗指数为5.66。表5对流感甲3型病毒在鸡胚内增殖的抑制作用病毒。类型样品样品浓度鄉数■CPE'阳'l4M/总鄉数感染率(％)(mg/ml)阳性阴性A3繊毒成204400/40分鄉液104403/47554404/4100麻,酚204044/4100104314/410054404/4100病毒唑0.054040/40A3对照04404/4100空白对照04040/40表6抑制流感甲3型病毒增殖的治疗指数样品TCso(mg/ml)EC50(mg/ml)抗病毒成分鄉液50.008.835.66麻,酚28,17一一此处"一"标对病^5St(4)麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚对A3的直接灭活作用将稀释好的麻疯树枝叶中抗病毒成分目液和麻疯树酚溶液(稀释方法同前)与50EIDs。/0.lml的A3等量混合，置33。C温箱中和lh。然后接种于九日龄鸡胚中，0.2ml/胚，每实验组4个重复，同时设空白对照、病毒对照和病毒唑对照。放33'C温箱培养48h，然后置于4"C冰箱中，次日取出，取鸡胚尿囊液，用O.5%鸡红细胞测血凝效价，结果见表7。麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚的半数有效浓度EC5。，以治疗指数(TI)来评价麻疯树枝叶中抗病毒成分浓縮液和麻疯树酚直接灭活病毒的治疗指数，记为TI"TI4=TC5。/EC5。，结果见表8。由表7可见，麻疯树中抗病毒成分浓縮液在0.5mg/ml时能10(^灭活A3，麻疯树酚在0.125mg/ml时即可1009&灭活A3。如表8可见，麻疯树中抗病毒成分浓縮液直接灭活A3的治疗指数为138.89，麻疯树酚直接灭活A3的治疗指数为704.25。11表7胂流感甲3型病毒的直接灭活作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由于麻疯树枝叶中化学成分较为复杂，本发明主要是为了提取抗流感甲3型病毒(A3)和抗I、II型单纯疱疹病毒(HSV-I、HSV-II)的有效成分，通过蒸馏水、去离子水和乙醇为溶剂提取抗病毒活性成分，发现了乙醇为溶剂对麻疯树枝叶中的抗病毒成分提取最充分，因而确定了乙醇提取物是麻疯树枝叶中抗病毒成分主要集中的部分，用乙醇提取物作抗单纯疱疹病毒和流感甲3型病毒活性测试，麻疯树枝叶的抗病毒成分对细)鸟胚的毒性均较小。抗病毒成分浓縮液能有效抑制单纯疱疹病毒在胞内的增殖(见表l、表2),抗病毒成分浓縮、W"HSV—I和HSV—II在胞内增殖的抑制作用相同，但对抑制HSV-II增殖的治疗指数略大于HSV—I。同时抗病毒成分浓縮液还能直接灭活HSV—I和HSV—II(见表4、表5),抗病毒成分浓縮液浓度在0.0625mg/ml时能100%灭活HSV一I，浓度在0.25mg/ml时能100%灭活HSV—II,而直接灭活HSV—I的治疗指数明显大于HSV—II。结果显示了麻疯树枝叶的抗病毒成分浓縮,单纯疱疹病毒的直接杀伤作用较抑制单纯疱疹病毒增殖的作用强，对病毒的直接杀伤作用比抗病毒西药阿昔洛韦强。同时抗病毒成分浓缩液还能抑制流感甲3型病毒在鸡胚内的增殖，其治疗指数为5,66;抗病毒成分浓縮液在浓度为0.5mg/ml时可灭活流感甲3型病毒，且灭活流感甲3型病毒的治疗指数高达138.89，抗病毒成分mHI、W^流感甲3型病毒显示了较强的杀伤作用。将本发明获得的抗病毒成分、M液，经过本发明提供的分离麻疯树酚的方法，可有效地分离得到相对含量为6493%的麻疯树酚。在分离过程中本发明以大孔树脂柱层析进行粗分，再通过制备型HPLC纯化，得到相对含量为6493%的麻疯树酚，经分析型HPLC检测，确保了抗病毒活性成分的准确提取。本发明还进行了麻疯树酚对流感甲3型病毒(A3)和抗I、II型单纯疱疹病毒(HSV-I、HSV-II)的抑制细胞增殖和灭活病毒细胞作用的活性测定(见表18)，结果显示麻疯树酚抑制HSV-I增殖的治疗指数远大于抗病毒成分液，灭活HSV-I的治疗指数与抗病毒成分,液相同，对HSV-II的增殖与灭活的治疗指数麻疯树酚与抗病毒成分浓缩液一致。麻疯树酚不能抑制A3增殖，但是灭活A3的治疗指数远远大于抗病毒成分浓缩液，对流感甲3型病毒的杀伤作用可与西药病毒唑媲美。试验结果不仅为进行麻疯树枝叶开发和利用提供了依据，而且为进一步利用麻疯树创制新药奠定了技术基础。本发明的提取步骤简便易行，可操作性强，有利于降低提取成本，检测方法稳定性和重复性好。