高剂量叶酸盐对心肌缺血的保护作用的制作方法

专利名称：：高剂量叶酸盐对心肌缺血的保护作用的制作方法高剂量叶酸盐对心肌缺血的保护作用本发明涉及高剂量叶酸或等效剂量的叶酸的一种生物学活性衍生物用于在缺血期间减轻心肌功能障碍以及用于改善再灌注后损伤的用途。本发明特别地涉及通过在主动缺血(activeischemia)期间、在再灌注之前施用至少200mg的高剂量叶酸、或等效剂量的衍生物来进行的早期治疗。在急性冠状动脉闭塞期间，心肌灌注和氧输送变得不足以支持主动肌肉收缩。在缺血区域中，心肌的高能磷酸含量降低，而无机磷酸盐增加，且组织呈现酸中毒(Jennings和Steenbergen，1985)，导致区域性动力障碍和全面性功能障碍。缺血之后的冠状动脉再灌注减少组织损伤，但是由于活性氧物质(ROS)、钙依赖性蛋白酶例如钙蛋白酶(calpain)、肌丝挛缩、微血管功能障碍和炎性细胞因子的活化而产生毒性(Gross和Gross，2006)。缺血期间的ATP耗竭也可能有助于再灌注伤害(Gunduz等人，2006)。另外，在缺血(Klawitter等人，2002)和再灌注(Zweier和Talukder，2006)期间都生成的ROS被认为起到重要作用，并且已经试验了多种抗氧化剂策略来抵销这种损害。限制缺血/再灌注损害的一个方法是使心脏在更长时间暴露之前经历短暂缺血，这一现象被称为缺血预适应(ischemicpre-conditioning)。这涉及多重机制，包括蛋白激酶C活化(Yamamura等人，2005)、线粒体Katp通道的刺激、和增强的一氧化氮合成(Jones和BoIIi，2006)，而后者起到主要作用。在eNOS缺乏小鼠中，缺血-再灌注之后的梗塞面积更大(Jones等人，1999)，但是在过度表达eNOS的小鼠中减小(Jones等人，2004)。在NOS由于其专性辅助因子四氢生物蝶呤(BH4)的耗竭/氧化而变得功能性解偶联时，发生NO合成的减少和由NOS生成ROS增加(Hevel和Marietta，1992；Vasquez-Vivar等人，1998)。NOS在IR损伤中的潜在作用导致了要增强酶功能的尝试，包括体外给予BH4(Wajima等人，2006)。成本上小得多的备选方案可能是叶酸(FA)，叶酸是一种对于正常的线粒体蛋白质和核酸合成是重要的B族维生素(Depeint等人，2006)，但是叶酸还通过增加BH4对eNOS的结合亲合力而使BH4稳定化(Stroes等人，2006；Hyndman等人，2002)并增强从被氧化的和非活性的BH2再生BH4。FA或其活性代谢物(5-甲基四氢叶酸盐(5-MTHF))改善内皮功能(Verhaar等人，1998；Shirodaria等人，2007；Moat等人，2006)。已经在患有心血管系统疾病的中试验了低剂量的FA，但是最近试验FA用于慢性心血管危险降低的应用的临床研究有些令人失望(Bazzano等人，2006)并且当然不是结论性的。实际上，已经在临床试验中对FA进行研究，尤其是检测其降低心肌血管病患者的心血管危险的潜力。例如，Oster(1981)证明了以远高于通常使用剂量的剂量(40_80mg/天)进行长期叶酸治疗(10年)在冠状动脉病患者中降低心肌梗死、心绞痛的发生率以及减少对硝酸甘油的需要。这个观察结果没有得到安慰剂对照试验的证实，也没有探索其机制。其它研究集中在FA降低同型半胱氨酸的能力，并发现血清同型半胱氨酸有3μmol/Ι的减少(可使用0.8mg/d的剂量实现)。尽管有这些积极的结果，但是用于心血管预防的多重FA试验的荟萃分析是不令人信服的(JAMA2002；Wang等人，2007；WaId等人，2006)并且仍是不清楚的，需要剂量、研究持续时间、目标群体、或其它因素来对其进行解释。与本发明的剂量相比，用于先前心血管干涉研究(5-25mg/70kg/d)或预防试验(500μg_lmg)的剂量是低的。W00130352描述了30_500mg叶酸盐、优选30_100mg叶酸盐的剂量，用于治疗高同型半胱氨酸血症(hyperhomocystemia)。虽然高同型半胱氨酸血症被认为是心血管疾病的一个危险因素，但是高水平的同型半胱氨酸如何导致心血管疾病的机理是未知的，且该申请没有描述对心血管疾病本身有任何影响，尤其是在患者并未患有高同型半胱氨酸血症时。W02006113389描述了用于改善血管扩张的方法，包括对受试者给予高剂量(20-100mg)的叶酸，并且声称20-100mg的日剂量可以延迟单独的心脏病的发展或使其最小化。没有关于通过这种治疗可以减轻缺血期间的心肌功能障碍以及可以改善再灌注后损伤的表示。令人惊讶地，我们发现再灌注之前缺血期间的高剂量(至少200mg/受试者)FA预处理和/或处理可以改善IR损伤，并探索了这种作用的机理。