一种快速检测水产病原菌的组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测水产病原菌的组合物，尤其是对杀鲑气单胞菌具有特异性。该组合物能对杀鲑气单胞菌进行快速检测。根据杀鲑气单胞菌特异保守基因vapA、spsM、spsE设计引物，可在40分钟左右完成杀鲑气单胞菌的检测，灵敏度达到20cfu/反应。本发明组合物进行检测，能使反应结果检测方便、快捷。可直接观察反应体系的颜色变化来判定，反应体系由浅褐色变为荧光绿即为阳性结果。同时设备要求简单，易操作，反应速度更快。
【专利说明】
一种快速检测水产病原菌的组合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种快速检测水产病原菌的组合物及其制备方法，更具体地说，本发 明涉及一种对杀鲑气单胞菌有特异性的组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 水产养殖是我国大农业中发展最快的产业之一，但随着养殖规模扩大，病害问题 已经成为制约产业健康发展的主要因素。其中细菌性致病是危害养殖业的一类主要疾病， 每年给水产养殖业造成巨大的经济损失。病原菌的快速检测可以为鱼类养殖日常生产提供 病原变化信息，为病害预警提供依据，避免病害发生可能造成的巨大损失。
[0003] 杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)为革兰氏阴性菌，分布广泛，能够引发多 种水产动物的疾病，是一种致病力较强的水产病原菌。它不仅可以引起多种鱼类皮肤溃疡 病还可以侵染棘皮动物海胆和刺参，并引发疾病，造成巨大的经济损失。
[0004] 目前，国内对鱼类细菌性疾病快速诊断技术的研究还处于初级阶段，常用的鉴定 方法费时费力，有的还不准确，甚至需要专业技术人员或专业技术设备，难以在养殖生产上 应用，远远不能满足生产上的需要，且难以对病原生物早期监控、定期检测、现场快速诊断， 因此往往是爆发了大规模流行性疾病后才引起关注和重视。国内外尚无针对杀鲑气单胞菌 的快速有效的易于现场操作的检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种靶序列扩增特异性高、反应结果检测方便和快捷的检测 水产病原菌的组合物。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种设备要求简单和易操作、反应速度快、快速有效 且易于现场操作的检测杀鲑气单胞菌的检测方法。
[0007] 本发明的目的在于:杀鲑气单胞菌特异基因的选择及引物的设计和优化后的等温 扩增反应体系的配比及反应条件的设定。
[0008] 本发明是基于环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,简 称为LAMP)技术建立一种快速检测杀鲑气单胞菌的方法，该方法的核心内容是杀鲑气单胞 菌特异基因的选择及引物的设计和优化后的等温扩增反应体系的配比及反应条件的设定。
[0009] 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,简称为LAMP)技术 依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒 温条件下高效扩增核酸，1小时即可完成，产物是由多重复靶序列的茎-环状DNA和花椰菜状 DNA所组成的混合物，具有高特异性、快速灵敏、操作简便等特点。本发明建立的环介导等温 扩增体系通过染料钙黄绿素的颜色变化来指示反应结果，肉眼即可观察。
[0010] LAMP对引物设计的要求非常高，LAMP的2对引物分别称为FIP和BIP、F3和B3,可识 别靶基因的6个不同的区域。F3:正向外引物，F3区与靶基因的F3c区域互补；B3:反向外引 物，B3区域与靶基因的B3c区域互补;FIP:正向内引物，由F2区和Flc区域组成，F2区与靶基 因3'端的F2c区域互补，Flc区与靶基因5'端的Flc区域序列相同;BIP:反向内引物，由Blc和 B2区域组成，B2区与靶基因3'端的B2c区域互补，Blc区域与靶基因5'端Blc区域序列相同。 在LAMP反应中加入环引物(正向环引物LF、反向环引物LB)能够明显加快等温扩增的速度， 大大提尚了检测效率。
[0011]
[0012] LAMP引物设计