图l为本发明提取的麻疯树酚的紫外检测图2为本发明实施例7提取的麻疯树酚高效液相色谱图3为本发明实施例8提取的麻疯树酚高效液相色谱图4为本发明实施例9提取的麻疯树酚高效液相色谱图5为本发明实施例10提取的麻疯树酚高效液相色谱图6为本发明实施例11提取的麻疯树酚高效液相色谱图7为本发明实施例12提取的麻疯树酚高效液相色谱图。具体实施例方式下面给出实施例以对本发明做进一步描述，需指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员根据本发明的上述内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。实施例1先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计15倍的蒸馏水，在温度70'C下浸提24小时，重复提取2次，过滤，合并滤液;将水滤液在温度50'C,压力0.075MPa的条件下减压浓縮，至含生药2g/ml，即得抗病毒成分浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节pH至4.0，然后采用D-101型大孔树脂柱层析方式分离，即先用蒸馏水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液；将收集的乙醇洗脱液在30°C,压力0.095MPa下减压浓缩l小时，然后在-85'C下，冷冻干燥45h，得麻疯树酚粗提物。实施例2先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计10倍的去离子水，在温度75。C下浸提20小时，过滤；将水滤液在温度60。C，压力0.080MPa的条件下减压浓缩，至含生药2g/ml，即得抗病毒成分浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节pH至4.5，然后采用HPD-600型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱,并收集45-65%段的乙醇洗脱液;将收集的乙醇洗脱液在35°C，压力0.090MPa下减压浓縮1.5小时，然后在-84'C下，冷冻干燥48h，得麻疯树酚粗提物。实施例3先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计18倍的蒸馏水，在温度80。C下浸提18小时，重复提取3次，过滤，合并滤液;将水滤液在温度7(TC，压力0.090MPa的条件下减压浓缩，至含生药2g/ml，即得抗病毒成分浓縮液。将抗病毒成分浓缩液浓縮液加稀盐酸调节pH至5.5，然后采用HPD-450型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液;将收集的乙醇洗脱液在45°C,压力0.090MPa下减压浓缩2.0小时，然后在-82'C下，冷冻干燥46h，得麻疯树酚粗提物。实施例4先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计20倍的蒸馏水，在温度85。C下浸提15小时,重复提取2次，过滤,合并滤液;将水滤液在温度85°C，压力0.090MPa的条件下减压浓縮，至含生药2g/ml，即得抗病毒成分浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓缩液加稀盐酸调节PH至6.5,然后釆用D-101型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液；将收集的乙醇洗脱液在55。C，压力0.085MPa下减压浓缩3.0小时，然后在-82'C下，冷冻干燥45h,得麻疯树酚粗提物。实施例5先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计25倍的去离子水，在温度90'C下浸提10小时，过滤；将水滤液在温度90'C，压力0.085MPa的条件下减压浓縮，至含生药2g/ml，即得抗病毒成分浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节PH至6.0，然后采用D-102型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液；将收集的乙醇洗脱液在50'C,压力0.080MPa下减压浓縮3.5小时，然后在-80'C下，冷冻干燥50h，得麻疯树酚粗提物。实施例6先将麻疯树枝叶干燥后粉碎,然后以干燥后枝叶重量计30倍的蒸馏水,在温度100。