数据显示了再灌注后的利益，但是更引人侧目的是揭示了FA-预处理对于在缺血期间减少局部和心室功能障碍以及ROS生成的显著的和令人惊讶的作用。这种利益似乎与缺血期间嘌呤分解代谢的改变以及高能磷酸盐水平的维持有关。在这个研究中，我们首次证明了使用高剂量的口服叶酸进行预处理显著地降低冠状动脉闭塞期间缺血性功能障碍的严重程度，以及在再灌注之后增强功能和减小梗塞面积。这些作用与缺血期间尽管血流减少但高能磷酸得以维持、改善整体和局部功能、减少坏死和氧化应激、以及在再灌注时保持eNOS偶联有关。FA预处理在冠脉血流量显著减少的情况下帮助维持心肌收缩的能力是不平常的，并且完全不同于抗氧化剂和经典的预适应剂的影响。这些典型地在缺血过程中几乎没有效果，但是在心脏再灌注后产生利益。在这方面，FA对于即使在缺血开始之后递送仍能减小梗塞面积的利益是一种不同的机理。本发明的第一方面是至少200mg、优选至少600mg、更优选至少IOOOmg的高剂量叶酸或等效剂量的叶酸衍生物用于在缺血过程中减轻心肌功能障碍和/或用于改善再灌注后损伤的用途。此处使用的叶酸衍生物是本领域技术人员已知的，包括但不限于叶酸盐和5-甲基四氢叶酸盐。此处使用的心肌功能障碍包括但不限于心肌收缩力减弱、心肌细胞死亡和/或由梗塞诱导的心律不齐。一个优选实施方案是高剂量叶酸或等效剂量的叶酸衍生物的用途，其中所述的心肌功能障碍是心肌收缩力减弱，另一个优选实施方案是高剂量叶酸或等效剂量的叶酸衍生物的用途，其中所述的心肌功能障碍是心肌细胞死亡。再一个优选实施方案是高剂量叶酸或等效剂量的叶酸衍生物的用途，其中所述的心肌功能障碍是由梗塞诱导的心律不齐。优选地，所述高剂量作为单一剂量给予。更优选地，所述剂量在缺血期间、在再灌注之前给予。在一个优选实施方案中，所述给药是经口给药。在另一个优选实施方案中，所述剂量通过静脉内注射给药。或者，所述剂量可以经皮或通过肌肉内注射给予。本发明的另一个方面是至少200mg、优选至少600mg、更优选至少IOOOmg的高剂量叶酸、或等效剂量的叶酸衍生物在再灌注之前在主动缺血期间作为早期处理的用途。此处使用的早期处理是指在主动缺血开始之后、但是在再灌注之前起动的处理。优选地，所述高剂量作为单一剂量给予。更优选地，所述剂量在再灌注之前在缺血期间给予。在一个优选实施方案中，所述给药是经口给药。在另一个优选实施方案中，所述剂量通过静脉内注射给药。或者，所述剂量可以经皮或通过肌肉内注射给予。本发明的再一个方面是一种药物组合物，包含可能与可药用媒介物组合的单一剂量的至少600mg的叶酸、更优选单一剂量的至少IOOOmg的叶酸、或等效剂量的叶酸衍生物。此处使用的药物组合物可以是适合于注射的液体组合物，或者是用于经口摄入的固体组合物。本发明的再一个方面是叶酸或等效剂量的叶酸衍生物作为心脏保护剂或治疗剂用于在具有降低的ATP/ADP水平的心血管病症中改善或恢复降低的高能磷酸盐水平的用途。优选地，所述叶酸的使用是以高剂量使用。更优选地，所述高剂量为至少200mg，最优选为至少600mg。此处使用的改善是指通过该处理使高能磷酸盐水平增加，但是并非意味着增加到健康人的正常水平。此处使用的恢复是指处理之后的高能磷酸盐水平可与健康人的高能磷酸盐水平相比较，或者更高。图1通过压力-容积环分析测量的心脏功能。A]安慰剂(上图)和FA预处理(下图)动物在基线(1)、缺血末期(2)、和90分钟再灌注(3)时的压力-容积环的实例。FA预处理在缺血期间和再灌注之后都改善功能。B]对于完全IR规程的概括性血流动力学示出了心脏收缩和心脏舒张参数的时程，(P值来源于重复测量的AN0VA，时间χ处理相互作用/处理效果)。图2开胸超声波心动描记法。左上图示出了在安慰剂和FA处理组中在基线和在缺血30分钟之后的M-模式超声波心动描记法的实例。概括图示出了得自这些超声心电图对时间的结果。射血分数和前间隔壁变厚在安慰剂组中出现减弱，但是在FA组中没有变化(P值用于通过RMAN0VA进行的处理效果)。图3高能磷酸盐(HEP)代谢和氧化还原态的HPLC-参数分析。在基线条件下，FA预处理不改变HEP(ATP、ADP、AMP)，但是确实增加了肌醇单磷酸(IMP)及其代谢产物(羟基嘌呤黄嘌呤，次黄嘌呤和尿酸)。在缺血30分钟之后，与安慰剂动物相比，在用FA处理的心脏中HEP水平得到较好的维持。而在用安慰剂处理的动物中，在缺血之后羟基嘌呤显著增长，但是在用FA处理的大鼠中没有观察到这一现象。P值来源于双向AN0VA，第一个数值表示缺血的影响，第二个数值表示试验组和缺血之间的相互作用。图4叶酸对心肌坏死的影响A]口服(7天)FA预处理在体内减小梗塞面积C=P<0.001；Marm-Whitney)。上图危险区(AAR)在所有组之间都是可比较的。中图表示为％AAR的梗塞面积在所有FA组中都显著减小。