专利名称：一种中药两头尖中竹节香附素a含量高效液相色谱检测方法
技术领域：
本发明涉及中药两头尖的检测方法，特别涉及中药两头尖及其制剂的含量检测方法。
背景技术：
两头尖又名竹节香附，为两头尖为毛莨科植物多被银莲花AnemoneraddeanaRegel的干燥根茎。主要分布于东北三省及山东、河北、山西等地，以吉林省产量最多。药材多夏季采挖，除去残茎及须根，晒干。此药首载于明朝刘文泰所著《本草品汇精要》。具有“祛风除湿，消痈肿”之功效。早在清代，王旭高的“定癌散”曾以两头尖治疗乳癌。现在临床用于风寒湿痹，手足拘挛，骨节疼痛，痈疽肿痛。多与其它药物配伍，不单方入药，是著名中成药“活络丹”和“再造丸”的主要原料。本品富含三萜皂苷类，其中三萜皂甙银莲花素A为抗肿瘤的主要有效成分之一。关于两头尖药材中的银莲花素A检测方法，在现有技术中均为采用高效液相色谱法使用紫外检测器检测进行含量测定，由于是皂苷类成分，在紫外吸收光谱上，只有末端吸收，通常紫外波长选择为206nm左右作为测定波长，因此色谱峰响应值低，灵敏度差，流动相及杂质干扰较严重，从而使整个方法重现性不好，测定结果误差很大。2010年版中国药典一部两头尖项下，采用甲醇索氏提取、乙醚脱脂、水饱和正丁醇反复萃取的样品处理方法，并辅以乙腈与0. 磷酸溶液梯度洗脱方式为流动相的色谱条件，才得以完成高效液相色谱法-紫外检测器检测银莲花素A的含量，样品处理时间约10 15小时，由于供试品处理方法繁琐，易导致测定结果误差，梯度洗脱方式的流动相又极易使色谱峰分离基线不稳。并且采用上述现有方法对成药中两头尖药材银莲花素A含量测定，几乎无法进行。
发明内容
本发明提供一种中药两头尖中竹节香附素A含量高效液相色谱检测方法，以解决现有技术中存在的操作复杂、重现性差、灵敏度低的问题，该方法适用于两头尖药材、两头尖制剂的质量控制。本发明采取的技术方案是采用蒸发光散射检测器，以外标两点法定量，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈与水的混合液作为流动相，流动相的流速为每分钟0. 2 Iml ；样品预处理采用甲醇超声处理法。本发明方法包括以下步骤1、色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为80 93 20 7的乙腈-水或82 95 18 5的甲醇-水；蒸发光散射检测器检测；流动相的流速为每分钟0. 2 Iml ；蒸发光散射检测器检测的漂移管温度60 130°C，空气流速1. 0 3. lL/min。2、对照品溶液的制备精密称取竹节香附素A对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；
3、供试品溶液的制备取两头尖粉末2 8g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理0. 5 1小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过；量取续滤液10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶并稀释至刻度，摇勻，用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得；4、测定法精密吸取对照品溶液5μ 1、15μ 1，供试品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，以外标二点法对数方程计算，即得；有益效果本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定中药两头尖中竹节香附素A的含量，操作方法相比已有方法十分简单。方法学验证表明，该法分离效果良好，方法线性、稳定性、重现性、加样回收率等方法学考察均符合定量测定的要求。能够更有效地控制中药两头尖及其制剂的产品质量。样品处理时间约0.5小时，大大提高了检测效率，减少了环境污染，节约了检测成本，方法简便、快捷、准确。本发明还适合用两头尖作为原料药或原料药之一的制剂，包括片剂、粒剂等临床或药学上可接受的常用剂型。
图1是对照品竹节香附素A蒸发光散射检测器检测图谱；图2是两头尖药材蒸发光散射检测器检测图谱；图3是前列通片蒸发光散射检测器检测图谱。
具体实施例方式仪器日本岛津LC-IOAtvp高效液相色谱仪，浙江大学2010双通道色谱工作站；美国奥泰ELSD2000ES蒸发光散射检测器；梅特勒.托利多AB^5_S电子天平。试药竹节香附素A化学对照品，含量测定用，中国药品生物制品检定所，纯度经检查符合含量测定用化学对照品的技术要求，含量为> 98% ；甲醇色谱纯，水自制双蒸水；样品中药两头尖药材。前列通片，批号20100225(广州中一药业有限公司)实施例1(1)、色谱条件与系统适用性试验以为填充剂；流动相乙腈-水80 20;蒸发光散射检测器检测；流速0. 2ml/min ；蒸发光散射检测器检测的漂移管温度60°C，空气流速1. 0L/minoO)、对照品溶液的制备精密称取竹节香附素A对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供试品溶液的制备取两头尖粉末2g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理0. 5小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过；量取续滤液10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶并稀释至刻度，摇勻，用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得；(4)、测定法精密吸取对照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供试品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，以外标二点法对数方程计算，即得；实施例2