C下浸提8小时，重复提取2次，过滤，合并滤液；将水滤液在温度80°C，压力0.095MPa的条件下减压浓縮，至含生药2g/ml，即得抗病毒成分浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节PH至5.0，然后采用DM-301型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液；将收集的乙醇洗脱液在6(TC，压力0.075MPa下减压浓縮4.0小时，然后在-81'C下，冷冻干燥55h，得麻疯树酚粗提物。实施例7先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计10倍的乙醇，在温度25'C下浸提24小时，重复浸提3次，过滤，合并滤液，乙醇的体积浓度为85%;将乙醇滤液在温度30'C,压力0.075MPa的条件下减压浓縮，至含生药4g/ml，即得抗病毒成分浓缩液浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节PH至5.0，然后采用AB-8型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液；将收集的乙醇洗脱液在6fTC，压力0.075MPa下减压浓縮4.0小时，然后在-81'C下，冷冻干燥55h，得麻疯树酚粗提物。将麻疯树酚粗提物溶解于体积浓度为30%的甲醇溶液中，然后用体积浓度30-70%甲醇在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化，分部收集洗脱液，将收集的体积浓度40-60%甲醇洗脱部分的洗脱液，在30°C,压力0.055MPa下减压浓縮1小时，然后在-80。C下，冷冻干燥55h即得麻疯树酚。用高效液相色谱仪检测麻疯树酚相对含量为64.60%,见图2。实施例8先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计15倍的乙醇，在温度30。C下浸提30小时，重复浸提2次，过滤，合并滤液，乙醇的体积浓度为70%;将乙醇滤液在温度35'C，压力0.080MPa的条件下减压浓縮，至含生药4g/ml，即得抗病毒成分浓縮液浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节pH至6.0，然后采用DM-301型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液；将收集的乙醇洗脱液在4(TC，压力0.085MPa下减压浓縮1.5小时，然后在-83'C下，冷冻干燥50h，得麻疯树酚粗提物。将麻疯树酚粗提物溶解于体积浓度为35%的甲醇溶液中，然后用体积浓度30-70%甲醇在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化，分部收集洗脱液，将收集的体积浓度40-60%甲醇洗脱部分的洗脱液，在40'C，压力0.060MPa下减压浓縮1.5小时，然后在-83'C下，冷冻干燥50h即得麻疯树酚。用高效液相色谱仪检测麻疯树酚相对含量为90.27%,见图3。实施例9先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计20倍的乙醇，在温度25'C下浸提36小时，重复浸提2次，过滤，合并滤液，乙醇的体积浓度为50%;将乙醇滤液在温度4(TC，压力0.090MPa的条件下减压浓縮，至含生药4g/ml，即得抗病毒成分浓缩液浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节pH至6.5，然后采用HPD-450型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液;将收集的乙醇洗脱液在5(TC，压力0.090MPa下减压浓縮2.0小时，然后在-82'C下，冷冻干燥47h，得麻疯树酚粗提物。将麻疯树酚粗提物溶解于体积浓度为38%的甲醇溶液中，然后用体积浓度30-70%甲醇在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化，分部收集洗脱液，将收集的体积浓度40-60%甲醇洗脱部分的洗脱液，在50'C，压力0.070MPa下减压浓縮2.0小时，然后在-82'C下，冷冻干燥47h即得麻疯树酚。用高效液相色谱仪检测麻疯树酚相对含量为93.65%，见图4。