下图在心肌坏死和AAR之间的个体相关性的绘解。B]FA预处理在体内减少了收缩带坏死Γρ=0.001)。C]FA预处理在体内减少细胞凋亡(TUNEL-染色)Γρ=0.005和ρ=0.001)。D]FA预处理在体外研究中使心脏的心肌坏死减少80%。Γ:p<0.0001)。Ε]缺血-再灌注之后的增加的乳酸脱氢酶(LDH)在10-20分钟达峰，而接受FA预处理的心脏具有最小的LDH释放。(ρ<0.001)。图5:FA处理对ROS生成的影响。A]光泽精增强的过氧化物检测显示用FA预处理显著降低缺血和IR诱导的过氧化物。B]在对照-媒介物处理的IR心脏中02_形成显著地受到BH4紧急附加的抑制，而这在得自FA-预处理的心脏的心肌提取物中被几乎减轻一半。C-D]DHE和E]DCF染色的心肌层显示，在缺血或IR心肌层中的增加的ROS生成，所述增加的ROS生成在接受FA预处理的心脏中显著降低。F]FA与Tempol相比的直接抗氧化剂作用。过氧化物在体外由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶生成，并在添加不同浓度的FA或tempol的情况下通过光泽精增强的化学发光来测量。图6=FA预处理对NO-通道的影响A]SDS-Page凝胶显示IR心肌层中eNOS单体增加，FA预处理使所述eNOS单体的增加朝着对照水平降低。B-C]图A中所示的凝胶分析的概括性密度测定法数据。FA预处理降低单体/二聚体比例，但是对总eNOS蛋白质表达没有影响。D]在IR之前和之后在体外对心脏给予缓激肽显示出内皮依赖性的血流响应显著变弱。这通过用FA预处理恢复到正常响应。E]FA处理不影响血流对硝普钠的响应，支持了用缓激肽观察到的差异是内皮依赖性的。实施例实施例的材料和方法伦理委员会实验根据由USNationalInstituteofHealth出版的GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals(NIH—Publication，N085—23)it^ff,^SEthicalCommitteesoftheUniversityofAntwerp以及由JohnsHopkinsMedicalInstitutions批准。体内缺血模型在进行缺血/再灌注(IR)实验之前，使成年Wistar大鼠通过口服灌胃接受FA(10mg/天，除非另有说明)或安慰剂，持续7天。总共使用131只大鼠，样本大小反映不能在每只动物中执行多重测定的要求，而是更适合以整个组的不同子集来获取。将动物麻醉(戊巴比妥，60mg/kg)，经由气管切开术插管并通气(HarvardApparatus，ΜΑ)。监控ECG并保持温度为37.5°C。通过第4-5肋间隙使左侧前支动脉暴露并在其周围位置缝合，进行短暂冠状动脉结扎30分钟，进行(η=85)或不进行(η=46)90分钟的再灌注。在接受再灌注的动物的一个小组(η=9)中，在LAD闭塞开始之后10分钟提供作为IV-快速浓注递送的FA(即，在再灌注开始之前20分钟)。体内血流动力学在缺血期间和在随后的再灌注期间通过压力-容积环进行LV功能的体内评价(η=14)。使1.4F压力-容积导管(SciSense，London-Ontario,Canada)前进通过顶尖，沿着纵轴定位，并连接于刺激器/分析器(10X1.8.9.19，EmkaTech.，Paris)。利用高渗盐水方法校准容积数据，假定增益=1。在缺血期间有两只动物的导管脱位，它们的容积数据未予使用。还使用装备有15MHz线性传感器的Sequoia-AcusonC256(SequoiaC256EchocardiographySystem,AcusonCorporation,MountainView,CA)如所述在左心室的胸骨切面测量开胸心肌前壁运动。氧化还原和能量代谢的评价将得自前壁(士FA预处理；士30分钟缺血，没有再灌注)的快速冷冻样品(n=24)去蛋白质化，并进行反映组织氧化还原和能量状态的水溶性低分子量化合物的HPLC分析。如所述(Takimoto等人，2005)通过离子对HPLC测量高能磷酸盐、羟基嘌呤(次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸)、核苷(肌苷和腺苷)、丙二醛、以及还原型和氧化型谷胱甘肽。6心肌流量测量通过在基线和在缺血5分钟和30分钟之后在左心房注射核活化的微球体(15μM直径，BioPal,Worcester,ΜΑ)(0.3ml,2.5*106球/ml)来评价局部心肌血流(η=12)(Reinhardt等人，2001)。将每分钟总计数(cpm)相对于重量标准化，并将得自缺血区域的结果相对于远距离区域标准化以便提供缺血之前和缺血期间的相关血流量。