专利名称：通过色谱分离制备(6s)叶酸衍生物的工业方法
技术领域：
本发明涉及一种通过在柱上，用色谱方法分离非对映异构体混合物来制备(6S)叶酸衍生物的工业方法，特别地涉及一种制备这里分别称为“MTHF”和“FTHF”的5-(甲基)-(6S)-四氢叶酸和5-(甲酰)-(6S)-四氢叶酸的工业方法。MTHF和FTHF是生理大分子，它们连同不稳定的6，10-亚甲基-四氢叶酸和四氢叶酸，构成了活体内叶酸的活性形式，通常称为叶酸共因子。
从药物学的观点来看，MTHF和FTHF可用于各种形式的叶酸盐缺乏症，作为通常的肝保护剂，更近一些时期以来，用于抗肿瘤药物。
MTHF和FIHF以及常用的药物学上可接受的衍生物用下式
其中X＝CH3或CHO和R1和R2是H，NH+4，碱金属和碱土金属，R1和R2可以彼此相同或彼此不同。
具有式(Ⅰ)的化合物含有两个不对称的碳原子，因此可以四种非对称异构体形式存在。
众所周知，通常当存在立体异构体的药物形式时，它们中只有一种是活性的，另一些则是非活性的，甚至是有害的。在本发明中，众所周知的活性形式是(6S)。
进行了一些研究，涉及工业上制备和/或分离两种非对称异构体，以及直接合成(6S)形式。
由于最终产品的结构脆弱性，立体定向合成MTHF和FTHF的(6S)形式，以及分离两种(6R，S)非对称异构体显露出困难。
在GB-A-1，572，138专利和CH-A-496，012专利中，分别描述了MTHF和FTHF的立体异构混合物的合成。
为了分离如此获得的(6S)非对称异构体，有可能将立体异构体转变为相应的5-甲氧羰基衍生物或者转变成为其它的具有手性中心的衍生物以这样一种方式，利用在适宜的溶剂中的不同的溶解度，有可能将两种非对映异构体(6R)和(6S)分开(JCS，CHEMCOMM470，1987;EP0266042)。
但是所说的方法有点复杂，而且产率极低。
另一种分离的方法基于，或者(6R，S)混合物(EP0，367，902;WO8808，844)或者它们的中间体(EP348，841)的多重结晶，但产率总是很低。
近来，通过部份结晶和任选地水解或减少5，10-亚甲基-(6R，S)四氢叶酸中间体，获得了MTHF和FTHF的立体异构体混合的的分离(US5006655)。该中间体难于处理，并且使其与有害有毒的溶剂如甲酸相隔离。
一种用于分离(6S)形式的方法公开在PCT/EP88/00341(WO88/08844)上，其中立体异构体混合物的钙盐或镁盐的溶液用一种胺来处理，阳离子盐作为草酸盐发生沉淀，并且通过部分结晶化和再转化成为钙盐或镁盐而得到所要求的产品。
表现的产率相当低，并且该方法涉及几个成盐和结晶步骤。
在一个进一步的分离工艺中，加入外消旋的混合物，如钙盐(EP367，902)，连同一些有机和无机盐，特别是碘化钠，于是获得一种产品，其纯度很高，但是产率又相当差，这从工业的观点来看确实是无意义的。
有关分离FTHF异构体的进一步的方法，参见Choi等人的，Analytical Biochem.Vol.168，pp398-404(1968)，按照Choi等人的文章，使用了牛血清白蛋白〔Bovin Serum Albumin(BAS)〕与硅胶相混合的柱。
至于洗脱，使用了磷酸盐缓冲液，其pH值在6.4和8.4之间，优选的是7.4。
按照Choi等人的方法所得到的洗脱液，含有极低量的(6S)异构体，仅对分析目的有用。
Choi等人的方法用于工业条件下，由于溶解差，结果进入柱的溶液会停留时间很长于是工业生产率会很低，因为必需极长时间地使用柱，以获得可接受的分离，或者另一方面，使得溶液在同一柱中经历几个循环，这就导致混合物降解的可能性增加，并且试剂的消耗量很大。
令人惊奇地发现，根据本发明，沿用Choi等人的技术，但是对(6R，S)混合物的洗脱来说，使用pH值范围极窄(在5.0和5.5之间)的缓冲溶液，可获得具有工业产率的(6S)异构体的溶解，成本低廉，步骤简单。
的确，如果使用两个用白蛋白混合硅胶的工业柱，分别按照Choi等人的方法和本发明的方法来溶解(6R，S)混合物，则所获得的(6S)异构体的产率分别是低于5%，和不低于20%。
除了从(6R，S)混合物中分离(6S)异构体的上述方法之外，还努力直接合成(6S)异构体。
