专利名称：siNA介导的VEGF-C和RhoA的敲低对VEGF-A分泌、血管生成和/或新血管生成的抑制的制作方法
技术领域：
本发明涉及诸如短干扰核酸(SiNA)分子的短核酸分子调节基因和蛋白表达的用途，包括调节MioA和/或VEGF-C基因表达的小核酸分子的化合物、组合物和协同组合。本发明的化合物和方法单独或与其它疗法联合用在调节Mio-A、VEGF-C和VEGF-A表达和分泌、血管生成和/或新血管生成方面。
背景技术：
血管牛成血管生成是新血管形成或现有血管扩张，而淋巴管生成是淋巴管中的等效过程。 血液和淋巴性血管生成的过程由一些关键的血管生成因子严格调节。抗血管生成因子包括血小板反应蛋白、血小板因子IV、TNF_a (体外)、TGF_i3、干扰素、制管张素、整联蛋白抑制物、16kD促乳素、内皮抑制素和ANG-2。某些类固醇可抑制血管生成。血管和淋巴管的促血管生成因子包括FGF(成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、PDGF (血小板衍生生长因子)和血管生成素家族。已知FGF家族在多种细胞类型上具有广泛的生物功能。FGF-I和FGF-2是生物体内潜在的血管生成因子，虽然这些因子在血管生成的调节中的生理和病理关联性是不清楚的。 VEGF家族包括至少五种结构相关的蛋白。VEGF-A、VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D和胎盘生长因子(PlGF)。这些分子与表现不同特异性和功能的一系列细胞表面受体VEGFR-1、 VEGFR-2和VEGFR-3相互作用。VEGF-C和VEGF-D与VEGFR-2和VEGFR-3均结合并促进血管和淋巴管的形成。VEGF-B和PlGF与VEGFR-I结合并调节VEGF-A的作用，但它们在血管生成的刺激中的作用仍存在争议。除了其刺激血管生成的能力，VEGF-A作为潜在的血管通透因子(VPF)行使作用。大量的工作表明VEGFR-2是介导VEGF-A诱导的血管生成效应和通透效应的受体。支持此观点，仅与VEGFR-I相互作用的VEGF-B和PlGF缺少血管生成活性和血管通透活性。毛细管中的VEGF-A、VEGF-C、和FGF-2决定了内皮细胞层的厚度(按照重要性排序，VEGF-A < VEGF-C < FGF-2)。与血液毛细管不同，由VEGF-C产生的淋巴毛细管缺少穿孔(fenestration)。这可能是由于血管生成和淋巴管生成所用的信号通路的差异。 高血糖、低氧或较高水平的胰岛素提高了视网膜内皮细胞和视网膜上皮细胞中的VEGF-C的表达，且增高的VEGF-C抑制了内皮细胞凋亡。血管生成的调节是许多正常过程和病理过程的关键，所述过程包括胚胎发育、创伤愈合、肿瘤生长和转移、风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病变、动脉粥样硬化以及缺血性心肌、后肢肌肉和脑的血管再造。淋巴管生成对于肿瘤由淋巴系统蔓延至关重要。已显示新生血管形成引起或加剧了眼疾病，所述眼疾病包括，但不局限于，黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、近视性变性和沙眼。Norrby APMIS 105， 417-437(1997)。已报道患有糖尿病性视网膜病变和其它视网膜疾患的绝大多数患者的眼内液含有高浓度的 VEGF-A。Aiello 等人，New Engl. J. Med. 331，1480 (1994)。已报道患有视网膜缺血的患者中具有增高的水平的VEGF mRNA。Miller等人，Am. J. Pathol. 145， 574(1994)。因此，VEGF-A可能在眼疾病中具有直接的作用。其它因子，包括刺激VEGF合成的那些，可能也会引起这些适应症。RhoARas超家族蛋白参与了细胞分裂的调控和时间周期，并且包括Mio。Mio家族的蛋白包括RhoA、RhoB, RhoC, RacU Rac2和Cdc42，它们互相共有50%以上的序列同一性。Mio蛋白参与诱导响应于诸如溶血磷脂酸(LPA)和生长因子的胞外信号的应力纤维和粘着斑(focal contact)的形成。Ridley 等人，Cell，70，389-399 (1992) ；Ridley 等人，EMBO J. ,1353, 2600-2610 (1994) ο还认为Mio家族参与与细胞骨架重排相关的生理功能，比如细胞形态变化(Parterson等人，J. Cell Biol，111，1001-1007 (1990))、细胞粘着(Morii 等人，J. Biol. Chem. , 267, 20921-20926 (1992) Jominaga 等人，J. Cell Biol, 120,1529-1537(1993) ；Nusrat 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,10629-10633 (1995)； Landanna 等人，Science，271，981-983 (1996))、细胞运动性(Takaishi 等人，Oncogene, 9， 273-279(1994))和胞质分裂(Kishi 等人，J. Cell Biol, 120，1187-1195 (1993) ；I. Mabuchi 等人，Zygote, 1,325-331 (1993)) 0已表明Mio蛋白参与平滑肌收缩的调控(Hirata等人， J. Biol. Chem.，267，8719-8722 (1992) ；Noda 等人，FEBS Lett.，367，246-250 (1995) ；Gong 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，93，1340-1345 (1996))，以及磷脂酰肌醇 3 激酶(PI3 激酶) 的表达(Zhang 等人，J. Biol. Chem.，268，22251-22254 (1993))，磷脂酰肌醇 4-磷酸 5-激酶 (PI 4，5-激酶)的表达(Chong 等人，Cell，79，507-513 (1994))和 c_fos 的表达(Hill 等 A, Cell,81,1 159-1170(1995))。IihoA是应力纤维的形成中已知调节肌动蛋白细胞骨架的小GTP酶蛋白。他0-激酶(ROCK)蛋白是MioA的下游效应物且通过由活化的他0进行磷酸化而被激活。哺乳动物 ROCK家族包括R0CK-1和R0CK-2，它们是由两个不同的基因所编码的约160kDa的丝氨酸/ 苏氨酸激酶。发明目的本发明的目的是提供用于VEGF-C和/或I^hoA基因表达的调节的短干扰核酸 (siNA)分子的组合，所述短干扰核酸分子表现出比对抗每种蛋白的现有技术短干扰核酸更好的特异性和/或有效性。本发明的一个目的是调节VEGF-C的表达水平，其影响了 VEGF-A的细胞水平。本发明的一个目的是降低VEGFR-3受体的活性，通过敲低其相互作用的配体 VEGF-C的表达水平来实现。
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本发明的一个目的是破坏VEGF-C和VEGF-A之间的稳态来控制新血管生成。本发明的一个目的是抑制(减少或降低)新生血管形成，通过降低VEGF-C和/或 RhoA基因的表达水平来实现。本发明的一个目的是抑制新生血管形成，通过向细胞、脉管、组织或有机体提供抑制VEGF-C和/或IihoA基因的表达的siNA来实现。本发明的一个目的是抑制IihoA基因表达，而使VEGF-A基因或蛋白、或参与VEGF-A 介导的信号通路的基因或蛋白的量被抑制或减少，从而调控新血管生成。本发明的一个目的是抑制VEGF-C基因表达，而使VEGF-A基因或蛋白、或参与 VEGF-A介导的信号通路的基因或蛋白的量被抑制或减少，从而调控新血管生成。本发明的一个目的是抑制I^hoA和VEGF-C基因表达，从而以诸如协同方式使 VEGF-A基因或蛋白、或参与VEGF-A介导的信号通路的基因或蛋白的量被抑制或减少，从而调控新血管生成。本发明的一个目的是向细胞、脉管、组织或有机体提供组合形式的IihoA SiNA和 VEGF-C siNA，与当单独使用IihoA siNA和/或VEGF-C siNA中的每种的效果叠加所观察到的相比，由此以协同方式抑制了 VEGF-A表达和分泌、血管生成和/或新血管生成。本发明的一个目的是提供包含抑制IihoA和/或VEGF-C的基因表达的27-mer siNA分子的化合物。本发明的一个目的是提供包含抑制MioA和/或VEGF-C的基因表达的约19个到约30个核苷酸的siNA。本发明的一个目的是提供被位点定向至靶基因的SiNA分子。本发明的一个目的是提供能够用于抑制血管生成的SiNA分子。本发明的一个目的是提供可单独使用或与其它疗法联合使用用于眼疾病或疾患的有效治疗的短核酸分子，所述眼疾病或疾患比如糖尿病性视网膜病变、年龄相关的黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、虹膜发红、葡萄膜炎、脉络膜新生血管形成、眼感染症，比如结膜炎、角膜炎、睑炎、睑腺炎、睑板腺囊肿、虹膜炎和基质性角膜炎。本发明的一个目的是提供可单独使用或与其它疗法联合使用用于癌症的有效治疗的短核酸分子，所述癌症比如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、脑癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、黑素瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤或多重耐药癌症。本发明的一个目的是提供可与诸如脂质、聚合物和单克隆抗体的组合物轭合的短干扰核酸分子。发明简述本发明设计并示出靶向IihoA和/或VEGF-C基因的核酸分子，其可特异性地且有效地指导同源特异的转录后基因沉默，且因此可用作具有极小副作用的高度有效的、选择性的且强大的治疗物。本发明包括被特异性地靶向的双链短核酸(siNA)。在一些实施方案中，短核酸分子是RNA，包括靶向RhoA和/或VEGF-C基因的siRNA。在一个实施方案中，本发明示出了下调VEGF-C基因的表达的siNA分子，其中siNA 分子包含约19到约30个碱基对。在相关的实施方案中，siNA是19、20、21、22、23、对、25、 26、27、28、29 或 30 个碱基对的 SiRNA0