体外IR模型将成年Wistar大鼠(η=28)麻醉(戊巴比妥，60mg/kg)，迅速切除心脏并安装在逆行灌注体系(Emka，Paris，France)上，该体系以恒定灌注压力(75mmHg)使用温热的、用氧处理过的、经过缓冲的Krebs-Henseleit溶液。将心脏以300bpm定速并保持为无负载状态。通过在线超声波流探针(TransonicSystems,Ithaca,NY,USA)测量冠脉血流量。在30分钟的平衡之后，通过快速浓注(50μ1，10_8-10_55Μ，i.e.)灌输血管扩张药(缓激肽和硝普钠)并以恒定的灌注压力评价冠脉血流储备。在重建基线之后，心脏接受FA(4.510_6M，i.c.)或媒介物，持续30分钟。然后，心脏经历40分钟的零冠脉血流，随后进行40分钟的再灌注。收集冠状动脉流出物，浓缩(Sartorius-Sipan，Lier,Belgium)并分析乳酸脱氢酶(Vitros950AT,0.C.D.，Beerse,Belgium)。在再灌注之后重复确定对相同的两种药物的冠状动脉血管扩张剂响应。梗塞面积分析和组织学在31只大鼠中评价了梗塞面积，通过用在冠状动脉闭塞期间注射伊文思蓝进行的负染色测定危险区(AAR)，并且随后用TTC染色以探测心肌坏死。通过测面积法(SoftImagingsystemGmbH,Analysisproversion3.00)IlJfiLV($SH+)>AAR(^染色的伊文思蓝)和坏死区(TTC-白色)，并对数字化图象进行相等的背景扣除、亮度和对比度增强，以便改善清晰度和锐度。对于体外试验，因为产生全面性缺血，在TTC染色之前不进行伊文思蓝染色。在被固定在Carnoy溶液并用Masson三色染色法染色的活体内大鼠心脏(η=22)中评价收缩带坏死。遍及整个LV检查顺次相邻的视野，以计算具有收缩带存在的心肌层百分比。执行相似的分析确定TUNEL-阳性(ChemiconIntern,Temecula,CA),也表示为LV面积百分比。ROS测定通过光泽精(5μM)-增强的化学发光(Beckman1^60001(，11=23)22和荧光显微局部图像法(二氯二氢_荧光素二乙酸酯，DCF,η=16)和二氢乙锭，DHE,η=24)(Gupte等人，2005)来评价过氧化物。使用体外黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统(Antoniades等人，2006)分析叶酸的直接抗氧化剂作用并与Tempol相比较。eNOS单体/二聚体形成和酶活性如前所述(Takimoto等人，2005)使用低温SDS-PAGE对缺血/再灌注组织(η=16)进行SDS-抗性eNOS二聚体和单体的测定。通过对得自冷冻心肌(η=15)的提取物进行精氨酸到瓜氨酸转化试验来评价NOS酶活性(Takimoto等人，2005)。数据分析数据表示为平均数士sem，ρ值<0.05认为是统计显著。通过重复测量ANOVA来分析冠脉血流储备和体内血液动力学数据。其它比较使用单通道ANOVA或克鲁斯凯-沃利斯检验进行多个独立组之间的比较，多重比较采用Bonferroni校正。分析利用了SPS611.O版(Chicago,IL)。实施例1叶酸预处理改善I/R的心脏功能图IA示出了在有或者没有FA(10mg/d)预处理的情况下心脏中的实例PV关系以及收缩性和舒张性心室功能。数据是在开胸大鼠中在初始基线、在30分钟的冠状动脉闭塞期间、以及在再灌注90分钟之后测量的。对照心脏显示显著降低的心脏功能，在LAD闭塞30分钟后PV环向右下漂移，并在再灌注之后持续(上图)。采用FA预处理，心脏收缩和心脏舒张功能在缺血和再灌注期间都得到较好保持(下图)。概括性数据(图1B)支持了这些实例。在FA预处理的大鼠中，尽管LAD闭塞，但是峰LV压力(即，收缩压)变化很小，而在对照中几乎下降25%。在dP/dtmax中观察到类似的不一致。在FA预处理的动物中，心输出量和每搏功也较少下降，特别是在缺血和再灌注的后期。因此，通过FA预处理在缺血性期间以及再灌注之后增强了心脏功能。在缺血期间的整体功能的相对维持有些令人惊讶，并且提示在用FA预处理的心脏中有局部功能障碍，尽管冠状动脉闭塞。为了对此进行检验，我们进行了开胸超声波心动描记法来测量在LAD闭塞30分钟期间的壁变厚和功能障碍的时程(图2)。实例的M-模式描图(左上图)显示在对照组中在缺血期间前壁变厚显著降低，但是在用FA处理的动物中变厚得到保持。尽管缺血，射血分数仍高得多(72.8士1.2%对安慰剂的27.4士2.2%，P<0.001，30分钟)，这与PV环结果一致，前间隔变厚也是这样(37.士5.3%对安慰剂的5.1士0.6%，p=0.004)。因此，尽管冠状动脉闭塞，FA预处理增强缺血区域中的局部功能障碍，并且这在再灌注之后得到持续或进一步改善。