按照EP-A-356，984专利，(6S)异构体的合成采用一种方法，基于7，8-二氢叶酸的5-6双键的立体定向氢化作用。
当在NADP的存在下，用二氢叶酸盐(dihydrogolate)还原酶进行所说的氢化作用时，获得很好的转化，但是所说的方法很复杂，从工业的观点上来看，根本没有用。
已尝试了其它种类的立体定向氢化作用，其中使用合适的催化剂，但是结果总是很差。(TETRAHEDRON42，117，1986)最后，迄今无价廉的方法，可以工业的规模获得MTHF和FTHF的(6S)异构体。至于实用的药物学用途，(6S)MTHF和(6S)FTHF并不用其本身，通常用其钙盐。
按照众所周知的技术，进行这样的转变，例如按照US-A-2，688，018专利所公开的方法，以及Weast所著的“Handbook of Chemistry and Physics”(第57版，B-100页)。
通过一种方法，将(6R，S)MTHF或(6R，S)FTHF的混合物分开成为分别的(6S)异构体，按照该方法，在一个色谱柱中，装入白蛋白水溶液，然后用第一缓冲溶液进行洗涤，装入式(Ⅰ)的衍生物的非对映异构体混合物的水溶液，然后用第二缓冲溶液进行洗脱，从而得到(6S)非对映异构体，第一次洗脱得到FTHF，以及第二次洗脱得到MTHF，其特征在于它的溶液中的白蛋白的浓度在0.1%(wt)至10%(wt)之间，以及其衍生物溶液的浓度在0.1%(wt)至10%(wt)之间，所说的缓冲溶液的pH值在4.8至5.8之间。
更优选地，白蛋白和非对映异构体混合物的水溶液，用pH值在4.8和5.8之间的缓冲溶液洗涤。
进一步优选地，硅胶的颗粒度在25μm和60μm之间，在35μm之间较好。
有利的是，所说的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液，其浓度在0.05M和0.15M之间，它的水溶液中的所说的白蛋白的浓度为大约1%(wt)，以及在其溶液中的一种非对映异构体混合物为大约5%(wt)，而白蛋白选自由猪肉，牛肉，绵羊肉，兔肉，鸡网和鸡蛋白蛋白所组成的组。
显然，按照本发明的方法，各阶段中所用的缓冲溶液可以彼此相同，也可以彼此不同。可用作缓冲溶液的有邻苯二甲酸盐(phthalate)，磷酸盐，乙酸盐等等，优选的是磷酸盐。
根据一种优选的方法，使用0.05M的磷酸盐缓冲溶液来洗脱色谱柱，其中事先装入(6R，S)-甲基-四氢叶酸，钙盐。对(6R，S)甲酰基-四氢叶酸，钙盐的情形，装入0.15M的磷酸盐缓冲溶液。
最后，根据本发明，有可能将分离方法的生产率提高至工业水平，进行洗脱的时间被缩短。
下面参照优选实施例详细地描述本发明，应该理解，本发明并不为这些特殊的实施例所限制。
在下面实施例中所提到的产率用一个重量值来表达，这里它相应于一个光学产率(optical yield)。
实施例1一个工业柱，直径为0.90m，高为6.0m，其中装有硅胶，硅胶颗粒直径为35/45μm，悬浮在含有0.1%(wt)巯基乙醇的，pH值为5的0.15M的缓冲溶液中，直至几乎完全填满(5.5m的高度等于大约3600g硅胶的体积)。
手性物质的制备按下列方式进行在洗脱液中出现280nm的UV吸收后，将蛋清白蛋白溶液(含量为1%，在0.15M的磷酸盐缓冲溶液中，pH值为5.0)装入该柱中。在硅胶上吸收的白蛋白的量等于200/400kg。用1000l的0.15M的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱，再用1000l的0.15M的pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液衍脱，最后用10000l的0.15M的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱。然后加入5kg的，流速为200/400l/h的5%的5-甲酰-(6R，S)四氢叶酸钙溶液。再用0.15M的pH值为5.0的磷酸盐缓冲溶液洗脱。收集500l份。