在一个实施方案中，本发明示出了下调IihoA基因的表达的SiNA分子，其中siNA 分子包含约19到约30个碱基对。在相关的实施方案中，siNA是19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29 或 30 个碱基对的 SiRNA0在另一个实施方案中，本发明示出了包含以下核苷酸序列的SiNA分子，所述核苷酸序列，例如，siNA分子的反义区域中的核苷酸序列，与VEGF-C和/或I^hoA基因的核苷酸序列或序列的部分互补。在另一个实施方案中，本发明示出了包含以下区域的siNA分子， 所述区域例如，siNA构建物的反义区域，与包含VEGF-C和/或I^hoA基因序列或其部分的序列互补。在本发明的一个实施方案中，siNA分子包含与编码VEGF-C和/或IihoA蛋白的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的反义链。在另一个实施方案中，siNA还包含有义链， 其中所述有义链包含VEGF-C和/或I^hoA基因的核苷酸序列或其部分。在一个实施方案中，本发明的siNA分子具有调节由VEGF-C和/或IihoA基因所编码的RNA的表达的RNA干扰(RNAi)活性。在另一个实施方案中，本发明示出了下调VEGF-C和/或IihoA基因的表达的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中siNA包含与VEGF-C和/或IihoA基因的核苷酸序列或其部分互补的反义区域，和与VEGF-C和/或I^hoA基因的核苷酸序列或其部分基本上相似的有义区域。在一个实施方案中，反义区域和有义区域各自包含约19到约30个(例如，19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、四或30)核苷酸，其中反义区域包含与有义区域的核苷酸互补的至少19个核苷酸。在一个实施方案中，本发明的SiNA分子包含以下的任何一项包含有义链SEQ ID NO 7和反义链SEQ ID NO 8的RINA 6 ；包含有义链SEQ ID NO 9 和反义链 SEQ ID NO 10 的 RINA 17 ；包含有义链SEQ ID NO 11 和反义链 SEQ ID NO 12 的 RINA 30 ；包含有义链SEQ ID NO 13 和反义链 SEQ ID NO 14 的 RINA 50 ；包含有义链SEQ ID NO 15 和反义链 SEQ ID NO 16 的 RINA 51 ；和包含有义链SEQ ID NO 17和反义链SEQ ID NO 18的RINA 52。 在本发明中，利用siNA对VEGF-C表达的敲低导致了 VEGFR-3的活化的降低， VEGFR-3是血管生成的起始和持续所需的。并且，本发明首次证明VEGF-C的敲低还导致了 VEGF-A的表达的降低。因此，本发明建立了在VEGF-C和VEGF-A的表达水平之间存在的直接关系，并从而提供了控制或逆转血管生成的方法。本公开内容提供了用于调节IihoA和/或VEGF-C基因表达的短核酸分子。在相关的实施方案中，本发明提供了用于抑制血管生成的靶向MioA和/或VEGF-C的短核酸分子。 这样的分子可单独使用(靶向MioA和/或VEGF-C的分子)，或与其它疗法联合使用，用于管理和治疗与过度血管生成相关的多种疾患，比如年龄相关的黄斑变性和糖尿病性视网膜病变、高血压、癌症、炎症疾病和自身免疫病。在一些实施方案中，本发明提供了具有从19到30个之间的核苷酸、从25到四个之间的核苷酸或具有27个核苷酸的siNA，其中序列被设计为在I^hoA和/或VEGF-C基因表达的敲低(即，减少)中具有更好的稳定性和有效性。这样的siNA可单独使用或与其它疗法联合使用。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含与对应于IihoA和/或VEGF-C核酸序列的RNA互补的19-30个核苷酸。在相关的实施方案中，本发明包括用于调节MioA和/或 VEGF-C基因表达的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四或30_mer的化合物、组合物和用途，其中包括27-mer的siNA分子。本发明提供了与胆固醇轭合或没有与胆固醇轭合的SiNA的稳定组合物。本发明的化合物单独地或与其它的治疗或疗法联合地在血管生成的治疗中是有用的。在某些实施方案中，本发明的siNA包括短干扰RNA(SiRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA ( μ RNA)，和/或短发夹RNA (shRNA)分子。siNA分子可以是未经修饰的或经化学修饰的。在某些实施方案中，本发明涉及在一条链上具有19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29或30个核苷酸的siRNA。本发明的核苷酸可被化学合成，从载体中表达，或被酶促合成。在一个实施方案中，本发明的siRNA组合物包括两种双链siRNA的组合，其中第一种双链siRNA分子的一条链与编码MioA的RNA的部分互补，且第二种双链siRNA分子的一条链与编码VEGF-C的RNA的部分互补。在另一个实施方案中，本发明的一种siRNA分子包含双链RNA，其中该RNA的一条链包含编码MioA的RNA的序列的部分，且另一种siRNA分子包含双链RNA，其中该RNA的一条链包含编码VEGF-C的RNA的序列的部分。在一个实施方案中，本发明靶向如GenBank登录号NM_001664和匪_0(^似9分别所列的MioA和/或VEGF-C。然而，本发明并不局限于靶向MioA的一种变体的核苷酸，而是还包括靶向MioA相关分子的核苷酸，所述Mio相关分子包括MioA的单核苷酸多态型、MioA 同源物和Mio剪接变体和转录变体。本发明还考虑了靶向MioA调节通路中所涉及的作为调节I^hoA的工具的基因的核苷酸。同样，靶向VEGF-C的核苷酸也不局限于靶向VEGF-C的一种变体的核苷酸，而是还包括靶向VEGF-C相关分子的核苷酸，所述VEGF-C相关分子包括 VEGF-C的单核苷酸多态型、VEGF-C同源物和VEGF-C剪接变体和转录变体。本发明还考虑了靶向VEGF-C调节通路中所涉及的作为调节VEGF-C的工具的基因的核苷酸。在另外的实施方案中，本发明提供了用来调节IihoA和/或VEGF-C表达或活性的组合物和方法。MioA表达或活性可通过直接靶向I^hoA的小核酸分子来调节，或通过靶向调节RhoA通路的分子来调节。VEGF-C表达或活性可通过直接靶向VEGF-C的小核酸分子来调节，或通过靶向调节VEGF-C通路的分子来调节。靶向MioA和/或VEGF-C的小核酸分子可与其它小核酸分子或小化学分子联合使用。在相关的实施方案中，IihoA和/或VEGF-C的靶向被用来调控对细胞中MioA和/ 或VEGF-C表达水平的调节响应的新生血管病状，比如年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和青光眼、癌症、炎症疾病和自身免疫性疾病。在一些实施方案中，单独地或与其它小核酸分子联合地使用化学合成的27个核苷酸长度的siNA来降低I^hoA和VEGF-C的表达水平，所述其它小核酸分子针对相同疾病的治疗中所涉及的基因。在其它实施方案中，siNA为19、20、21、22、23、24、25、26、观、29或30 个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了用于验证SiNA的效力的使用血管生成的生物标志的技术，所述生物标志比如VEGF-A的表达水平，和ROCK-I和R0CK-2的磷酸化状态。在一个实施方案中，本发明示出了包含本发明的小核酸分子的哺乳动物细胞，例如人类细胞。本发明示出了在细胞中下调(也称作“敲低”)ΜιοΑ和/或VEGF-C活性的方法， 所述方法包括在适宜于下调MioA和VEGF-C活性的条件下将细胞与本发明的核酸分子相接触。在一个实施方案中，本发明还示出了用于治疗患有与MioA和/或VEGF-C的升高的水平相关的病症的受治疗者的方法，所述方法包括在适宜于治疗的条件下将受治疗者的细胞与本发明的核酸分子相接触。在相关的实施方案中，方法辅以用于相同病症的药物治疗。在另外的相关实施方案中，本发明还示出了使用用于治疗诸如眼前部疾病和眼后部疾病的眼疾病或疾患的治疗剂的方法。在一个实施方案中，本发明提供了抑制与新生血管形成和血管生成相关的至少一种基因的表达的短核酸分子的组合。本发明提供了用于治疗以下的短核酸分子糖尿病性视网膜病变、年龄相关的黄斑变性(AMD)、湿性AMD、诸如葡萄膜炎、虹膜发红、结膜炎、角膜炎、睑炎、睑腺炎、睑板腺囊肿、虹膜炎、基质性角膜炎的眼的炎性病症和癌症。在另一个实施方案中，本发明提供了用于癌症治疗的短核酸分子，所述癌症比如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、脑癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫颈癌、头颈癌、 卵巢癌、黑素瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤或多重耐药癌症，所述癌症治疗包括在适宜于所述治疗的条件下向受治疗者施用本发明的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供了通过抑制其相互作用的配体VEGF-C使 VEGFR-3失效而阻止VEGFR-3的活化的方法。在一个实施方案中，本发明证实了存在于VEGF-C和VEGF-A的表达水平之间的直接关联。同样地，本发明证实了存在于VEGF-C和VEGF-A的表达水平之间的稳态，其是新血管生成的起始和抑制所需的。在另一个实施方案中，由本发明所考虑的其它药物治疗包括化学抑制物、单克隆抗体或其组合。本发明示出了包含在药学上可接受的载体中的本发明的核酸分子的组合物。本发明还示出了向细胞施用本发明的核酸的方法，所述细胞比如哺乳动物细胞 (例如，人类细胞)。这样的细胞可以在培养中或在诸如人类的哺乳动物中。施用方法包括在适宜于这样的施用的条件下将本发明的核酸分子与细胞相接触。施用方法可以有递送试剂的存在，所述递送试剂例如脂质、阳离子脂质、磷脂或脂质体。