专利名称：Bapta及其衍生物在肝功能衰竭的抢救和治疗药物方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类化合物及其衍生物的用途，具体是BAPTA及其书f生物的用途。
背景技术：
病毒性肝炎是一种病毒感染性自身免疫性疾病，其最终结果是发展成严重肝 损伤导致肝功能衰竭(Liver failure, LF)而死亡，肝脏疾病又是人类最常见的 疾病之一，我国是病毒性肝炎高发国，肝功能衰竭死亡率高达60-90%。目前无 专门针对LF的药物(参见中华医学会感染病学分会肝功能衰竭与人工肝学组， 中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组肝功能衰竭诊疗指南。中华传染病 杂志 2006; 12 ( 24 ): 422-446 )。因此，研究开发针对LF的有效药物，降低 病死率，是急需解决的重大医药学课题。
内源性或外源性因子包括药物引起的细胞内钙超载可导致疾病的发生和发 展。反之， 一些疾病会造成细胞内钙超载。由于缺血缺氧，能量代谢障碍，细胞 内外离子失衡，细胞内钠离子不能泵出，钠-钙交换增强致细胞内钙增加；离子 失衡使细胞去极化，神经元兴奋性增加使兴奋性谷氨酸大量释放，N-曱基-D-天 门冬氨酸(NMDA )受体激活，大量钙内流；细胞内高钙又触发胞内钙库内钙释放， 致细胞内游离4丐进一步升高；细胞去极化引起电压依赖性鈣通道开放，加上三磷 酸腺苷ATP的依赖性使钓泵失能，形成钙超载。细胞内钙超载通过以下途径致细 胞中毒乃至死亡①激活钙致活蛋白酶类，尤其是钙蛋白酶Ca 1 pa i n，使细胞蛋白 特别是骨架蛋白和微管相关蛋白-2水解，引起细胞崩塌；②激活脂酶(包括磷脂 酶)，使膜磷脂水解，花生四烯酸代谢产物增多，导致膜结构完整性受损和炎症反 应，加重细胞损伤；③促进氧自由基和一氧化氮生成，加重细胞损伤。BAPTA作为 一种最佳的钓络合剂广泛用于控制细胞内，外钙水平，用于研究钙离子对各种细 胞功能调节的研究，是一种国际公认的标准工具药物。
发明内容
本发明提供了 BAPTA及其衍生物在肝功能衰竭的抢救和治疗药物方面的用 途，通过BAPTA及其衍生物作为钙络合剂解除细胞内钩超载，减少大面积细胞死 亡，将其用于肝功能衰竭的4仓救和治疗。
所述的BAPTA及其衍生物在肝功能衰竭的抢救和治疗药物方面的应用； 本发明所迷的BAPTA衍生物是指BAPTA酯化产物或苯环有取代基的酯化产 物，化学式通式为
式中X「X4是相同的基团，或者是不同的基团；表示CHm ， n=2-8，或CnH2n+1 (0CH2CH2)m , n=l-18, m=l-3;
A和B表示苯环上的取代基，是H， CHO, COOH， N02, NHR， CF3，烃基、卤素、 或者是烷氧基，
两苯环，是对称的，或者是不对称的。 所述的BAPTA双-邻氨苯氧乙烷基-N， N, -N， ， N，-四乙酸是一种钙络合剂， 用于检测细胞内外钧水平，通过钩离子对各种细胞功能进行调节。
所述的BAPTA及其^f汙生物的用途，其特征在于所述的BAPTA ^"生物的化学式为:<formula>formula see original document page 5</formula>
其中X表示CnH^ ， n=2-8,或CnH2n+1 (OCH线h ， n=l-18, m=l-3; A,B表示H，CHO, COOH， N02, NHR， CF3,烃基，卣素或者烷氧基； 两苯环，是对称的，或者是不对称的。所述的BAPTA及其衍生物的用途，其特征在于所述的BAPTA衍生物的化学 式为
其中X表示CJU, ， n=2—8,或C H2n+1 (OCH2CH2)m ， n=l-18， m=l—3; E表示二钠或钩；
A, B表示H, CHO, COOH， N02， NHR， CF3，烃基，卣素或者烷氧基， 两苯环，是对称的，或者是不对称的。
所述的BAPTA及其衍生物的用途，其特征在于所述的BAPTA 4汙生物的作用 机制是通过其抗细胞凋亡来保护肝细胞，抗细胞凋亡是通过维持细胞内钙稳态， 减轻4丐超载来抑制细胞凋亡和细胞内游离钙浓度的升高，抑制化学性损伤引起的 细胞活性下降，来提高细胞的存活率。