(1)、色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水86 14 ；蒸发光散射检测器检测；流速0. 6ml/min ；蒸发光散射检测器检测的漂移管温度90°C，空气流速2. OL/min。O)、对照品溶液的制备精密称取竹节香附素A对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供试品溶液的制备取两头尖粉末5g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理0. 8小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过；量取续滤液10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶并稀释至刻度，摇勻，用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得；(4)、测定法精密吸取对照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供试品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，以外标二点法对数方程计算，即得；实施例3(1)、色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水93 7;蒸发光散射检测器检测；流速lml/min;蒸发光散射检测器检测的漂移管温度:130°C，空气流速3. lL/min。O)、对照品溶液的制备精密称取竹节香附素A对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供试品溶液的制备取两头尖粉末8g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过；量取续滤液10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶并稀释至刻度，摇勻，用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得；(4)、测定法精密吸取对照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供试品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，以外标二点法对数方程计算，即得；实施例4(1)、色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相甲醇-水82 18;蒸发光散射检测器检测；流速0. 2ml/min;蒸发光散射检测器检测的漂移管温度60°C，空气流速1. OL/min。O)、对照品溶液的制备精密称取竹节香附素A对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供试品溶液的制备取两头尖粉末2g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理0. 5小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过；量取续滤液10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶并稀释至刻度，摇勻，用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得；(4)、测定法精密吸取对照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供试品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，以外标二点法对数方程计算，即得；实施例5(1)、色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相甲醇-水95 5;蒸发光散射检测器检测；流速lml/min;蒸发光散射检测器检测的漂移管温度:130°C，空气流速3. lL/min。
O)、对照品溶液的制备精密称取竹节香附素A对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. 4mg的溶液，即得；(3)、供试品溶液的制备取两头尖粉末8g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理1小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过；量取续滤液10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶并稀释至刻度，摇勻，用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得；(4)、测定法精密吸取对照品溶液5 μ 1、15 μ 1，供试品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，以外标二点法对数方程计算，即得；实施例6(1)、色谱条件与系统适用性试验色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Diamonsil C18, 250 X 4. 6mm ；5 μ ；流动相甲醇-水 85 15 ；流速0. 8ml/min ；蒸发光散射检测器检测的漂移管温度80°C，空气流速2. OL/min ；柱温室温。O)、对照品溶液的制备精密称取竹节香附素A对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. 