施用部位可依照疾病而选择，例如，眼疾病，且递送方法可以是，例如，结膜下的、静脉内的、皮下的、滴眼和/或局部的。在一个实施方案中，本发明提供了包含以下的组合物(1)调节VEGF-C表达的第一短核酸分子，其中该第一短核酸分子包含第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸的序列与选自由SEQID NO =USEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3组成的组的序列至少95%互补，和/或( 调节MioA表达的第二短核酸分子，其中该第二短核酸分子包含第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸的序列与选自由SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6组成的组的序列至少95%互补。参见下文表1。在一个实施方案中，第一核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸的序列与选自由SEQ ID NO =USEQ ID NO 2禾口 SEQ ID NO :3组成的组的序列完全(100% )互补，且第二核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸的序列与选自由SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :5和SEQ ID NO 6组成的组的序列完全(100% )互补。在另一个实施方案中，第一短核酸分子包含选自由以下组成的组的siNA:包含有义链SEQ ID NO 7和反义链SEQ ID NO 8的RINA 6 ；包含有义链SEQ ID NO 9和反义链 SEQ ID N0:10 的 RINA 17 ；和包含有义链 SEQ ID NO :11 和反义链 SEQ ID N0:12 的 RINA 30。参见以下表2。在另一个实施方案中，第二短核酸分子包含选自由以下组成的组的siNA:包含有义链SEQ ID NO :13和反义链SEQ ID N0:14的RINA 50;包含有义链SEQ ID N0:15和反义链SEQ ID N0:16的RINA 51;和包含有义链SEQ ID NO :17和反义链SEQ ID NO :18的 RINA 52。参见以下表2。在另一个实施方案中，第一短核酸分子含有包含有义链SEQ ID N0:11和反义链 SEQ ID NO 12的RINA30，且第二短核酸分子含有包含有义链SEQ ID NO :17和反义链SEQ ID NO 18 的 RINA 52。在某些实施方案中，本发明还提供了用于眼疾病的治疗的组合物，其包含本文所描述的组合物的其中之一，和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，眼疾病是视网膜病变或青光眼。在另外的实施方案中，本发明涉及用于治疗新生血管疾病的组合物，其包含本文所描述的组合物的其中之一，和药学上可接受的载体。在另外的实施方案中，本发明的组合物包含脂质、聚合物和/或单克隆抗体。在另一个实施方案中，至少一种短核酸分子与胆固醇轭合。在另外的实施方案中，本发明包括通过施用包括本发明的SiRNA的SiRNA来抑制 VEGF-C、VEGF-A和/或I^hoA的方法，和相关的使用方法以及治疗方法。在一个实施方案中， 方法包括将细胞与短核酸分子相接触，所述短核酸分子包含与全长VEGF-C或I^hoA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列。在另外的实施方案中，序列为100%互补的。在另外的实施方案中，在一条链上核酸为19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、四或30个核苷酸。在一个实施方案中，短核酸分子包含由27个核苷酸组成的反义链，其中该27个核苷酸链序列与全长VEGF-C或I^hoA基因中的27个连续核苷酸至少95%互补。在另外的实施方案中，本发明提供了用于降低或下调VEGF-A表达、或VEGF-A从细胞分泌的方法，所述方法包括将细胞与短核酸分子相接触，该短核酸分子包含与全长 VEGF-C或IihoA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列。在另外的实施方案中，序列是100%互补的。在另外的实施方案中，在一条链上核酸为19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四或30个核苷酸。在一个实施方案中，短核酸分子包含由27个核苷酸组成的反义链，其中该27个核苷酸链序列与全长VEGF-C或I^hoA 基因中的27个连续核苷酸至少95%互补。在某些实施方案中，进行诸如本文所描述的那些方法，在将细胞与约0. 6nM的浓度的短核酸分子相接触后，细胞中VEGF-A分泌降低或下调了约50%。在某些实施方案中短核酸分子(1)直接调节VEGF-C或I^hoA的表达；( 抑制 VEGF-C和/或IihoA表达；(3)抑制VEGF-A表达或分泌；和/或(4)与至少一种调节VEGF-A的表达或分泌的分子结合。在本文所提到的方法的某些实施方案中，第一短核酸分子包含与全长VEGF-C基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列，且第二短核酸分子包含与全长MioA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少 19个连续核苷酸的序列。在相关的实施方案中，核酸长度为19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、四或30个核苷酸。在另外的相关实施方案中，序列是完全(100%)互补的。在本文所提到的方法中的某些实施方案中，SiRNA分子选自包含有义链SEQ ID NO 7和反义链SEQ ID NO 8的RINA 6 ；包含有义链SEQ ID NO 9 和反义链 SEQ ID NO 10 的 RINA 17 ；包含有义链SEQ ID NO 11 和反义链 SEQ ID NO 12 的 RINA 30 ；包含有义链SEQ ID NO 13 和反义链 SEQ ID NO 14 的 RINA 50 ；包含有义链SEQ ID NO 15 和反义链 SEQ ID NO 16 的 RINA 51 ；和包含有义链SEQ ID NO 17和反义链SEQ ID NO 18的RINA 52。在另外的实施方案中，本发明提供了用于降低或下调VEGF-A从细胞分泌的方法， 所述方法包括将细胞与短核酸分子相接触，该短核酸分子包含与全长VEGF-C或I^hoA基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% )互补的至少19个连续核苷酸的序列。在相关的实施方案中，核酸长度为19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四或30个核苷酸。在一个实施方案中，短核酸分子包含由27个核苷酸组成的反义链，其中该27个核苷酸链序列与全长VEGF-C或IihoA基因中的27个连续核苷酸完全(100%)互补。在另外的实施方案中，本发明提供了用于降低或下调VEGF-A从细胞分泌的方法， 所述方法包括将细胞与短核酸分子相接触，该短核酸分子包含与选自由SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3组成的组的序列至少95%互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，短核酸分子包含与选自由SEQ ID NO =USEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3组成的组的序列完全(100% )互补的核苷酸序列。在另外的实施方案中，本发明提供了用于降低或下调VEGF-A从细胞分泌的方法， 所述方法包括将细胞与短核酸分子相接触，该短核酸分子包含与选自由SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6组成的组的序列至少95%互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，短核酸分子包含与选自由SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6组成的组的序列完全(100% )互补的核苷酸序列。在另外的实施方案中，本发明提供了用于降低或下调VEGF-A从细胞分泌的方法， 所述方法包括将细胞与第一短核酸分子和第二短核酸分子相接触，其中第一短核酸分子包含与全长VEGF-C基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列，且其中第二短核酸分子包含与全长MioA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列。在本文所提到的方法中的某些实施方案中，第一短核酸分子包含与全长VEGF-C 基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% )互补的至少19个连续核苷酸的序列， 且第二短核酸分子包含与全长I^hoA基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% )互补的至少19个连续核苷酸的序列。在某些实施方案中，本发明还提供了用于治疗眼疾病、新生血管疾病和/或癌症的方法，所述方法包括施用本文所描述的组合物中的至少一种。在另外的实施方案中，本发明提供了用于在组织中减少或抑制血管生成或新血管生成的方法，所述方法包括将组织与第一短核酸分子和第二短核酸分子相接触，其中第一短核酸分子包含与全长VEGF-C基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少 19个连续核苷酸的序列，且其中第二短核酸分子包含与全长MioA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列。