(6S)部份先于(6R)部份洗脱出。洗脱部分可以用装有流动孔(flowing cell)的偏光计来线性控制，然后用HPLC精确地测定剂量。分离出足够纯的部份以用于所需目的。收集纯的部份，并用公知方法盐化。
产率1.9kg(28%)的(6S)叶酸盐滴定度HPLC＞98%光学纯度＞97%实施例2在本实施例中，以工业规模再现了Choi等人的方法。
使用了相同的柱，以及制备静止相的相同的方法，所用方法如实施例1。
用1000l的0.15M的pH值为7的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱。向柱中加入大约5kg的，流速为200/400l/h的5%的(6R，S)叶酸钙溶液。用pH值为7的磷酸钙缓冲溶液进行洗脱。收集500l部份。
分离不令人满意;纯化循环重复四次，以试图获得部份分离。
因分离不佳而放弃原文。
实施例3使用了与实施例1相同的柱，以及制备静止相的相同的方法，但这里使用猪血清白蛋白(PSA)。
产率1.5g(30%)的(6S)叶酸钙HPLC滴定度＞98%光学纯度＞97%实施例4使用了与实施例1相同种类的柱，但是这里使用脱气水用于制备静止相，以及吸收和洗脱的下一个相。
用10000l的pH值为5.2的0.05M的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，加入10kg的，流速为200/400l/h的5%的(6S)-甲基-四氢叶酸溶液，再用pH值为5.2的0.05M的磷酸盐缓冲溶液进行洗脱，收集500l部份。
(6S)部份光于(6R)部份洗脱出。分离出足够纯的部份以用于所需目的，用公知方法收集并处理之。
产率3.9kg(39%)的(6S)甲基四氢叶酸钙HPLC滴定度＞97%光学纯度＞97%
权利要求
1.一种通过在色谱柱上，用色谱方法分离式(Ⅰ)的叶酸衍生物的(6R，S)非对映异构体混合物来制备(6S)异构体的工业方法
其中X=CH3或CHO以及R1和R2是H，NH+4，碱金属和碱土金属，R1和R2可以彼此相同或彼此不同；其中在一个色谱柱中，装入白蛋白的水溶液，然后用第一缓冲溶液进行洗涤，装入式(Ⅰ)的衍生物的非对映异构体混合物的水溶液，然后用第二缓冲溶液进行洗脱，从而得到(6S)非对映异构体，第一次洗脱得到FTHF，以及第二次洗脱得到MTHF，其特征在于它的溶液中的白蛋白的浓度在0.1%(wt)和10%(wt)之间，以及其衍生物溶液的浓度在0.1%(wt)和10%(wt)之间，所说的缓冲溶液的pH值在4.8至5.8之间。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于，在装入式(Ⅰ)的衍生物的非对映异构体混合物之前，先用pH值为7的缓冲溶液洗涤柱，再用pH值为5的缓冲溶液洗涤柱。
3.按照权利要求1和2的方法，其特征在于，所说的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液，其浓度在0.05M至0.15M之间。
4.按照权利要求1至3的方法，其特征在于，所说的色谱柱中装有硅胶，其颗粒度在25μm和60μm之间。
5.按照权利要求4的方法，其特征在于，硅胶的颗粒度在35μm和45μm之间。
6.按照权利要求1至5的方法，其特征在于，它的水溶液中的所说的白蛋白的浓度为大约1%(wt)，以及一种所说的非对映异构体混合物为大约5%(wt)。
7.按照权利要求1至6的方法，其特征在于，所说的白蛋白选自由猪肉，牛肉，绵羊肉，兔肉，鸡肉和鸡蛋白蛋白所组成的组。
8.按照权利要求1至7的方法，其特征在于，所说的白蛋白水溶液在pH值为4.8-5.8下进行缓冲。
9.按照权利要求1至7的方法，其特征在于，所说的非对称异构体混合物的所说的水溶液在pH值为4.8-5.8下进行缓冲。
全文摘要
一种通过在一个色谱柱上，色谱分离两个(6R，S，)非对映异构体来制备(6S)叶酸衍生物的工业方法，其中分离剂是在pH为大约5的缓冲溶液中的白蛋白。
文档编号B01D15/00GK1096785SQ9310728
公开日1994年12月28日 申请日期1993年6月19日 优先权日1993年6月1日
发明者L·安布罗斯尼, B·萨拉 申请人:阿尔巴诺化学工业股份公司