实施例2叶酸和心肌血流因为FA预处理在LAD闭塞期间既改善局部功能又改善整体功能，我们试验了它是否增强心肌血流以减少缺血性损伤本身。然而，在LAD结扎5分钟之后，在安慰剂和FA预处理组中，通过微球体分析获取的缺血性区域/远距离区域心肌灌注的比例都类似地出现下降(分别为-73.7士6.0%和-77.7士5.)。在30分钟时，两个组中都保持了低血流(与远距离地区相比为-78.4士9.3%对安慰剂的-71.2士13.8%)。实施例3叶酸保持心肌的高能磷酸盐水平因为改善的灌注不能解释FA处理的作用，我们接下来试验了FA是否改变高能磷酸盐(HEP)在基线以及特别是在缺血期间的代谢。如图3所示，FA预处理没有改变基线的HEP，但是确实提高了肌醇单磷酸(IMP)及其代谢产物(羟基嘌呤黄嘌呤，次黄嘌呤和尿酸)的水平。在缺血期间，在对照中心肌的ATP和ADP下降超过66%，这与报告的变化一致\然而，在FA预处理的心脏中二者都以较高水平得以保持(ρ<0.001，FA处理和缺血性响应的相互作用)。在对照中，缺血期间的羟基嘌呤显著地上升，这与HEP减少和AMP分解代谢增强一致；然而，在FA处理的心脏中它们几乎没有变化或有所下降。最后，我们考查了通过丙二醛(脂质过氧化的指示物)和相对的还原型/氧化型谷胱甘肽比例所指示的氧化还原状态。在有或者没有心肌缺血情况中，FA预处理使二者都改变很小。实施例4叶酸预处理降低心肌梗塞面积改善缺血期间的功能和HEP代谢的潜在后果是随后的梗塞面积减小。如图4A中所示，在安慰剂处理的动物中，梗塞面积是60.3士4.1危险区，而FA预处理中为3.8士1.2%(P<0.002)。在单独的研究中，我们发现通过主要FA剂量的40%、甚至10%(即，1和4mg/8d)预处理时出现这种梗塞面积的下降。在媒介物处理的心脏中在26.7士2.6%的LV中观察到再灌注收缩带坏死，而在FA处理的心脏中为4.6%士1.2%(ρ=0.001，图4B)。类似地，在媒介物处理中，TUNEL-阳性的肌细胞占优势(63.0士5.8%的LV视野)，但是在FA处理中是罕见的(4.3士1.3%)(ρ=0.001，图4C)。在对照大鼠中，缺血引起36.7%的致命性室律不齐(对FA处理大鼠的8.3%)，而在对照中6.1%发生再灌注心律不齐，在FA处理的动物则没有(两种情况中都是ρ<0.01)。因为活体再灌注后梗塞面积部分地涉及功能与冠状动脉灌注的偶联，我们还在分离的心脏中检验了FA预处理的影响。FA显著地降低梗塞面积(分别为7.7士2.8%对41.1士4.9%，ρ<0.0001,图4D)，且冠状动脉流出物中乳酸脱氢酶较少(图4Ε)，这与细胞坏死减少一致。实施例5叶酸盐预处理对急性叶酸盐给药在9只动物的单独的组中，在冠状动脉闭塞10分钟之后给予FA(IOmgi.v.)，该时间是功能性响应似乎首次出现分歧的时间(参考图1、图2)。有趣的是，观察到了与AAR有关的梗塞面积减少(η=5；3.0士2.2%，相对安慰剂ρ<0.001)的类似利益，而AAR本身与安慰剂(52.4士5.5%)相似。对四只动物进行了组织学，显示TUNEL染色(4.3士1.3%LV，相对安慰剂ρ<0.0001)和收缩带坏死(5.1士0.7%LV，相对于安慰剂ρ<0.001)减少。因此，FA对梗塞减少的影响看来不是经典的预处理作用，因为它可以在已经开始缺血之后由FA给药产生。实施例6叶酸盐预处理减少ROS生成在缺血期间以及在再灌注90分钟之后，FA预处理动物中的心肌过氧化物(光泽精化学发光)几乎下降50%(图5Α)。在将提取物与100μM的BH4预温育时，在媒介物处理的心脏中，O2-生成下降90.9士0.7%，但是在FA预处理的心脏中下降没有那么多(52.1士11.3%，ρ<0.03，图5Β)。这提示，在FA预处理的心脏中没有由BH4靶向的抗氧化剂通道(例如，NOS偶联)或已经通过FA治疗而得到改进。通过氧化性荧光显微局部图像来进一步考查FA对缺血和IR诱导的ROS的影响。DHE和DCF染色的心肌切片都显示在安慰剂组中有显著的ROS生成，所述ROS生成被FA预处理所减少。图5C-E示出了实例图像，以每组η=4获取平均数据并与这些实例相符合。为了检测FA的潜在的直接氧化剂作用，我们用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶02_生成系统进行了体外测定(图5F)。在这个试验中，FA具有显著的抗氧化剂作用，与得自过氧化物歧化酶模拟物Tempol的结果相似。实施例7叶酸盐预处理改善eNOS二聚和活性、以及内皮功能已知FA及其活性代谢物5-MTHF在机械学上与由BH4介导的NOS功能改善有关，包括减少NOS由来的过氧化物，我们考查了FA是否影响I/R心脏中的NOS偶联。