在某些实施方案中，第一短核酸分子包含与全长VEGF-C基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% )互补的至少19个连续核苷酸的序列，且其中第二短核酸分子包含与全长I^hoA基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% )互补的至少19个连续核苷酸的序列。在相关的实施方案中，核酸长度为19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四或30个核苷酸。在另外的实施方案中，本发明示出了用于在组织中减少或抑制血管生成或新血管生成的方法，所述方法包括将组织与本文所描述的组合物中的至少一种相接触。在另外的实施方案中，本发明提供了用于在细胞中降低或抑制诸如R0CK-2磷酸化的ROCK磷酸化的方法，所述方法包括将细胞与短核酸分子相接触，该短核酸分子包含与全长I^hoA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列，其中R0CK-2的磷酸化被降低或被抑制，但ROCK表达没有被敲低。在一个相关实施方案中，短核酸分子调节MioA表达且包含与选自由SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6组成的组的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一个相关实施方案中，短核酸分子包含选自由以下组成的组的siNA:包含有义链SEQ ID NO: 13和反义链 SEQ ID NO 14 的 RINA50 ；包含有义链 SEQ ID NO 15 和反义链 SEQ ID NO 16 的 RINA 51 ；和包含有义链SEQ ID NO 17和反义链SEQ ID NO 18的RINA 52。附图简述以下的附图构成本说明书的一部分并被包括以进一步说明本公开的某些方面。
图1 由基因特异性引物扩增的逆转录酶PCR产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳来分辨，并用溴化乙锭染色以显现感兴趣的扩增子。箭头指出了特异性基因产物的扩增子，显示了两个细胞系，HUVEC(人脐静脉血管内皮细胞，ATCC)和PC3(前列腺癌细胞，ATCC)表达 VEGF-C 禾口 RhoA。泳道1 :PC3VEGF_C ；泳道2 :PC3VEGF-C 没有添加模板(c-DNA)；泳道3 :PC3I hoA ；泳道4 :PC3RhoA没有添加模板(c-DNA)；泳道5: IOObp 梯；泳道6 HUVEC VEGF-C ；泳道7 =HUVEC VEGF-C 没有添加模板(c-DNA)；泳道8 HUVEC IihoA ；泳道9 =HUVEC RhoA 没有添加模板(c-DNA)；泳道10: IOObp 梯；图2 由夹心ELISA试剂盒和利用试剂盒中所提供的VEGF-A的标准所获得的 VEGF-A浓度测定的标准曲线。
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图3 图3A.在从0. 01到IOOnM的范围中以10倍递增的RINA 30的不同浓度下 VEGF-C的敲低，其中结果在70%抑制时到达平台期。RINA30的IC50值为0. 5nM。图3Β.在从0.01到IOOnM的范围中以10倍递增的RINA 30的不同浓度下VEGF-A的敲低，其中结果在48%抑制时到达平台期。RINA 30的IC50值为0. 8ηΜ。图4 图4Α.利用IihoA RINA 50,51和52转染视网膜色素细胞。将来自裂解的转染细胞的蛋白印迹到预先湿润的硝酸纤维素膜上。利用抗磷酸化Mio相关激酶α抗体(anti-phospho-Rho-associated kinase-alphaantibody)ABCAM ab 24843(ABCAM Pic, Cambridge MA, USA)和ALP轭合的第二抗体抗小鼠、链特异性ALP轭合物(Sigma)来检测硝酸纤维素上的磷酸化的R0CK-2。箭头指出了 160KDa磷酸化的R0CK-2蛋白条带，和作为内对照用来确保所有孔中加载了等量的蛋白的51KDa微管蛋白条带。泳道1 :RINA 50转染的细胞；泳道2 =RINA 51转染的细胞；泳道3 =RINA 52转染的细胞；泳道4 阴性RINA转染的细胞；泳道5 未处理的RPE-19细胞；M代表分子量标准参照物。图4B.利用RINA 52转染视网膜色素细胞，且将来自裂解的转染细胞的蛋白印迹到预先湿润的硝酸纤维素膜上。利用抗R0CK-1小鼠单克隆IgGl(Santa Cruz)和ALP轭合的第二抗体抗小鼠Y链特异性ALP轭合物(Sigma)来检测硝酸纤维素上的R0CK-1。箭头指出了 160KDa的R0CK-1蛋白条带，和51KDa的微管蛋白条带(内对照，用来确保所有孔中加载了等量的蛋白)。R0CK-1的蛋白水平在数量上保持相似，显示了通过RINA52敲低抑制了 R0CK-2的磷酸化，但没有抑制R0CK-1的数量水平。泳道1:未处理的细胞；泳道2 阴性RINA转染的细胞；泳道3 =RINA 52转染的细胞。图5 允许未处理的HUVEC细胞、阴性RINA处理的细胞和RINA 30处理的HUVEC细胞在覆盖细胞外基质(ECM)的96孔板的孔上形成脉管。在ECM上孵育8小时后，进行光学显微镜观察并在IOx放大下拍照。图5A显示了未处理的HUVEC细胞起始脉管的五边形网络。箭头指出了脉管的分支。图5B显示了阴性RINA处理的细胞形成脉管。箭头指出了形成的脉管。图5C显示了 RINA 30处理的细胞。细胞彼此独立，且没有表现出细胞迁移或脉管形成的起始的任何迹象。图6.敲低后的VEGF。伴随RPE19细胞系(图6A)和MCF7细胞系(图6B)中 siRNA462的浓度的增加，下降的VEGF-A产生。然而，两个细胞系中的siRNA462导致了分泌的VEGF-C浓度的增加。图6C显示了 MCF7。图7A-D.在高血糖条件下或正常条件下利用siRNA462、RINA 30或二者敲低RPE 19细胞，并检查它们对VEGF-A和VEGF-C分泌的影响。图7A.在高血糖或血糖量正常情况下，SiRNA对VEGF-A分泌的影响。图7B.在高血糖或血糖量正常情况下，SiRNA对VEGF-C分泌的影响。图7C.在低氧或含氧量正常情况下，SiRNA对VEGF-A分泌的影响。
图7D.在低氧或含氧量正常情况下，SiRNA对VEGF-C分泌的影响。图8.利用不同浓度(从0. Ol-IOOnM,以每次一个对数递增)的RINA30转染RPE 19细胞和MCF7细胞，并在转染后72小时末对细胞培养上清液进行分析。对于VEGF-C ELISA 的细胞培养上清液的分析已显示伴随PRE19细胞(图8A)和MCF7细胞(图8B)中RINA 30 的浓度的增高，VEGF-C的分泌水平的下降。类似地，也发现在两个细胞系中伴随RINA 30浓度的增高，VEGF-A的分泌水平下降。图8C显示了 PRE19 ；和图8D显示了 MCF7。图9.利用RINA 52转染HUVEC，并对其降低蛋白水平的能力和其对血管生成的影响进行分析。图9A显示了利用RINA52(从O.Ol-lOOnM，以每次一个对数递增)转染后，在转染后72小时末对HUVEC细胞的MioA蛋白敲低的蛋白质印迹分析。图9B-C显示了在补充有或没有外源VEGF-A或VEGF-C的情况下，由RINA52敲低后的增殖。UT =未利用siRNA 处理。图9B显示了 HUVEC细胞，和图9C显示了 HMVEC细胞。图9D通过HUVEC细胞显示了与利用siRNA(RINA52)的细胞处理相关的血管生成的抑制百分比，并且该作用不可通过外源补充VEGF-A和/或VEGF-C来逆转。图10.转染的HUVEC细胞。图IOA显示了 I^hoA敲低的细胞，其中箭头指出了 F-激动蛋白丝的不存在。图IOB显示了转染阴性RINA的细胞，其中箭头指出了完整的F-肌动蛋白丝。图IOC显示了未转染的细胞，其中F-肌动蛋白丝是显著的。图11.在细胞培养基中在不同的葡萄糖浓度下，分泌的VEGF-A(图11A)和 VEGF-C (图11 的倍数变化。图12.对VEGF-A或VEGF-C添加到培养上清液响应的HUVEC细胞增殖。 VEGF-C (A), VEGF-A ( ■)。图13.利用靶向VEGF-C的不同siRNA转染后，VEGF-C或VEGF-A表达的敲低。发明详述定义术语“短核酸分子”指能够调节基因表达的任何核酸分子。术语“短干扰核酸”、 “siNA”或“siNA分子”、“短干扰核酸分子”或“短干扰寡聚核苷酸分子”指能够抑制、下调或敲低基因表达的任何核酸分子。通常，短干扰核酸分子主要由RNA组成，并且可被称作“短干扰RNA”或“siRNA”。 然而，siNA可包括除RNA外的核苷酸，比如in DNAi (干扰DNA)，或其它经修饰的碱基。因此，如本文所用，术语“RNA”意思是包含至少一种核糖核苷酸残基的分子且包括双链RNA、 单链RNA、分离的RNA、部分纯化的、纯的或合成的RNA，重组产生的RNA，以及修改的RNA，比如类似物或天然存在RNA的类似物。术语“RINA”指具有有义链和反义链的siRNA双链体。RINA 6、RINA17、RINA 30、 RINA 50,RINA 51和RINA 52指具有如以下表2所示的某些核苷酸序列的特定的siRNA双链体。术语“阴性RINA”是由顺序打乱的序列组成的商业上可获得的阴性对照，获自 Ambion Inc0术语“调节(modulate/modulates)”意为编码一种或多种蛋白或蛋白亚基或肽的 RNA分子或等价RNA分子的基因表达或水平、或一种或多种蛋白亚基或肽的活性被上调或下调，而使该表达、水平或活性高于或低于不存在调节物时所观察到的。术语“调节”包括 “抑制”。