[0013] 遵循"种内保守，种间特异"的原则，通过查阅文献和与NCBI数据库中杀鲑气单胞 菌基因组以及本实验室已测序杀鲑气单胞菌基因组的比对分析，筛选到vapA、 SpSM、SpSE 三个杀鲑气单胞菌特异毒力基因的保守区（300bp左右)作为靶基因来设计等温扩增的引 物。使用在线等温扩增引物设计软件?1'；[1116也1口10代1'￥40；^￥3^来设计引物。引物序列如 下：（备注：由于设计的引物F1和F2在靶基因上距离较近，不需要再添加正向环引物LF，只需 添加反向环引物LB即可）
[0014]
[0022] LAMP反应体系特异性评价：以水产养殖环境中常见细菌包括溶藻弧菌、大西洋弧 菌、西瓦氏菌、马胃葡萄球菌、嗜冷杆菌、坚强芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和3株杀鲑气单胞菌 的DNA为模板，评价反应体系特异性。3株杀鲑气单胞菌核酸检测均在1小时内出现了阳性扩 增，7株非杀鲑气单胞菌核酸检测均未出现阳性扩增，表明该LAMP反应体系特异性较好。阳 性结果为由浅褐色变为荧光绿，阴性结果和阴性对照均为浅褐色。
[0023] LAMP反应体系的优化:25yL的LAMP反应体系包括2个内引物FIP和BIP、2个外引物 卩3和133、1个环引物1^、10\11161'11^1〇1131^€61'、甜菜碱(136丨3；[116)、脱氧核糖核苷酸（(1阶？）、 硫酸镁、氯化锰、钙黄绿素 、Bst DNA聚合酶、DNA模板、灭菌水补足体系。选择对LAMP体系中 的关键因素进行优化，包括外引物与内引物浓度比（1:4、1:6、1:8、1:10、1:12)、镁离子浓度 (3、4、5、6、7、8、9mmol/L)、钙黄绿素与氯化锰的比例（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)、反 应温度(61、62、63、64、65°0。最终得到最优的扩增体系如下：25以1^的1^^反应体系，63度恒 温扩增。
[0025] LAMP反应体系灵敏度评价:将杀鲑气单胞菌培养液10倍系列梯度稀释后，选取连 续7个稀释度用血球计数板计数，每个稀释度分别取3个样品计数，求出每个稀释度的平均 值。以上述10倍梯度稀释的细菌DNA为模板，使用优化后的LAMP反应体系进行扩增试验。最 终得到优化后的LAMP反应体系灵敏度为20cfu/反应，反应条件为63度恒温扩增45分钟。
[0026] 本发明取得了如下效果：1)LAMP对靶序列扩增的特异性高。由于LAMP通过4条引物 与靶序列上的6个特异部位准确结合来产生扩增反应，因此可以获得比PCR更高的特异性。 2)反应结果检测方便、快捷。可直接观察反应体系的颜色变化来判定，反应体系由浅褐色变 为荧光绿即为阳性结果。3)设备要求简单，易操作。LAMP只需要一个普通的水浴锅或者恒温 装置，操作简单、携带方便，技术门槛低。4)反应速度更快。LAMP是恒温扩增反应，没有PCR反 应中温度变化的耗时，一般在30min-60min内即可完成，比荧光定量PCR反应速度更快，能更 好的满足生产现场的快速检测的要求。5)-般情况下，以分子水平为基础的检测方法例如 PCR和荧光定量PCR都会受临床标本中抑制物的影响，一些研究者报道LAMP使用的Bst DNA 聚合酶对样品中抑制物的耐受能力比荧光定量PCR中的Taq酶要强。因此LAMP比荧光定量 PCR具有更广阔的应用前景。
【附图说明】
[0027]图1引物spsM特异性实验对照 [0028]图2引物spsE特异性实验对照 [0029]图3引物vapA特异性实验对照 图4 LAMP引物设计
[0030] 1--錯样芽胞杆菌;2--溶藻弧菌;3--马胃葡萄球菌；
[0031] 4一一西瓦氏菌;5-一大西洋弧菌;6-一坚硬芽孢杆菌；
[0032] 7--嗜冷杆菌;8--杀鲑气单胞菌S7; 9--杀鲑气单胞菌S53;
[0033] 1〇--杀鲑气单胞菌S121;ll--阴性对照。
【具体实施方式】
[0034] 实施例1
[0035]按体积比该组合物包括： l〇x Thcrmpol builcr 10f/〇 5M:甜菜碱： 12%、
[0036] 100 mM 硫酸镁 6%、 12.5 mM氯化锰 4%、 0,625 mM钙黄緑素 4%^
[0037] 检测杀鲑气单胞菌的时间为65分钟(反应温度为63度，DNA模板浓度为50ng/yL)。
[0038] 实施例2
[0039]按体积比该组合物包括： 10v Thcrmpol bulTcr 10%、 5M甜菜碱 16%、