实施例10先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计15倍的乙醇，在温度25'C下浸提48小时，重复浸提2次，过滤，合并滤液，乙醇的体积浓度为60%;将乙醇滤液在温度50'C，压力0.090MPa的条件下减压浓縮，至含生药4g/ml，即得抗病毒成分浓縮液浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节pH至6.5，然后采用D-101型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液；将收集的乙醇洗脱液在55。C，压力0.090MPa下减压浓縮3.0小时，然后在-82'C下，冷冻干燥48h，得麻疯树酚粗提物。将麻疯树酚粗提物溶解于体积浓度为40%的甲醇溶液中，然后用体积浓度30-70%甲醇在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化，分部收集洗脱液，将收集的体积浓度40-60%甲醇洗脱部分的洗脱液，在55'C，压力0.075MPa下减压浓縮3.0小时，然后在-82'C下，冷冻干燥48h即得麻疯树酚。用高效液相色谱仪检测麻疯树酚相对含量为93.35%,见图5。实施例11先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计25倍的乙醇，在温度45。C下浸提40小时，重复浸提2次，过滤，合并滤液，乙醇的体积浓度为40%;将乙醇滤液在温度6(TC，压力0.095MPa的条件下减压浓縮，至含生药4g/ml，即得抗病毒成分浓縮液浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节pH至5.0,然后采用D-102型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集45-65%段的乙醇洗脱液；将收集的乙醇洗脱液在60'C，压力0.075MPa下减压浓縮3.5小时，然后在-84'C下，冷冻干燥46h，得麻疯树酚粗提物。将麻疯树酚粗提物溶解于体积浓度为45%的甲醇溶液中，然后用体积浓度30-70%甲醇在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化，分部收集洗脱液，将收集的体积浓度40-60%甲醇洗脱部分的洗脱液，在60'C，压力0.070MPa下减压浓缩3.5小时，然后在-84'C下，冷冻干燥46h即得麻疯树酚。用高效液相色谱仪检测麻疯树酚相对含量为76.14%,见图6。实施例12先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计30倍的乙醇，在温度55'C下浸提40小时，过滤，乙醇的体积浓度为30%;将乙醇滤液在温度70'C,压力0.085MPa的条件下减压浓縮，至含生药4g/ml，即得抗病毒成分浓縮液浓縮液。将抗病毒成分浓縮液浓縮液加稀盐酸调节pH至4.0，然后采用HPD-450型大孔树脂柱层析方式分离，即先用去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%乙醇溶液进行梯度洗脱,并收集45-65%段的乙醇洗脱液;将收集的乙醇洗脱液在45C压力0.080MPa下减压浓縮4.0小时，然后在-85'C下，冷冻干燥45h,得麻疯树酚粗提物。将麻疯树酚粗提物溶解于体积浓度为40%的甲醇溶液中，然后用体积浓度30-70%甲醇在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化，分部收集洗脱液，将收集的体积浓度40-60%甲醇洗脱部分的洗脱液，在45°C,压力0.065MPa下减压浓縮4.0小时，然后在-85t:下，冷冻干燥45h即得麻疯树酚。用高效液相色谱仪检测麻疯树酚相对含量为81.03%,见图7。权利要求1、一种从麻疯树枝叶中提取抗病毒成分的方法，该方法的提取步骤和工艺条件如下1)先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计10-30倍的蒸馏水或去离子水，在温度70-100℃下浸提8-24小时，重复提取1-3次，过滤，合并滤液，或将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计10-30倍的乙醇，在温度25-55℃下浸提24-72小时，重复浸提1-3次，过滤，合并滤液，乙醇的体积浓度为30-85％；2)将水滤液在温度50-90℃，压力0.075-0.095MPa的条件下减压浓缩，至含生药2-5g/ml，即得抗病毒成分浓缩液，或将乙醇滤液在温度30-70℃，压力0.075-0.095MPa的条件下减压浓缩，至含生药2-5g/ml，即得抗病毒成分浓缩液。