42mg的溶液，即得。(3)、供试品溶液的制备取中药两头尖粉末5g，过三号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过；量取续滤液10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶并稀释至刻度，摇勻，用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得；0)、测定法分别精密吸取对照品溶液各5 μ 1、15 μ 1、供试品溶液10 μ 1注入液相色谱仪。此条件下竹节香附素A与其它组分达到基线分离，分离度R > 1. 5，理论塔板数按竹节香附素A计算大于6000，竹节香附素A保留时间约为14分钟。考察了甲醇-水和乙腈-水等不同的流动相比例及不同的流动相流速，结果流动相为乙腈-水(80 93 20 7)或甲醇-水(82 95 18 5)，流速为每1分钟0. ^iil至lml，竹节香附素A均能分离；以流动相为乙腈-水(80 93 20 7)或甲醇-水(82 95 18 5)，流速为每1分钟0.2ml至0.8ml，效果更优。线性关系考察精密称取竹节香附素A对照品适量，加甲醇制成每Iml中含竹节香附素AO. 42mg的溶液，作为对照品溶液。分别精密吸取4、8、12、16、20μ 1，注入高效液相色谱仪，按上述条件测定，以峰面积的自然对数为纵坐标，竹节香附素A进样量的自然对数为横坐标，线性回归，得回归方程为LnA = 60243LnC+l. 531,r = 0. 9993。可用外标两点法对数方程进行测定和计算。精密度试验取同一对照品溶液，连续进样5次，记录峰面积，计算精密度。稳定性试验精密吸取同一供试品溶液，每隔一定时间进样一次，比较测定结果的稳定性。重现性试验取同一批号样品，进行5次平行测验(即η =幻，计算相对标准偏差(RSD % )，比较重现性。回收率试验本试验采用加样回收法，精密称取已知含量的样品5份，分别精密加入一定量竹节香附素A对照品，按含量测定法进行测定，计算竹节香附素A的回收率。结果实验结果表明竹节香附素A的检测限为10ng，竹节香附素A的线性范围为1.68 8.4118;精密度为0. 23% ；竹节香附素A在12小时内稳定，RSD为1.21% ；本测定方法具有良好的重现性，RSD为1.02% ；竹节香附素A的加样回收率为99. 01%，RSD为1. 55% ；经测定中药两头尖药材中竹节香附素A含量为0. 34%。实施例7 前列通片含量测定(1)、色谱条件与系统适用性试验色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Diamonsil C18, 250 X 4. 6mm ；5 μ ；流动相甲醇-水 85 15，流动相的流速0. 8ml/min ；蒸发光散射检测器检测的漂移管温度80°C，空气流速2. OL/min ；柱温室温。O)、对照品溶液的制备精密称取竹节香附素A对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. 42mg的溶液，即得。(3)、供试品溶液的制备，取前列通片，研细，混勻，取约6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理0. 5小时，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过；量取续滤液10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶并稀释至刻度，摇勻，用0. 45 μ m的微孔滤膜滤过，即得。阴性样品溶液的制备阴性样品溶液是按处方比例称取除中药两头尖外其余辅料，按制法制成中药两头尖阴性样品，再取此阴性样品按上述“供试品溶液的制备”方法制备不含中药两头尖的阴性样品溶液。0)、测定法分别精密吸取对照品溶液5 μ 1、15 μ 1、供试品溶液及不含中药两头尖的阴性样品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪。此条件下竹节香附素A与其它组分达到基线分离，分离度R > 1. 5，理论塔板数按竹节香附素A计算大于6000，竹节香附素A保留时间约为14分钟，阴性样品溶液色谱在相应位置无吸收峰，可见阴性无干扰。检测结果经测定前列通片中竹节香附素A含量为2. 9aiig/片。
权利要求
1.一种中药两头尖中竹节香附素A含量的高效液相色谱检测的方法，其特征在于采用蒸发光散射检测器，以外标两点法定量，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈与水的混合液作为流动相，流动相的流速为每分钟0. 2 Iml ；样品预处理采用甲醇超声处理法。
2.如权利要求1所述的中药两头尖中竹节香附素A含量的高效液相色谱检测的方法，其特征在于流动相为80 93 20 7的乙腈-水或82 95 18 5的甲醇-水。
3.如权利要求1所述的中药两头尖中竹节香附素A含量的高效液相色谱检测的方法，其特征在于流动相的流速为每分钟0. 2 Iml ；蒸发光散射检测器检测的漂移管温度60 130°C，空气流速1. 0 3. lL/min。
全文摘要
本发明涉及一种中药两头尖中竹节香附素A含量的高效液相色谱检测方法，属于中药两头尖的检测方法，该方法采用蒸发光散射检测器，以外标两点法定量，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇或乙腈与水的混合液作为流动相，流动相的流速为每分钟0.2～1ml；样品预处理采用甲醇超声处理法。优点是灵敏度高、稳定性、重现性良好，能够有效地控制中药两头尖药材及其制剂的质量。
文档编号A61P35/00GK102379934SQ20101027509
公开日2012年3月21日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者于江波, 仲崇琳, 杨美林 申请人:仲崇琳