[0040] 100 mM 硫酸镁 3%、 12.5 mM氯化锰 4%、 0.625 mM钙黄绿素 4%
[00411检测杀鲑气单胞菌的时间为58分钟(反应温度为63度，DNA模板浓度为50ng/yL)。
[0042] 实施例3
[0043]按体积比该组合物包括： 1 〇\ Thermpol buH'er 101?、 5M甜菜碱 16%、
[0044] 100 mM 硫酸镁 6%、 12.5 mM 氯化锰： 1%、 0.625 mM钙黄绿素 4%,
[0045] 检测杀鲑气单胞菌的时间为40分钟，阳性结果和阴性结果颜色区分度较低(反应 温度为63度，DNA模板浓度为50ngAiL)。
[0046] 实施例4
[0047]按体积比该组合物包括： l〇x Thcrmpo! bulTcr 10% 5M:甜菜碱 16%、
[0048] 100 mM 硫酸镁 6% 12.5 mM氯化锰 4%、 0,625'mM钙黄绿素 1%P
[0049] 检测杀鲑气单胞菌的时间为40分钟，阳性结果和阴性结果颜色区分度较低(反应 温度为63度，DNA模板浓度为50ngAiL)。
[0050] 实施例5
[00511按体积比该组合物包括： 10、Thcrnipol bulTbr 8%、 5M甜菜碱 16%、
[0052] l.O.O.mM 疏酸镁 6%, 12.5 mM氯化锰 蛛％、 0.625 mM钙黄绿素 4%P
[0053] 检测杀鲑气单胞菌的时间为55分钟(反应温度为63度，DNA模板浓度为50ngAiL)。
[0054] 实施例6
[0055]按体积比该组合物包括： l〇x Thcrmpol buffer 12〇/0> 5M 甜菜碱 16%、
[0056] ]00mM硫酸镁 6%、 12.5 mM氯化猛 4%、
[0057] 0.625 mM 钙黄绿素 4%。：
[0058]检测杀鲑气单胞菌的时间为50分钟(反应温度为63度，DNA模板浓度为50ngAiL)。
[0059] 实施例7
[0060]按体积比该组合物包括： l〇x Thcrmpol buffer 10:%、 5M甜菜碱 20%、
[0061 ] 100 mM 硫酸镁 .6%、 12.5 mM 氯化锰 4%:、 0.625 mM钙黄绿素 4%。
[0062] 检测杀鲑气单胞菌的时间为45分钟(反应温度为63度，DNA模板浓度为50ng/yL)。
[0063] 实施例8
[0064]按体积比该组合物包括： 10x Thcrmpol bulTcr 10%、 5M甜菜碱 16%、
[0065] 100 mM 硫酸镁 9%、 12.5 mM氯化锰 4%、 0.:625 imM钙黄绿素 4%。
[0066] 检测杀鲑气单胞菌的时间为45分钟(反应温度为63度，DNA模板浓度为50ng/yL)。
[0067] 实施例9
[0068]按体积比该组合物包括： l〇x Thcrmpol bulTcr 10%、
[0069] 5 Μ 甜菜碱 16%、 100 mM硫酸镁 6%、 12.5 mM氯化锰 4%、
[0070] 0.625 mM钙黄绿素 8%。
[0071] 检测杀鲑气单胞菌的时间为40分钟，阳性结果和阴性结果颜色区分度较低(反应 温度为63度，DNA模板浓度为50ngAiL)。
[0072] 实施例10
[0073]按体积比该组合物包括： l〇x Thermpo! bulTcr 10% 5M甜菜碱 16%、
[0074] lOOraM 硫酸镁 6%、 氯化锰 8%、. 0.:6_2:5.mM 1? 黄绿素 4%。
[0075] 检测杀鲑气单胞菌的时间为40分钟，阳性结果和阴性结果颜色区分度较低(反应 温度为63度，DNA模板浓度为50ngAiL)。
[0076] 实施例11
[0077]按体积比该组合物包括： IQx Thcrmpol buil'cr 1.0%、.. 5M甜菜碱 16%、 ]()0mM硫酸镁 6%、 12.5 mM氯化锰 4%、 0.625 mM钙黄绿素 4%。
[0078] 2:S mM dNTP 5.6%·. 100 μΜ F3 0.2%, 100μΜ B3 0.2%、 100μΜ FIP 1，6%、 100μΜ BIP 1.6%, 100μΜ LB 0.8%, BstDNA聚介酶 4%、
[0079] DNA 模板 8%、 无菌水 补足体系。
[0080] 该反应体系检测杀鲑气单胞菌的时间为40分钟，阳性结果和阴性结果颜色区分度 较高(反应温度为63度，DNA模板浓度为50ngAiL)。