所述的BAPTA及其衍生物用于制造治疗肝功能衰竭药物，可制成片剂、胶囊、 注射液或其他适宜剂型。
本发明所述的BAPTA及其衍生物用于急性肝功能衰竭等临床危重症的抢救
和治疗，并为争取时间进行其它临床常规治疗贏得时间和机会。
具体实施例方式
BAPTA和乙酰氧甲基反应生成乙酰氧甲氧基四腈(BAPTA-AM), BAPTA-AM有 很高的脂溶性，而透过细胞膜在细胞内发挥作用，故又称为"细胞可通透性"。 HXB-08为BAPTA的水溶性二钠盐，分子式为C42H62N2012Na2。鉴于细胞内4丐超负荷 是各种原因51起细胞死亡的最终必经之路，直接、迅速降低细胞内游离钩浓度， 减轻或消除4丐超载，是抢救瀕危细胞，减轻细胞损伤的有效和首要途径。
BAPTA衍生物的药效学研究根据小鼠的各种肝功能衰竭模型，进行体内外 实验，研究如下
1、 BAPTA衍生物对CCl4致小鼠急性肝衰竭(ALF)的治疗作用观察 本实验运用CCl4诱导小鼠ALF，观察BAPTA-AM脂质体不同剂量和不同给药 时间的抗ALF作用。结果表明BAPTA-AM脂质体能显著提高CC14所致ALF小鼠的存活率。随着BAPTA-AM脂质体剂量的增大，小鼠存活率逐渐提高，当BAPTA-AM 脂质体剂量为2. 5 mg/kg时达到峰值，36 h后小鼠存活率由模型组的14. 3%大幅 度提高到64. 3%，比模型组提高了 350%。各时间给药组均不同程度地提高小鼠存 活率，其中又以造模后立即给药效果最好，24 h后观察，立即给药组的存活率 为85. 7%,比模型组提高了 99. 8%; 36 h后观察，立即给药组的存活率为50%, 比模型组提高了近250%。 结果表明
(1 )、在本模型上，模型组和BAPTA-AM脂质体治疗组动物的死亡率均随时 间延长而增加；
(2 )、随观察时间段不同，观察所得结果不同24 h时的存活率比36 h高； 治疗组存活率比模型组高，说明BAPTA-AM脂质体对CC14所致小鼠ALF能降低死 亡率；
(3)早期诊断早期治疗可能会得到较好效果。
2、 BAPTA衍生物对D-氨基半乳糖(D-GalN)致小鼠急性肝衰竭(ALF)的疗效 观察
本实验主要通过以下2个方面，观察BAPTA-AM脂质体对小鼠急性肝功能衰 竭的防治作用
(1)、量效关系研究BAPTA-AM脂质体采用1.28， 1.6， 2, 2.5， 3. 125 mg/kg 五个浓度梯度，探讨不同剂量的BAPTA-AM脂质体对D-氨基半乳糖/脂多糖 (D-GalN/LPS )所致ALF小鼠存活率等疗效指标的影响；
(2 )、治疗时间窗的观察BAPTA-AM脂质体分别在造模后立即在1 、 2、 3、 4 h分别给药，探讨不同给药时间对D-GalN/LPS所致ALF小鼠存活率的影响。 结果表明
模型组小鼠的存活率仅为17.4%，在造模后不同时间点给予BAPTA-AM脂质 体治疗后，小鼠存活率均大大提高，且均有统计学意义。其中以造才莫后立即给药 效果最好，存活率高达71.4%,是模型组的4倍。各时间点给药，相互之间差别 不大。这一结果与CCl4致小鼠ALF;f莫型结果一致应尽可能早期介入；D-GalN/LPS 致ALF小鼠在染毒5 -6 h后开始死亡，说明染毒4 h后ALF已进入严重阶段， 此时给予BAPTA-AM脂质体仍然有较好效果，表明BAPTA-AM脂质体的治疗时间窗较宽，对已进入生命末期的濒死患者，应用BAPTA-AM脂质体有可能挽救生命。
与CCl4致小鼠急性ALF相比，BAPTA-AM脂质体在D-GalN/LPS致ALF模型上 的效果更好些。D-GalN/LPS模型是模拟人病毒性肝炎的主要模型，因此，本模 型的结果参考价值更大。BAPTA-AM脂质体能在很大程度上降低ALF小鼠的死亡 率，延长生存时间。
3、 BAPTA衍生物对酒精性肝损伤的整体作用研究