术语基因的“抑制(inhibition/inhibit)”、“下调(down-regulation/ down-regulate)”或“敲低”意为基因的表达、或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性降低至低于本发明的抑制性核酸分子(例如，siNA)不存在时所观察到的。在一个实施方案中，在一种或多种siNA分子存在时观察到的抑制或下调高于siNA不存在时或在诸如具有顺序打乱的序列或具有错配的siNA分子存在时所观察到的抑制或下调。同样地，在一个实施方案中，与siNA分子不存在时或在诸如具有顺序打乱的序列或具有错配的siNA分子存在时所观察到的基因或蛋白表达相比，在一种或多种siNA分子存在下基因或蛋白的表达是“敲低的”。术语“基因”指编码RNA的核酸，例如核酸序列，包括但不局限于，编码多肽的结构基因。如本文所用，术语“RhoA”指具有RhoA活性的任何RhoA蛋白、肽或多肽或其衍生物，比如由Genbank登录号NM_001664所编码的。术语RhoA还指编码具有RhoA活性的任何RhoA蛋白、肽、多肽、或具有同工型、突变体基因、剪接变体或多态型的多肽的核酸序列。如本文所用，术语“ROCK”指任何具有Rho激酶活性的Rho激酶(例如，ROCK-I, R0CK-2)蛋白、肽或多肽或其衍生物，比如由Genbank登录号NM_005406 (ROCK-I)和 NM_004850 (R0CK-2)所编码的。术语ROCK还指编码具有RhoA激酶活性的任何RhoA激酶蛋白、肽、多肽、或具有同工型、突变体基因、剪接变体或多态型的多肽的核酸序列。如本文所用，术语“VEGF”指具有血管内皮生长因子活性的任何血管内皮生长因子 (例如，VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D)蛋白、肽或多肽。术语VEGF还指编码具有血管内皮生长因子活性的任何血管内皮生长因子蛋白、肽、多肽、或具有同工型、突变体基因、剪接变体或多态型的多肽的核酸序列。如本文所用，术语“VEGF-C”指具有血管内皮生长因子C型活性的任何蛋白、肽或多肽或其衍生物，比如由Genbank登录号NM_005429所编码的。术语VEGF-C还指编码具有 VEGF-C活性的任何VEGF-C蛋白、肽、多肽、或具有同工型、突变体基因、剪接变体或多态型的多肽的核酸序列。如本文所用，术语“VEGF-A”指具有血管内皮生长因子A型活性的任何蛋白、肽或多肽或其衍生物，比如由Genbank登录号NM_001025366所编码的。术语VEGF-C还指编码具有VEGF-A活性的任何VEGF-A蛋白、肽、多肽、或具有同工型、突变体基因、剪接变体或多态型的多肽的核酸序列。如本文所用，术语“靶基因”或“靶核苷酸”意为其表达或活性待调节的任何核酸序列。靶核酸可以是DNA或RNA。如本文所用，关于本发明的siNA的术语“有义区”指与siNA分子的反义区互补的 siNA分子的核苷酸序列。此外，小核酸分子的有义区可包含与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。如本文所用，关于本发明的siNA的术语“反义区”意为与靶核酸序列互补的siNA 分子的核苷酸序列。其还可包含与siNA分子的有义区互补的核酸序列。如本文所用，术语“互补地”或“互补的”意为核酸序列可与另外的核酸序列形成氢键。包含两个或多个核酸的核酸分子可与另外的核酸分子部分地或完全(100% )互补，所述另外的核酸分子例如，关于能够形成双链分子的对应的核酸。“互补性”或“互补的”百分比指核酸分子中能够与第二核酸序列形成氢键的连续的残基的百分比。例如，如果第一序列中的20个连续核苷酸中的19个与第二序列中的20个连续核苷酸中的19个形成氢键， 则第一序列对于第二序列是95%互补的。“完全互补”意为核酸序列中的所有连续残基将与第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。例如，23-mer的核酸对于27-mer的核酸可以关于23个连续核酸完全(100% )互补。如本文所用，术语“眼疾病，，指使眼患病的任何疾病或疾患，比如眼前部疾病和眼后部疾病，包括视网膜病变、年龄相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、青光眼、目艮的炎症病症，比如葡萄膜炎、虹膜发红、结膜炎、角膜炎、睑炎、睑腺炎、睑板腺囊肿、虹膜炎、 基质性角膜炎，和癌症。如本文所用，术语“新生血管疾病”指涉及新生血管形成或新血管生成的任何疾病或疾患，包括癌症和眼新生血管疾病，比如视网膜新生血管形成和脉络膜新生血管形成。 如本文所用，术语“视网膜病变”指任何类型的视网膜病变，比如血管病性视网膜病变、动脉硬化性视网膜病变、中心性血管痉挛性视网膜病变、中心性浆液性视网膜病变、 环状视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、异常蛋白血症性视网膜病变、高血压性视网膜病变、白血病性视网膜病变、脂血性视网膜病变、增殖性视网膜病变、肾性视网膜病变、链状细胞病、视网膜病变、妊娠的血毒性视网膜病变及类似病变。如本文所用，术语“青光眼”包括原发性开角型青光眼、正常眼压性青光眼、分泌物过多性青光眼、高眼压、急性闭角型青光眼、慢性闭角型青光眼、高原性虹膜综合征、组合式机制性青光眼(combined-mechanismglaucoma)、类固醇性青光眼、囊膜性青光眼、色素性青光眼、与淀粉样变性病相关的继发性青光眼、新生血管性青光眼、恶性青光眼和类似病变。 用于青光眼的预防和治疗的本发明方法和组合物可具有降低眼内压作用、视盘血流提高作用和/或房水流出促进作用。术语“血管生成”指来自现有血管组织(例如，脉管系统)的新的血液供应的产生， 例如毛细血管、血管和静脉。血管生成的过程可涉及多种组织细胞类型，包括，例如形成单细胞层的内皮细胞。术语“新血管生成”指组织中的新毛细血管、血管和静脉的增殖。其还指组织中的新毛细血管、血管和静脉的异常形成或过量形成。新血管生成与血管生成的不同之处在于血管生成通常涉及毛细血管芽的凸出和向外生长和从预先存在的血管中萌芽。如本文所用，术语“癌症”或“增生性疾病”意为本领域中已知的以失调的细胞生长或复制为特征的任何疾病、病症、性状、基因型或表型。其可包括能够对细胞或组织中疾病相关VEGF-C和/或Rho基因表达的单独调节或与其它治疗联合地调节响应的所有类型的癌症、肿瘤、淋巴瘤、癌。在一个实施方案中，考虑了与眼相关的癌症。先前的工作已检查了诸如R0CK-1和R0CK-2的Rho激酶的抑制。其它独立的工作已检查了 VEGF-C的抑制。本发明公开了抑制Rho激酶(通过RhoA)和通过小核酸抑制 VEGF-C的联合/协同方法。在一个实施方案中，本发明敲低了 VEGF-C基因表达，通过其可降低VEGF-C蛋白水平并从而逆转由该因子激活的抗凋亡机制。此外，本发明首次证实了 VEGF-C表达的敲低(即，降低)降低了 VEGF-A的水平，其是血管生成主要所需的。本发明证实了 VEGF-C和VEGF-A分泌是相互依赖的且彼此在数量上成正比。因为VEGF-C的敲低抑制了 VEGF-A的分泌，这样的敲低协助阻止了血管生成。此外，本发明证实了 RhoA通过使RhoA效应分子R0CK-1和R0CK-2磷酸化而在VEGF 诱导的内皮细胞迁移调节中具有重要作用。本发明敲低了 RhoA，因此抑制(S卩，降低)了 RhoA的信号传递机制，其是内皮细胞迁移和细胞粘附的原因。在一个实施方案中，本发明涉及靶向RhoA和/或VEGF-C基因的短核酸，其能够特异性地且有效地指导同源特异的转录后基因沉默，并因此作为具有极小副作用的高度有效的、选择性的且强大的治疗物而行使作用。本发明提供了用于治疗血管生成的化合物、组合物和方法。本发明使用了 RhoA和 VEGF-C的siNA介导的抑制。在一个实施方案中，本发明提供了靶向RhoA基因和/或VEGF-C基因的核酸的组
口 O 在一个实施方案中，本发明靶向RhoA并因此抑制了其效应分子诸如ROCK-I和 R0CK-2的激活。类似地，在一个实施方案中，本发明敲低了 RhoA蛋白水平并因此限制了其使ROCK-I和R0CK-2磷酸化的能力，但没有抑制ROCK-I和R0CK-2的蛋白表达。在另一个实施方案中，本发明下调了 RhoA的蛋白水平并因此抑制了 VEGF驱动的内皮细胞迁移。在另一个实施方案中，本发明敲低了小梁网中的RhoA，并因此通过调控应力纤维形成而抑制了眼内压。在另一个实施方案中，本发明敲低了 VEGF-C表达和分泌，其导致了 VEGF-A从细胞分泌的减少。SiNA设计和检验在一个实施例中，本发明提供了短干扰核酸(siNA)分子和其在RhoA和VEGF-C基因表达的调节中的使用。设计研究的主要特征如下l.siNA 的设计2. siNA 的制备；3.化合物的效力检验；4.具有19-30个核苷酸，例如具有21、22和27个核苷酸的siRNA的对比数据；和5.动物模型中的效力评价。在一个实施例中，适宜的siNA的设计包括用于RhoA和VEGF-C的调节的具有21、 23和27个核苷酸的siRNA的设计，不具有化学修饰。筛选靶基因诸如RhoA和VEGF-C的可及位点，并考虑RhoA和VEGF-C的可读框(ORF)而合成siRNA。在siNA设计中考虑以下的一般要求i.四个或更多A、T、G或U不在一行中连续排列 避免以下的序列，因为它们可引起干扰素反应。A)5' -UGUGU-3 ‘和 B) 5' -GUCCUUCAA-3 ‘iii.从起始密码子删去开始的200个碱基以避免结合调控元件。iv.在计算机模拟中检验每个siNA双链体以避免对BLAST检索作出的脱靶效应的沉默，考虑以下参数A.除去低复杂度筛选程序以避免由BLAST的无意义导致的有限的或无检索的序列发生器；