图6A示出了具有单体带(HOkDa)和二聚体带(280kDa)的eNOS的实例免疫印迹。在不同条件中，总的eNOS(二者之和)是相似的(图6B)，然而在用媒介物处理的IR心脏中二聚体/单体的比例下降，反映了NOS解偶联(p<0.001，图6C)，但是FA预处理的心脏接近正常值。然而通过精氨酸-瓜氨酸转化测量的NOS活性是不明确的，在处理的和未处理的心脏中没有得到显著改善(P=0.08，未示出)。FA预处理还改善冠状动脉的内皮功能。在分离的对照心脏中，缓激肽诱导冠脉血流量发生最大108.3士9.2%升高，但是在IR之后只有67.1士8.1%(ρ<0.001，图6D)。在用FA预处理的心脏中，这被修复到对照水平(122.0士11.3%)，在基线舒张方面没有任何变化。在各组之间，基线(安慰剂10.2士0.7ml/min，FA:11.4士13.8ml/min，ρ=0.5)或缺血之后(安慰剂9.8士0.7ml/min，FA:8·9士1.4ml/min，ρ=0.5)的冠脉血流量没有变化。与缓激肽剌激相对比，使用硝普钠时在对照和缺血性条件中冠脉血流量类似地增加(图6Ε)，支持了前述作用的内皮依赖性。参考文献-AntoniadesC，ShirodariaC，WarrickN，CaiS，deBonoJ，LeeJ，LeesonP，NeubauerS，RatnatungaC，PillaiR，RefsumH，ChannonKM.5-methyltetrahydrofalaterapidlyimprovesendothelialfunctionanddecreasessuperoxideproductioninhumanvessels:effectsonvasculartetrahydrobiopterinavailabilityandendothelialnitricoxidesynthasecoupling.Circulation.2006;114:1193_1201.-BazzanoLA,ReynoldsK，HolderKN，HeJ.Effectoffolicacidsupplementationonriskofcardiovasculardiseases:ameta-analysisofrandomizedcontrolledtrials.JAMA.2006；2962720-2726.-DepeintF,BruceWR,ShangariN,MehtaR,0'BrienPJ.Mitochondrialfunctionandtoxicity:roleofBvitaminsontheone-carbontransferpathways.ChemBiolInteract.2006；163:113_132.-GrossER,GrossGJ.Ligandtriggersofclassicalpreconditioningandpostconditioning.CardiovascRes.2006；70:212_22L-GunduzD，KasseckertSA，HartelFV，AslamM，AbdallahY，SchaferM，PiperHM，NollT，SchaferC.AccumulationofextracelIularATPprotectsagainstacutereperfusioninjuryinratheartendothelialcells.CardiovascRes.2006；71764-773.-GupteSA,KaminskiPM，FloydB，AgarwalR，AIiN，AhmadM，EdwardsJ,WoNnMS.CytosolicNADPHmayregulatedifferencesinbasalNoxoxidase-derivedsuperoxidegenerationinbovinecoronaryandpulmonaryarteries.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2005；288:H13_H21.-HevelJM,MariettaMA.Macrophagenitricoxidesynthaserelationshipbetweenenzyme-boundtetrahydrobiopterinandsynthaseactivity.Biochemistry.1992；317160-7165.-HyndmanME，VermaS，RosenfeldRJ，AndersonTJ，ParsonsHG.Interactionof5-methyltetrahydrofolateandtetrahydrobiopterinonendothelialfunction.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2002；282:H2167_H2172.