2、根据权利要求1所述的从麻疯树枝叶中提取抗病毒成分的方法，该方法的提取步骤和工艺条件如下1)先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计15-20倍的蒸馏水或去离子水，在温度75-85'C下浸提10-20小时，重复提取1-3次，过滤，合并滤液，或将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后以干燥后枝叶重量计15-20倍的乙醇，在温度25-30'C下浸提48-36小时，重复浸提l-3次，过滤，合并滤液，乙醇的体积浓度为50-70%;2)将水滤液在温度70-8CTC，压力0.080-0.090MPa的条件下减压浓縮，至含生药2-5g/ml，即得抗病毒成分浓缩液，或将乙醇滤液在温度40-60°C,压力0.080-0.090MPa的条件下减压浓缩，至含生药2-5g/ml，即得抗病毒成分浓縮液。3、一种从麻疯树枝叶抗病毒成分中提取麻疯树酚的方法，该方法的提取步骤和工艺条件如下1)将从麻疯树枝叶中提取的生药量浓度为2-5g/ral的抗病毒成分浓縮液加稀盐酸调节pH至4.0-6.5，然后采用大孔树脂柱层析方式分离，即先用蒸馏水或去离子水冲洗树脂，再用体积浓度为30-85%的乙醇溶液进行梯度洗脱，并收集乙醇洗脱液；2)将经柱层析分离后收集的乙醇洗脱液，在30-60'C，压力0.075-0.095MPa下减压浓縮1-4小时，然后在《-80'C下，冷冻干燥》45h即得麻疯树酚粗提物；3)将麻疯树酚粗提物溶解于体积浓度为30-45%的甲醇溶液中，然后用体积浓度30-70%甲醇在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化，分部收集洗脱液，将用体积浓度40-60%甲醇洗脱部分的洗脱液，在30-60°C，压力0.055-0.075MPa下减压浓縮l-4小时，然后在《-8(TC下，冷冻干燥》45h即得麻疯树酚。4、根据权利要求3所述的从麻疯树枝叶抗病毒成分中提取麻疯树酚的方法，该方法在用大孔树脂柱层析方式分离前是将麻疯树枝叶抗病毒成分浓縮液加稀盐酸调节pH至5.0-6.5。5、根据权利要求3或4所述的从麻疯树枝叶抗病毒成分中提取麻疯树酚的方法，该方法所用的大孔树脂可为D-101型大孔树脂、D-102型大孔树脂、DM-301型大孔树脂、AB-8型大孔树脂、HPD-450型大孔树脂或HPD-600中的任一种。6、根据权利要求3或4所述的从麻疯树枝叶抗病毒成分中提取麻疯树酚的方法，该方法采用的液相色谱条件为色谱柱采用Spherisorb(:18柱，柱温25-30°C，流速36ml/min，波长274nm，溶液浓度10mg/ml，流动相30-70%的甲醇溶液。7、根据权利要求3或4所述的从麻疯树枝叶抗病毒成分中提取麻疯树酚的方法，该方法对经柱层析分离后收集的乙醇洗脱浓縮液是在-80-85'C下冷冻干燥45-55h得麻疯树酚粗提物。8、根据权利要求3或4所述的从麻疯树枝叶抗病毒成分中提取麻疯树酚的方法，该方法是将麻疯树酚粗提物溶解于体积浓度为35-40%的甲醇溶液中，且对在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化收集的40-60%甲醇部分的洗脱液，是在-80-85'C下冷冻干燥45-55h得麻疯树酚。9、权利要求12中任何一项提取的麻疯树枝叶抗病毒成分作为抗流感甲3型病毒和I、II型单纯疱疹病毒药物的应用。10、权利要求38中任何一项提取的麻疯树酚作为抗流感甲3型病毒和I、II型单纯疱疹病毒药物的应用。全文摘要本发明公开的从麻疯树枝叶中提取抗病毒成分和麻疯树酚的方法是先将麻疯树枝叶干燥后粉碎，然后用蒸馏水或去离子水或体积浓度30-85％的乙醇浸提，重复提取1-3次，过滤，合并滤液，再将滤液减压浓缩得抗病毒成分浓缩液；将所得浓缩液调用大孔树脂柱层析方式进行梯度洗脱分离，并收集乙醇洗脱液；将收集的乙醇洗脱液减压浓缩后在≤-80℃下，冷冻干燥即得麻疯树酚粗提物；将麻疯树酚粗提物溶解于甲醇溶液中，然后用体积浓度30-70％甲醇在制备型液相色谱仪中进行梯度洗脱纯化，将收集的洗脱液减压浓缩后在≤-80℃下，冷冻干燥即得麻疯树酚。本发明还公开了从麻疯树枝叶中提取抗病毒成分和麻疯树酚作为抗流感甲3型病毒和I、II型单纯疱疹病毒药物的应用。文档编号A61K36/47GK101623319SQ20091006013公开日2010年1月13日申请日期2009年7月28日优先权日2009年7月28日发明者娟刘,琳唐,放陈,蕾雷,钫颜申请人:四川大学