B.将字长设置为7个字母，最小值算法；C.将期望值阈值设置为1000以避免短序列出现的可能性。通过使用化学保护的亚磷酰胺单体的商业上可获得的方法(例如，Qiagen)来进行siNA的合成。通过PAGE、脱盐或IE-HPLC来纯化合成的寡聚物。通过MALDI-T0F分析每个siNA的质量并通过集成的分光光度计对产量进行测定。对细胞的盲接分析在包括顶端视网膜色素上皮细胞的不同的细胞系中通过夹心ELISA来测定siRNA 降低VEGF-C和VEGF-A的分泌水平的能力。在乳腺癌细胞系中可通过使用夹心ELISA评价VEGF-C和VEGF-A的量来测定 RINA30转染的细胞的IC50值，根据VEGF-C的标准曲线图(曲线图未提供)计算VEGF-C的量。按照siRNA处理的样品相对于对照中所分泌的VEGF-C的比例来计算VEGF-C敲低的百分比。可通过测量由于细胞坏死释放到培养基中的LDH的量来分析siRNA对细胞的细胞毒性。siRNA对从细胞中释放的不同细胞因子的作用可利用细胞因子阵列试剂盒来评估。在体外条件下单独或联合使用对应的siRNA在VEGF-C和RhoA的敲低后对内皮细胞的血管生成或脉管形成能力进行分析。具体地，在VEGF-C和RhoA敲低后，利用体外血管生成分析利用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)细胞(ATCC)对VEGF-A单独诱导脉管形成的能力进行分析。且在体外条件下使用HUVEC细胞在不存在VEGF-A和RhoA时对VEGF-C单独诱导血管生成的能力进行分析。例如，利用siNA敲低RhoA表达且不添加VEGF-A。此外， 利用siNA敲低RhoA表达且利用VEGF-A受体中和VEGF-A。在体外条件下在RhoA不存在时可对VEGF-C和VEGF-A共同诱导血管生成的能力进行分析。此外，通过使用FITC标记的鬼笔环肽观察应力纤维的形成来测定利用siNA的 RhoA敲低的作用。还可通过ELISA、蛋白质印迹以及免疫荧光分析检查siRNA处理的细胞的⑶31抗原的表达，CD31抗原是新血管生成的标志物。可在伤口愈合分析中利用真皮内皮细胞对 siRNA处理的细胞阻止伤口愈合的能力进行分析。对mRNA和蛋白水平的作用还可利用实时定量PCR分析或RNA印迹(Northern blot)分析对转染siRNA的细胞的特定mRNA的水平的降低进行分析。在实时PCR中，利用来自Qiagen的试剂盒制备第一链cDNA。使用来自siNRA、阴性RINA(即，顺序打乱的siRNA,比如购自Ambion Inc.)禾口未处理的样品的第一链cDNA作为模板并通过相对于内部对照标准化来检测mRNA的量。通过 Kenneth 禾口 Thomas( "Analysis of relative gene expression data usingreal-time quantitative PCR and T一 method，”(利用实时定量PCR和方法对相关基因表达数据的分析)Methods 2001;25:402-408)的方案来测定mRNA水平的倍数变化。参见以下表6。通过定量实时PCR对siRNA处理的细胞的⑶31抗原的基因表达水平进行分析。SS通过蛋白质印迹分析对VEGF-C、VEGF-A和RhoA的表达水平进行分析以测定敲低水平。虽然siRNA转染表现出降低的mRNA水平并反映了基因表达水平，蛋白水平的测定证实RNA作为siRNA而非miRNA行使作用。miRNA是短RNA分子(例如，23mer长度)，其中连续的序列不与靶蛋白的mRNA序列准确匹配。miRNA结合mRNA并阻止翻译，但不导致mRNA 降解。相比之下，当使用siRNA时，与靶标互补结合的siRNA导致mRNA的降解并从而导致翻译阻抑。因此，当使用siRNA时，mRNA水平也下降了。凝血酶对RhoA水平的诱导的作用和对siRNA的抑制效率的作用可通过GST-RBD拉下(pull down)分析来测定。siNA 组合物 本发明的SiNA可与其它因子一起使用或不一起使用。本发明还提供了与PEI复合的轭合胆固醇的VEGF-C和RhoA的siNA。siNA分子也可通过2' -0-甲氧基修饰的导入而被化学修饰并因而生成核酸酶抗性。还可对这些分子的血清稳定性进行研究。动物樽型和处理可使小鼠、大鼠或兔经受布鲁赫膜(Brunches membrane)的激光变性并因此诱导血管生成。在这样的分析中，通过玻璃体内、眼周或静脉内途径来施用siRNA，并检验这些对新血管生成的抑制的效力。在各种眼疾病治疗中，通过玻璃体内、眼周、静脉内或眶后途径施用核酸酶抗性的siNA或未修饰的siNA，以获得抗血管生成性质的益处。将siRNA复合或包裹到脂质体中，并用来治疗新血管生成性的青光眼和其它眼疾病，包括年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变，和除其它新血管生成疾病以外的青光眼。以下的实施例展示了本发明的某些实施方案。将被本领域的技术人员所理解的是，实施例中公开的技术代表了由发明人所发现的在本发明的实践中作用良好的技术，并因此可被认为构成其实施方式的实施例。然而，本领域的技术人员将基于本公开理解，可在所公开的实施方案中进行变化并仍获得类似的或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。实施例1 用于RhoA和VEGF-C基因表达的调节的21、22、23和27mer siIRNA的设计靶位点的鉴定基于文献Henshel，A 等人，“DEQOR :A web based tool for the designand quality control of siRNAs，”(DEQOR 用于siRNA的设计和性质控制的基于互联网的工具)Nucleic Acids Res. 2004 ；32 :W1 13-W120 ；Ui-Tei, K,等人，“Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences formammalian and chick RNA interference,"(用于哺乳动物和小鸡的RNA干扰的高效的siRNA序列的选择指南)Nucleic Acid Res. 2004 ；32 (3) :936_48 ;Sui，G.，等人，"A DNA vector based RNAi technology to suppress geneexpression in mammalian cells,，，(基于 RNAi 技术的DNA载体在哺乳动物细胞中抑制基因表达)Proc. Natl. Acad. Sci USA 2002 ；26 (2) 199-213 ；Kim, D. H.,等人，“Synthetic dsRNA dicer-substrates enhance RNAi in plasmacytoiddendritic cells through TLR7，”(合成的 dsRNA 切丁酶底物在类菜树突细胞中通过 TLR7 增强了 RNAi)Nature Medicine 2005 ；11 :263_270 ；和 Judge，A. D.，等 Α "Sequence dependent stimulation of the mammalian innateimmune response by synthetic siRNA, ”(通过合成的siRNA响应的哺乳动物先天免疫的序列依赖性刺激)Nat. Biotechnol 2005 ；23 (4) :457_62·，设计了 21、23 或 27mer 的 siRNA。当设计siRNA时满足了以下的基本要求为设计21mer siRNA
1.所有siRNA的GC含量在30-50%之间。2.每个siRNA的3'-具有dTdT突出端。为设计22mer 和 23mer siRNA 1.所有siRNA都起 始于5 ‘-的G/C。2.每个siRNA链的3'-具有dTdT突出端。3.双链体的GC含量在40-50%之间。4.反义链的5 ‘末端链的前7个碱基中有至少5个A/U碱基。为设计27mer siRNA 1.双链体的GC含量在40-55%之间。2.有义链为25个核苷酸，而反义链通常为27个核苷酸，导致在反义链的3'-的
突出端。3.3'-有义链的最后两个核苷酸含有脱氧糖而非核糖骨架。4.有义链的5'-含有突出端，而3'-为平末端。靶位点利用多种在线可获得的算法以及手动地筛选VEGF-C基因和RhoA基因的序列的能够符合上述标准的可及位点。以这些和其它标准为基础，选择了以下的靶序列来构建对于 VEGF-C 和 RhoA 的 siRNA。表1 用于siRNA合成的VEGF-C和RhoA的靶ORF序列
RINA双基因编号 ORF中的草巴序列起始终止
链体分位i 位占子_____
RINA 6 NM_0054295 ‘ -TGTACAAGTGTCAGCTAAG-3 ‘669687
__(VEGF-C )( SEQ ID NO: 1)___
Rjnai7 NM 0054295 ‘ -GAACCATGTGGATAACTTTAC-3 ‘1816 1836
__(VEGF-C )( SEQ ID NO:2 )___
RINA 30 NM 0054295 ‘ -GCACGAGCTACCTCAGCAAGACGTT-3 ‘ 960984
__(VEGF-C )( SEQ ID NO:3 )___
RINA 5 θ NMOO16645 ‘ -CCTGAAGAAGGCAGAGATATGGCAA-3 ‘ 697721
__(胸-人)(SEQ ID ΝΟ:4 )___
MNA51 NMOO16645 ‘ -GACCAAAGATGGAGTGAGAGAGGTT-3 ‘ 762786
__( Rho-A)( SEq ID Ν0·5 )___
RINA 52 ΝΜ_001664 5 ‘ -GAATTAGGCTGTAACTACTTTATAA-3 ‘ 1172 1196 _ (Rho-A) ( SEQ ID NO:6 )___实施例2 =SiNA分子的制备通过化学方法，使用商业上可获得的工具来合成SiNA分子。基于在核糖的2'-碳位点结合的保护基的类型，将化学方法分类如下1.2'-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)2.2' -0-三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)
3.2' _乙酰氧基乙氧基化学(ACE)循环从附着在固相支持材料或珠子上的3'-端核苷酸开始。第二个核苷酸结合到第一个核苷酸的5-羟基。加帽有效阻止了错误的或短的核苷酸的延伸。且然后将核苷酸间的磷酸键氧化成最终的P(V)状态。最后，除去新核苷酸上的5'-保护基并且延伸中的寡聚核苷酸准备好添加下一个核苷酸。一旦核酸分子到达所需的长度，其进一步被脱保护，从固相支持物上裂解，对其纯度和产量进行分析。纯化通过脱盐作用，然后通过PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)，或通过IE-HPLC (离子交换_高效液相色谱)来纯化siRNA。通过MALDI-T0F对每个RNA链的质量进行分析并通过集成分光光度计在30nm处的吸光度测定产量。在由MALDI-T0F的质量控制过程中，4原子质量单位的差异是所允许的与所预测的质量之间的最大差异。对于每条链获得按照在30nm 处的吸光度所测定的相当产量后，将有义链和反义链进行复性，并真空冻干。在利用siRNA 的实验过程中，在由IOOmM KCl、30mM HEPES缓冲液(pH 7. 5)和ImM MgCl2组成的RNA悬浮缓冲液中悬浮冻干的粉末，并在90°C下加热1分钟，在37°C下孵育1小时以溶解冻干的粉末。通过按照这些生产方案，合成了以下具有不同3'-末端修饰和不同长度的siRNA(表 2)。表2 针对VEGF-C和RhoA基因的具有末端修饰的合成的siRNA