-JAMA!Homocysteineandriskofischemicheartdiseaseandstroke:ameta-analysis.JAMA.2002；288:2015_2022.-JenningsRB，SteenbergenC,Jr.Nucleotidemetabolismandeellulardamageinmyocardialischemia.AnnuRevPhysiol.1985；47:727_749·-JonesSP，BoIIiR.Theubiquitousroleofnitricoxideincardioprotection.JMoICellCardiol.2006；40:16_23·-JonesSP，GirodWG,PalazzoAJ，GrangerDN，GrishamMB，Jourd'HeuilD，HuangPL，LeferDJ.Myocardialischemia-reperfusioninjuryisexacerbatedinabsenceofendothelialcellnitricoxidesynthase.AmJPhysiol.1999；276H1567-H1573.-JonesSP，GreerJJ,KakkarAK,WarePD,TurnageRH,HicksM，vanHaperenR，deCromR，KawashimaS，YokoyamaM，LeferDJ.Endothelialnitricoxidesynthaseoverexpressionattenuatesmyocardialreperfusioninjury.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2004；286:H276_H282.-KlawitterPF,MurrayHN,ClantonTL,AngelosMG.Reactiveoxygenspeciesgeneratedduringmyocardialischemiaenableenergeticrecoveryduringreperfusion.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2002；283:H1656-H1661.-MoatSJ,ClarkeZL,MadhavanAK,LewisMJ,LangD.Folicacidreversesendothelialdysfunctioninducedbyinhibitionoftetrahydrobiopterinbiosynthesis.EurJPharmacol.2006；530:250_258.-OsterK.Atherosclerosistreatedwithfolicacid.FASEBJ.1981；40.-ReinhardtCP,DalhbergS,TriesMA,MarcelR，LeppoJA.Stablelabeledmicrospherestomeasureperfusion!validationofaneutronactivationassaytechnique.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2001；280:H108_H116.-ShirodariaC，AntoniadesC，LeeJ，JacksonCE，RobsonMD，FrancisJM,MoatSJ,RatnatungaC，PillaiR，RefsumH，NeubauerS，ChannonKM.Globalimprovementofvascularfunctionandredoxstatewithlow-dosefolicacid!implicationsforfolatetherapyinpatientswithcoronaryarterydisease.Circulation.2007；1152262-2270.-StroesES,vanFaassenEE，YoM，MartasekP，BoerP，GoversR，RabelinkTJ.Folicacidrevertsdysfunctionofendothelialnitricoxidesynthase.CircRes.2000；86:1129_1134·-TakimotoE，ChampionHC,LiM，RenS，RodriguezER,TavazziB，LazzarinoG，PaolocciN，GabrielsonKL，WangY，KassDA.Oxidantstressfromnitricoxidesynthase-3uncouplingstimulatescardiacpathologicremodelingfromchronicpressureload.JClinInvest.2005；115:1221-1231.