[0081 ] 实施例12
[0082] LAMP引物设计
[0083]遵循"种内保守，种间特异"的原则，通过查阅文献和与NCBI数据库中杀鲑气单胞 菌基因组以及本实验室已测序杀鲑气单胞菌基因组的比对分析，筛选到vapA、SpSM、 SpSE三 个杀鲑气单胞菌特异毒力基因的保守区（300bp左右)作为靶基因来设计等温扩增的引物。 使用在线等温扩增引物设计软件PrimerExplorer V4software来设计引物。引物序列如下： (备注：由于设计的引物F1和F2在靶基因上距离较近，不需要再添加正向环引物LF，只需添 加反向环引物LB即可）
[0084]
[0085] vapA
[0086]
[0092] LAMP反应体系特异性评价：以水产养殖环境中常见细菌包括溶藻弧菌、大西洋弧 菌、西瓦氏菌、马胃葡萄球菌、嗜冷杆菌、坚强芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和3株杀鲑气单胞菌 的DNA为模板，评价反应体系特异性。3株杀鲑气单胞菌核酸检测均在1小时内出现了阳性扩 增，7株非杀鲑气单胞菌核酸检测均未出现阳性扩增，表明该LAMP反应体系特异性较好。阳 性结果为由浅褐色变为荧光绿，阴性结果和阴性对照均为浅褐色。
[0093] LAMP反应体系的优化:25yL的LAMP反应体系包括2个内引物FIP和BIP、2个外引物 卩3和133、1个环引物1^、10\11161'11^1〇1131^€61'、甜菜碱(136丨3；[116)、脱氧核糖核苷酸（(1阶？）、 硫酸镁、氯化锰、钙黄绿素 、Bst DNA聚合酶、DNA模板、灭菌水补足体系。选择对LAMP体系中 的关键因素进行优化，包括外引物与内引物浓度比（1:4、1:6、1:8、1:10、1:12)、镁离子浓度 (3、4、5、6、7、8、9mmol/L)、钙黄绿素与氯化锰的比例（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)、反 应温度(61、62、63、64、65°0。最终得到最优的扩增体系如下：25以1^的1^^反应体系，63度 恒温扩增
[0095] LAMP反应体系灵敏度评价:将杀鲑气单胞菌培养液10倍系列梯度稀释后，选取连 续7个稀释度用血球计数板计数，每个稀释度分别取3个样品计数，求出每个稀释度的平均 值。以上述10倍梯度稀释的细菌DNA为模板，使用优化后的LAMP反应体系进行扩增试验。最 终得到优化后的LAMP反应体系灵敏度为20cfu/反应，反应条件为63度恒温扩增45分钟。
【主权项】
1. 一种快速检测水产病原菌的组合物，按体积比该组合物包括： i〇x Thcmipol b山Ter 8%-! 2%、 5M 甜菜碱 12%-20%、 100 mM 硫酸簇 3〇/〇-9〇/〇、 12.5 ητΜ 氯化猛 1%-8%. 0.625 mM 巧巧绿某 1%-8%。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中10 X化ermpol buffer的体积比含量为10 %。3. 根据权利要求1所述的组合物，其中5M甜菜碱的体积比含量为16%。4. 根据权利要求1所述的组合物，其中lOOmM硫酸儀的体积比含量为6 %。5. 根据权利要求1所述的组合物，其中12.5mM氯化儘的体积比含量为4%。6. 根据权利要求1所述的组合物，其中0.625mM巧黄绿素的体积比含量为4%。7. 根据权利要求1所述的组合物，按体积比该组合物还包括： 25 mM clNTP 5.6%、 100μΜ引物混合物： 4.4%、 Bst DNA 聚合酶 4:%、 DNA模板 8%、 无菌水 补足体系。8. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述的100μΜ引物混合物按其体积比包括： 100μΜ F3 0.2%、 100μΜ 总 3 0,2% V 100μΜ F!P !'(-,%、 Ι.ΟΟμΜ BIP 1,6%. 100μΜ； LB 0.8% 〇9. 一种快速检测水产病原菌的组合物的应用，其特征在于对杀娃气单胞菌有特异性。
【文档编号】C12Q1/68GK105969853SQ201610317558
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】冯婕, 杜晓辰
【申请人】中国科学院微生物研究所