RINA双链体具有突出端的双链体序列06有义反义5‘-UGUACAAGUGUCAGCUAAGdTdT-3‘ ( SEQ ID NO:7 ) 5‘-CUUAGCUGACACUUGUACAdTdT-3‘ ( SEQ ID NO:8 )17有义反义5‘-GAACCAUGUGGAUAACUUUACdTdT-3‘ ( SEQ ID NO:9 ) 5'-GUAAAGUUAUCCACAUGGUUCdTdT-3‘ ( SEQ ID N0:10 )30有义反义5 ‘-GCACGAGCUACCUCAGCAAGACGdTdT-3 ‘ ( SEQ ID NO: 11 ) 5'-AACGUCUUGCUGAGGUAGCUCGUGCUG-3‘ ( SEQ ID NO: 12 )50有义反义5'-CCUGAAGAAGGCAGAGAUAUGGCdAdA-3‘ ( SEQ ID NO: 13 ) 5'-UUGCCAUAUCUCUGCCUUCUUCAGGUU-3' ( SEQ ID NO: 14)51有义反义5 '-GACCAAAGAUGGAGUGAGAGAGGdTdT-3' ( SEQ ID NO: 15) 5'-AACCUCUCUCACUCCAUCUUUGGUCUU-3' ( SEQ ID NO:16 )52有义反义5'-GAAUUAGGCUGUAACUACUUUAUdAdA-3' ( SEQ ID NO:17) 5'-UUAUAAAGUAGUUACAGCCUAAUUCAC-3' ( SEQ ID NO: 18 ) *在本实验和以下所示的其它实验中，用作阴性对照的顺序打乱的RINA= “阴性 RINA”。顺序打乱的“阴性” RINA是从Ambion Inc可商业获得的阴性对照。
实施例3 通过逆转录酶PCR进行的VEGF-C和RhoA表达分析
按照来自ATCC的说明，在37°C下在5% CO2中培养HUVEC (人脐静脉血管内皮细胞，ATCC)和PC3(前列腺癌症细胞，ATCC)细胞系。在60-70%汇合时对细胞进行总RNA分离，然后利用具有较小改变的Qiagen快速通道细胞cDNA试剂盒(Qiagen Fast lane cell cDNA kit)进行第一链cDNA制备。简言之，沉淀20，000个细胞并用缓冲液FCW(Qiagen)洗涤一次。在室温下使用缓冲液FCP (Qiagen)裂解细胞15分钟。
通过添加gDNA 清除缓冲液(gDNA wipeout buffer) (Qiagen)在 42. 5°C下孵育 30 分钟而去除基因组DNA污染。通过添加Quantiscript逆转录酶(Quantiscript reverse transcriptase)在42. 5°C下持续45分钟，然后在95°C下持续3分钟而合成第一链cDNA。 所合成的第一链cDNA立即用于逆转录酶PCR或在进一步使用之前储存在-20°C。利用以下的引物序列通过PCR扩增第一链cDNA VEGF-C 正向引物5 ‘ -AAAGAACCTGCCCCAGAAAT-3 ‘ (SEQ ID NO 19)VEGF-C 反向引物5 ‘ -TGGTGGTGGAACTTCTTTCC-3 ‘ (SEQ ID NO 20)VEGF-C 探针5' -6-FAM-AATCCTGGAAAATGTGCCTG-3 ‘ (SEQ IDNO 21)RhoA 正向引物5 ‘ -TATCGAGGTGGATGGAAAGC-3 ‘ (SEQ ID NO 22)RhoA 反向引物5' -TTCTGGGGTCCACTTTTCTG-3‘ (SEQ ID NO 23)RhoA 探针5' -6-FAM-CCATCGACAGCCCTGATAGT-3 ‘ (SEQ ID NO 24)通过2%琼脂糖来分辨扩增的产物。图1中的箭头指出了所获得特异性基因产物的扩增子，显示了 HUVEC和PC3细胞表达VEGF-C和RhoA0参见图1，泳道1 (PC3 VEGF-C)， 泳道 3 (PC3 RhoA)，泳道 6 (HUVECVEGF-C)和泳道 8 (HUVEC RhoA)。实施例4 寡聚核苷酸转染/siRNA转染从ATCC获得HUVEC细胞(人脐静脉血管内皮细胞)、HeLa (子宫颈癌)、PC3 (前列腺癌)、HTB-38(结直肠癌)和ARPE-19(正常二倍体视网膜色素上皮细胞)细胞系，并在T-25培养瓶中以70-80%汇合进行培养，转染前24小时更换培养基。除非另外提到，对 siRNA的所有转染，在细胞系到达传代数目10之前使用细胞系。转染时，将细胞胰蛋白酶消化并以合适的细胞密度重新接种到24孔板或任何其它一次性标准组织培养塑料器皿中。 除非另外指明，用依既定实验中所用的细胞系而不同的细胞密度在24孔板中进行所有转染。在转染前1小时以合适的细胞密度接种24孔板的每个孔，且生长培养基不超过400 μ L， 并在含5% CO2的37°C培养箱中进行培养。将稀释的siRNA添加到该培养基中达IOnM的终浓度(将来自20 μ M贮液的0. 3 μ L的siRNA添加到97 μ L的Opti-MEM I中)。向稀释的 siRNA 中添加 3 μ L 的 Hiperfect 转染试齐[J (Hiperfect transfectionagent) (Qiagen)并涡旋混合，然后在室温下孵育10分钟。对于siRNA的组合，比如VEGF-C siRNA和RhoA siRNA, 混合每种单独的siRNA IOnM并进行使用。所有实验还包括获自Ambion的阴性RINA。将所有siRNA和转染混合物作为主要混合物，将来自该主要混合物的合适体积添加到接种细胞的孔。在孵育末期，彻底混合siRNA-脂质体复合物并轻轻滴加到每个孔中。 将24孔板的孔混合至均勻并将板在37°C CO2培养箱中孵育合适的孵育时间以用于细胞的进一步分析。通过在转染16小时后计数显示Cy3标记的siRNA(利用来自Ambio的阴性 RINA)的数目而获得每个细胞系的转染效率。转染16小时后，将细胞胰蛋白酶消化并在PBS 中洗涤一次，并悬浮于PBS中。利用倒置荧光显微镜观察悬浮在PBS中的细胞并在显微镜的 15个不同区域的每个区域计数荧光标记的细胞的数目和细胞总数。测定标记Cy3 siRNA的细胞的百分比从而得到转染效率。在所检验的所有细胞系中，HeLa具有97%的转染效率， 而ARPE-19仅有85%的效率，如表3所示。表3.通过Cy3标记的siRNA所测定的不同细胞系的转染效率的百分比
权利要求
1.一种组合物，包括调节VEGF-C表达的具有19到30个核苷酸的第一短核酸分子，其中所述第一短核酸分子包含第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸的序列与选自SEQ ID NO =USEQ ID NO 2和SEQ IDNO 3组成的组的序列至少95%互补；禾口调节MioA表达的具有19到30个核苷酸的第二短核酸分子，其中所述第二短核酸分子包含第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸的序列与选自 SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5禾口 SEQ IDNO :6组成的组的序列至少95%互补。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸的序列与选自SEQ ID NO =USEQ ID NO :2和SEQ IDNO :3组成的组的序列完全(100% )互补，并且其中所述第二核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸的序列与选自SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6组成的组的序列完全(100% )互补。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述具有19到30个核苷酸的第一短核酸分子包含选自由以下组成的组的SiNA 包含有义链SEQ ID NO 7和反义链SEQ ID NO 8的RINA 6 ；包含有义链SEQ ID NO 9和反义链SEQ ID NO 10的RINA 17 ；禾口包含有义链SEQ ID NO 11和反义链SEQ ID NO 12的RINA 30。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述具有19到30个核苷酸的第二短核酸分子包含选自由以下组成的组的SiNA 包含有义链SEQ ID NO 13和反义链SEQ ID NO 14的RINA 50 ；包含有义链SEQ ID NO 15和反义链SEQ ID NO 16的RINA 51 ；禾口包含有义链SEQ ID NO :17和反义链SEQ ID N0:18的RINA 52。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述具有19到30个核苷酸的第一短核酸分子包含含有有义链SEQ ID NO :11和反义链SEQ ID NO: 12的RINA 30，并且所述具有19到30个核苷酸的第二短核酸分子包含含有有义链SEQ ID NO: 17和反义链SEQ ID NO: 18的RINA 52。
6.如权利要求1所述的组合物，还包含药学上可接受的载体。
7.如权利要求1所述的组合物，还包含脂质、聚合物和/或单克隆抗体。
8.如权利要求1所述的组合物，其中至少一种短核酸分子与胆固醇轭合。
9.如权利要求1所述的组合物，其中具有19到30个核苷酸的短核酸分子选自由短干扰核酸(siNA)分子、短干扰RNA(siRNA)分子、双链RNA (dsRNA)分子、微小RNA ( μ RNA)分子、短发夹RNA(shRNA)分子和干扰DNA (DNAi)分子组成的组。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述短核酸分子是短干扰RNA(siRNA)。