连续十天酒精灌胃过程中，除正常对照组外，其他各组均有死亡；其中模型 组死亡率最高，达到75°/。。药物治疗各小鼠死亡率均有不同程度的降低，其中2 mg/kg和2.5 mg/kg BAPTA-AM脂质体保护组小鼠死亡率相对于模型组均有显著 性差异(；K 0. 05 )。 BAPTA-AM脂质体按2. 5 mg/kg剂量给药，死亡率最低， 仅为25%,比模型组降低了 66.67%。除阳性药甘草酸二胺组外，死亡时间均集中 在后五天。甘草酸二胺虽有降低死亡率的趋势，但无统计学意义(P> 005 )。总 之，BAPTA-AM脂质体明显优于甘草酸二胺。
实验结束时(dl0)存活的小鼠，采血后处死，取肝计算肝指数，模型组小 鼠肝指数高于正常对照组，且有显著性差异(p< 0. 01 )。肝指数的增大，提 示模型组小鼠因急性炎症、细胞坏死出现肝脏肿大。BAPTA-AM脂质体各剂量保 护组均能有效防止肝指数的增大，与模型组相比，均有统计学意义(p< 0. 05 )。 甘草酸二胺虽有降低肝脏指数的趋势，但无统计学意义。
相对于正常对照组，模型组小鼠的凝血酶原时间明显延长(；？ < 0. 001 )， 表明酒精致肝损伤时动物凝血功能异常。BAPTA-AM脂质体各剂量组小鼠凝血酶 原时间与模型组小鼠相比明显缩短，提示BAPTA-AM脂质体对酒精性肝损伤很好 的保护作用。
4、 BAPTA衍生物减轻HepG-2细胞的化学性损伤
(1 )、 D-GalN和CCh分别作用H印G-2细胞后，HepG-2细胞活性严重受损。 与正常对照组相比，差异非常明显(/ < 0.001 )。 BAPTA-AM脂质体呈剂量依 赖性地减轻细胞损伤。
(2)、 H印G-2细胞受损以后，肝细胞内酶释^L,导致培养上清液中的AST 和ALT水平较正常对照组明显升高。BAPTA-AM脂质体保护组的肝酶活性随 BAPTA-AM脂质体的剂量增大而降低，表明BAPTA-AM脂质体对HepG-2细胞有明显保护作用。
(3) 、与正常组比较，7.5 mmol/L D-GalN作用1 h后，模型组的细胞基 本上被染成红色，提示细胞膜严重损伤，处于细胞凋亡的中晚期；甘草酸二胺组 的细胞被染色的比例相对较小，损伤的细胞基本上处于凋亡早期，少量处于细胞 凋亡的中晚期；10_6 mol/L BAPTA-AM脂质体组的细胞被染色比例最小且处于凋 亡早期。以上结果表明，D-GalN能通过诱导细胞凋亡而损伤肝脏；BAPTA-AM脂 质体则是有效的凋亡抑制剂，其保护肝细胞的作用可能与其抗凋亡有关。
(4) 、采用小剂量D-GalN ( 2 mmol/L )作用于HepG-2细胞，1 h后出现 早期凋亡细胞，随损伤时间的延长，凋亡细胞的比例增加；2h时已有少量细胞 红染(凋亡中晚期)；4 h时大量细胞凋亡；8 h时细胞形态破坏，基本见不 到形态完整细胞；BAPTA-AM脂质体保护组只有少量凋亡，极个别细胞进入凋亡 中晚期，表明BAPTA-AM脂质体对D-GalN诱导的细胞凋亡具有显著的防治作用。
本实验分别采用CCh和D-GalN来复制化学性肝细胞损伤模型。CCl4诱导细 胞损伤后，细胞活性降低，培养上清液中天门冬氨酸转氨酶AST和丙氨酸转氨酶 ALT水平明显升高，与正常的HepG-2细胞均有显著性差异。BAPTA-AM脂质体保 护组，大多数细胞形态正常，细胞活性明显高于模型组，AST和ALT水平明显低 于模型组。台盼兰染色法发现，HepG-2细胞经CCl4致损后，细胞膜破裂，多数 细胞被染成深蓝色，而BAPTA-AM脂质体保护组细胞被蓝染的比例大大降低。同 样，BAPTA-AM脂质体也能逆转D-GalN引起的细胞活性的下降和AST、 ALT水平 的升高。通过Annexin V-EGFP荧光染色和形态学观察发现，D-GalN能诱导H印G-2 细胞出现典型的细胞凋亡，细胞凋亡程度与D-GalN剂量相关，且凋亡程度随着 受损时间的延长而加重。BAPTA-AM脂质体保护组细胞凋亡率降低且多处于凋亡 早期。本实验表明，BAPTA-AM脂质体对HepG-2细胞化学性损伤有明显的保护作 用，其作用;f几理可能与其抗凋亡有关。
5. BAPTA衍生物对D-GalN致损的L-02细胞的保护作用 本实验采用D-GalN来复制肝损伤模型。研究结果发现D-GalN致损L-02 细胞后，细胞内Ca"大大升高，细胞活力下降，培养上清液中丙二醛MDA含量和 乳酸脱氢酶LDH,天门冬氨酸转氨酶AST,丙氨酸转氨酶ALT水平明显升高。相 对于模型组，BAPTA-AM脂质体保护组的细胞活力明显增大，MDA含量和LDH, AST,