-Vasquez-VivarJ，KalyanaramanB，MartasekP，HoggN，MastersBS，KarouiH,TordoP，PritchardKA,Jr.Superoxidegenerationbyendothelialnitricoxidesynthase:theinfluenceofcofactors.ProcNatlAcadSciUSA.1998；95:9220_9225.-VerhaarMC，WeverRM,KasteleiηJJ,vanDamT，KoomansHA,RabelinkTJ.5-methyltetrahydrofolate,theactiveformoffolicacid,restoresendothelialfunctioninfamilialhypercholesterolemia.Circulation.1998;97:237-241·-WajimaT，ShimizuS，HiroiT，lshiiM，KiuchiY.Reductionofmyocardialinfarctsizebytetrahydrobiopterin:possibleinvolvementofmitochondrial11KATPchannelsactivationthroughnitricoxideproduction.JCardiovascPharmacol.2006；47243-249.-WaIdDS,WaIdNJ,MorrisJK,LawM.Folicacid,homocysteine,andcardiovasculardiseasejudgingcausalityinthefaceofinconclusivetrialevidence.BMJ.2006；333:1114-1117.-WangX,QinX,DemirtasH,LiJ,MaoG,HuoY,SunN,LiuL,XuX.Efficacyoffolicacidsupplementationinstrokeprevention:ameta_analysis.Lancet.2007；3691876-1882.-YamamuraK,SteenbergenC,MurphyE.ProteinkinaseCandpreconditioning:roleofthesarcoplasmicreticulum.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2005；289:H2484_H2490.-ZweierJL,TalukderMA.Theroleofoxidantsandfreeradicalsinreperfusioninjury.CardiovascRes.2006；70181-190.权利要求至少200mg的高剂量叶酸或等效剂量的叶酸衍生物用于在缺血期间减轻心肌功能障碍以及用于改善再灌注后损伤的用途。2.权利要求1的至少200mg的高剂量叶酸或等效剂量的叶酸衍生物的用途，其中所述心肌功能障碍是心肌收缩力减弱。3.权利要求1的至少200mg的高剂量叶酸或等效剂量的叶酸衍生物的用途，其中所述心肌功能障碍是心肌细胞死亡。4.权利要求1的至少200mg的高剂量叶酸或等效剂量的叶酸衍生物的用途，其中所述心肌功能障碍是由梗塞诱导的心律不齐。5.至少200mg的高剂量叶酸或等效剂量的叶酸衍生物在再灌注之前在主动缺血期间作为早期处理的用途。6.权利要求1-5的用途，其中所述高剂量为至少600mg。7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述高剂量经口给药。8.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述剂量通过肌肉内、静脉内或透皮给药。9.药物组合物，包含可能与可药用媒介物组合的单一剂量的至少600mg的叶酸或等效剂量的叶酸衍生物。10.叶酸作为心脏保护剂或治疗剂用于在具有降低的ATP/ADP水平的心血管病症中改善或恢复降低的高能磷酸盐水平的用途。全文摘要本发明涉及高剂量叶酸或等效剂量的叶酸的一种生物学活性衍生物用于在缺血期间减轻心肌功能障碍以及用于改善再灌注后损伤的用途。本发明特别地涉及通过在主动缺血期间、在再灌注之前施用至少200mg的高剂量叶酸或等效剂量的衍生物来进行的早期治疗。文档编号A61P9/00GK101939007SQ200980104388公开日2011年1月5日申请日期2009年2月6日优先权日2008年2月6日发明者安·L·莫恩斯申请人:安特卫普大学;百奥麦布斯特公司