11.一种用于减少或下调VEGF-A从细胞分泌的方法，所述方法包括将细胞与具有19到 30个核苷酸的短核酸分子相接触，所述短核酸分子包含与全长VEGF-C或I^hoA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子包含由 27个核苷酸组成的反义链，其中所述27个核苷酸链序列与全长VEGF-C或I^hoA基因中的 27个连续核苷酸至少95%互补。
13.一种用于减少或下调VEGF-A从细胞分泌的方法，所述方法包括将细胞与具有19到30个核苷酸的短核酸分子相接触，所述短核酸分子包含与全长VEGF-C或I^hoA基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% )互补的至少19个连续核苷酸的序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子包含由 27个核苷酸组成的反义链，其中所述27个核苷酸链序列与全长VEGF-C或I^hoA基因中的 27个连续核苷酸完全(100% )互补。
15.一种用于减少或下调VEGF-A从细胞分泌的方法，所述方法包括将细胞与具有19到 30个核苷酸的短核酸分子相接触，所述短核酸分子包含与选自由SEQ ID NO=USEQ ID NO 2和SEQ ID NO :3组成的组的序列至少95%互补的核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子包含与选自由SEQ ID NO =USEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3组成的组的序列完全(100% )互补的核苷酸序列。
17.一种用于减少或下调VEGF-A从细胞分泌的方法，所述方法包括将细胞与具有19到 30个核苷酸的短核酸分子相接触，所述短核酸分子包含与选自由SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6组成的组的序列至少95%互补的核苷酸序列。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子包含与选自由SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6组成的组的序列完全(100% )互补的核苷酸序列。
19.如权利要求11所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子直接调节VEGF-C的表达。
20.如权利要求11所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子抑制 VEGF-C表达，并且抑制VEGF-A表达或分泌。
21.如权利要求11所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子与调节 VEGF-A的表达或分泌的至少一种分子结合。
22.如权利要求11所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子选自由短干扰核酸(siNA)分子、短干扰RNA (siRNA)分子、双链RNA (dsRNA)分子、微小RNA ( μ RNA) 分子、短发夹RNA(shRNA)分子和干扰DNA (DNAi)分子组成的组。
23.如权利要求11所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子为19到 30个核苷酸之间，为25到四个核苷酸之间，或为27个核苷酸。
24.如权利要求11所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子包含选自由以下组成的组的siNA:包含有义链SEQ ID NO 7和反义链SEQ ID NO 8的RINA 6 ；包含有义链SEQ ID NO 9和反义链SEQ ID NO 10的RINA 17 ；禾口包含有义链SEQ ID NO 11和反义链SEQ ID NO 12的RINA 30。
25.如权利要求11所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子包含选自由以下组成的组的siNA:包含有义链SEQ ID NO 13和反义链SEQ ID NO 14的RINA 50 ；包含有义链SEQ ID NO 15和反义链SEQ ID NO 16的RINA 51 ；禾口包含有义链SEQ ID NO 17和反义链SEQ ID NO 18的RINA 52。
26.如权利要求11所述的方法，其中将细胞与至少0.6ηΜ的浓度的所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子接触后，细胞中的VEGF-A分泌被减少或被下调。
27.一种用于减少或下调VEGF-A从细胞分泌的方法，所述方法包括将细胞与具有19到 30个核苷酸的第一短核酸分子和具有19到30个核苷酸的第二短核酸分子相接触，其中所述第一短核酸分子包含与全长VEGF-C基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列，并且其中所述第二短核酸分子包含与全长MioA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少 95%互补的至少19个连续核苷酸的序列。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述第一短核酸分子包含与全长VEGF-C基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% )互补的至少19个连续核苷酸的序列，并且其中所述第二短核酸分子包含与全长MioA基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% ) 互补的至少19个连续核苷酸的序列。
29.一种用于治疗眼疾患或新生血管疾病的方法，所述方法包括向受治疗者施用权利要求1所述的组合物。
30.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向受治疗者施用权利要求1所述的组合物。
31.一种用于减少或抑制组织中血管生成或新血管生成的方法，所述方法包括将组织与具有19到30个核苷酸的第一短核酸分子和具有19到30个核苷酸的第二短核酸分子相接触，其中所述第一短核酸分子包含与全长VEGF-C基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列，并且其中所述第二短核酸分子包含与全长MioA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少 95%互补的至少19个连续核苷酸的序列。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的第一短核酸分子包含与全长VEGF-C基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% )互补的至少19个连续核苷酸的序列，并且其中所述第二短核酸分子包含与全长MioA基因中的至少19个连续核苷酸的序列完全(100% )互补的至少19个连续核苷酸的序列。
33.一种用于在组织中减少或抑制血管生成或新血管生成的方法，所述方法包括将组织与权利要求1所述的组合物相接触。
34.一种用于在细胞中减少或抑制ROCK磷酸化的方法，所述方法包括将细胞与具有19 到30个核苷酸的短核酸分子相接触，所述短核酸分子包含与全长MioA基因中的至少19个连续核苷酸的序列至少95%互补的至少19个连续核苷酸的序列，其中所述ROCK的磷酸化被降低或被抑制，但ROCK表达没有被敲低。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子调节 RhoA表达，并且其中所述短核酸分子包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列中的至少19个连续核苷酸与选自由SEQ ID NO 4,SEQID NO :5和SEQ ID NO :6组成的组的序列至少95% 互补。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述具有19到30个核苷酸的短核酸分子包含选自由以下组成的组的siNA:包含有义链SEQ ID NO 13和反义链SEQ ID NO 14的RINA 50 ；包含有义链SEQ ID NO 15和反义链SEQ ID NO 16的RINA 51 ；禾口包含有义链SEQ ID NO :17和反义链SEQ ID N0:18的RINA 52。
37.如权利要求1所述的组合物用于抑制血管生成或新血管生成的用途。
38.如权利要求37所述的用途，其中所述血管生成发生于低氧条件下或高血糖条件下。
39.如权利要求38所述的用途，其中所述血管生成与眼疾患相关。
40.如权利要求39所述的用途，其中所述眼疾患选自视网膜病变和青光眼。
41.一种包含调节VEGF-C表达的短核酸分子的组合物，和所述组合物的制备方法和所述组合物如以上所要求保护的在本文的实施例和附图中充分示例说明的用途。
全文摘要
本发明涉及调节参与新生血管性血管生成的VEGF-C和/或RhoA的表达的短干扰核酸分子(siNA，比如siRNA)的应用。在本发明中，VEGF-C和/或RhoA基因表达的抑制导致了VEGF-A的下降的表达，VEGF-A是血管生成的起始和持续所需的。并且，本发明还涉及RhoA表达水平与VEGF-C表达水平的抑制，以得到下调血管生成所需的两种不同的靶标的益处。本发明描述了用于新血管生成的抑制的化合物、组合物和方法。在某些实施方案中，本发明涉及用于抑制新生血管形成的方法，以及用于治疗诸如年龄相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、青光眼和其它新生血管性疾病的眼疾病的化合物，比如VEGF-C siRNA和RhoAsiRNA。
文档编号A61P9/00GK102272307SQ200980154053
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月20日 优先权日2008年11月21日
发明者克里什那·阿迪帕利·穆拉里, 吉乐·莎伊拉迦, 库马尔·巴拉特 申请人:利莱恩斯生命科学有限公司