9ALT水平也显著下降。通过Annex in V-EGFP荧光染色和形态学观察发现，D-GalN 能诱导L-02细胞出现典型的细胞凋亡，BAPTA-AM脂质体保护组细胞凋亡率较模 型组下降。本结果表明，BAPTA-AM脂质体对D-GalN诱导的L-02细胞损伤有明 显的保护作用。
同时，利用HXB-08研究发现，与正常对照相比，D-GalN模型组的细胞活性 显著降低。HXB-08各组呈现浓度依赖性地减轻细胞损伤，在浓度为l(T7mol/L 时作用最佳，细胞存活率达到97.6%。 Annexin V-EGFP荧光染色发现，HXB-08 对D-GalN诱导的L-02细胞凋亡有明显的抑制作用。因此，与BAPTA-AM脂质体 类似，抗细胞凋亡是HXB-08减轻致D-GalN所致的L-02细胞损伤的机制。
6、总结
BAPTA ^"生物在三种整体^t型上，对急性肝功能衰竭均有4交好的防治作用， 能明显降低ALF小鼠死亡率。这一发现，对尚无有效治疗药物的ALF来说，无疑 有重要意义。
在两种肝细胞离体实验中发现，BAPTA衍生物能够明显抑制化学性损伤引起 的细胞活性下降、提高细胞存活率，防止培养上清液中乳酸脱氢酶LDH、丙氨酸 转氨酶ALT、天门冬氨酸转氨酶AST和丙二醛MDA水平的升高，还能抑制细胞凋 亡和细胞内游离钙浓度的升高。
权利要求
1、BAPTA及其衍生物的用途，其特征在于所述的BAPTA及其衍生物在肝功能衰竭的抢救和治疗药物方面的应用；BAPTA衍生物是指BAPTA酯化产物或苯环有取代基的酯化产物，化学式通式为式中X1-X4是相同的基团，或者是不同的基团，表示CnH2n+1，n＝2-8，或CnH2n+1(OCH2CH2)m，n＝1-18，m＝1-3；A和B表示苯环上的取代基，是H，CHO，COOH，NO2，NHR，CF3，烃基、卤素、或者是烷氧基，两苯环，是对称的，或者是不对称的。
2、根据权利要求1所述的BAPTA及其衍生物的用途，其特征在于所述的 BAPTA双-邻氨苯氧乙烷基-N，N，-N' , N，-四乙酸是一种钙络合剂，用于4全测细 胞内外4丐水平，通过4丐离子对各种细胞功能进行调节。
3、根据权利要求1所述的BAPTA及其衍生物的用途，其特征在于所述的 BAPTA衍生物的化学式为其中X表示d , n=2-8，或CnH2n+1 (0CH线L , n=l-18, m=l-3; A，B表示H,CHO, COOH, N02, NHR， CF3,烃基，囟素或者烷氧基； 两苯环，是对称的，或者是不对称的。
4、根据权利要求1所述的BAPTA及其衍生物的用途，其特征在于所述的 BAPTA衍生物的化学式为其中X表示CAw ， n=2-8，或CnH2n+1 (OCH2CH2)m ， n=l-18， m=l-3; E表示二钠或钓；A,B表示H, CHO， C00H, N02, NHR, CF3，烃基，卣素或者烷氧基， 两苯环，是对称的，或者是不对称的。
5、 根据权利要求1所述的BAPTA及其衍生物的用途，其特征在于所述的 BAPTA衍生物的作用机制是通过其抗细胞凋亡来保护肝细胞，抗细胞凋亡是通过 维持细胞内钙稳态，减轻钙超载来抑制细胞凋亡和细胞内游离钙浓度的升高，抑 制化学性损伤引起的细胞活性下降，来提高细胞的存活率。
6、 根据权利要求1所述的BAPTA及其衍生物的用途，其特征在于所述的 BAPTA及其衍生物用于制造治疗肝功能衰竭药物，可制成片剂、胶囊、注射液或 其他适宜剂型。
全文摘要
本发明公开了BAPTA及其衍生物的一种用途，具体是在肝功能衰竭的抢救和治疗方面的用途。
文档编号A61K31/216GK101632654SQ20091014475
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月31日 优先权日2009年8月31日
发明者付再林, 刘经星, 宋必卫, 伟 魏 申请人:合肥恒星药物研究所