G-csf用于延长卒中溶栓治疗的治疗时间窗的用途的制作方法

专利名称：G-csf用于延长卒中溶栓治疗的治疗时间窗的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)多肽在预防急性卒中后梗死半影 (penumbra)中神经元细胞死亡中的用途。更特别地，本发明提供了通过先施用G-CSF多肽并且随后进行溶栓疗法而增加急性卒中后溶栓治疗的治疗窗的方法。
背景技术：
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)最初被鉴定为一种负责产生嗜中性粒细胞的髓系中的造血因子。最近，鉴定了该因子在中枢神经系统中的存在和活性。G-CSF及其受体在脑缺血之后上调，G-CSF起抗神经元凋亡的作用，穿过完整的血脑屏障，并减小实验性卒中模型的梗死面积(Schneider 等，J Clin Invest. 2005,115 :2083 ；Zhao 等，Exp Neurol. 2007， 204 569 ；Schabitz 等，Stroke 2003,34 :745 ；Six 等，Eur J Pharmacol. 2003,458 :327 ； Shyu 等，Circulation 2004,110 :1847 ；Gibson 等，2005，25 :431 ；Komine-Kobayashi 等，J Cereb Blood Flow Metab. 2006，26 :402 ;Schneider 等，BMC Biol. 2006，4 :36)。这导致了在急性缺血性卒中患者中的多项较小的临床试验(综述，Schabitz等，Stroke 2006,37 1654 ;Schabitz 等，Trends Pharmacol Sci. 2007,28 157) 然而，尽管对已公开数据进行的荟萃分析支持该因子在实验性卒中模型中功效的广泛基础(Mirmerup等，Stroke 2008， 39:1856)，但是大多数实验是使用瞬时缺血模型进行的。特别地，没有针对栓塞模型的公开数据。用重组的组织纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA)进行溶栓仍然是迄今唯一批准的急性卒中疗法。遗憾的是，rt-PA的使用受到相对窄时间窗的限制。最近证实其效力可达发生卒中症状后4. 5小时，但是效力随时间而迅速降低(Hacke等，Lancet 2004,363 :768 ； Hacke等，NEngl JMed. 2008,359 :1317)。治疗效力随时间降低的生物学原因很可能在于细胞活力随灌注不足脑区域中的缺血/缺氧而进行性受损。在再灌注期间，这可伴有自由基的生成(即再灌注损伤)。在临床上，这一概念得到如下数据的支持该数据表明在MRI上灌注/扩散(PWI/DWI)错配的存在可鉴定其中溶栓可能在治疗时间窗以后更有效的患者 (Fisher 等，Cerebrovasc Dis. 2006，21，增刊 2 64)。一种延长溶栓时间窗的策略可以是保护处于鉴定为PWI/DWI错配区域之风险的组织。已经采用正常气压的高压氧治疗(Henninger等J Cerb Blood Flow Metab. 2007， 27 1632)和刺激蝶腭神经节证实了该假说的概念验证(proof-of-conc印t) (Herminger和 Fisher Stroke 2007,38:2779)。发明简述卒中引起的脑梗死包括梗死核心(已不可逆损伤的组织)和半影(处于危险但仍然可抢救的组织)。溶栓(特别是用组织纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA))被认为是一种治疗急性缺血性卒中的有效疗法，但是只有在卒中发作后短时间内(治疗窗)开始该治疗才有效。在脑缺血的第一个小时之内，可挽救的半影组织的体积随时间而强烈地、连续地减小。此后，建立溶栓性再灌注在预防神经元细胞进一步死亡和改善临床结果方面无效或甚至有害。t-PA必须在卒中发作之后的最初4. 5小时内，优选3小时之内施用，然而该时期有时候被医师延长多达总共6小时。为此，早期的溶栓介入是通常所期望的。然而，另一方面，溶栓介入可具有严重的出血不良副作用，其恶化了卒中患者的临床后果。因此，溶栓治疗需要在施用血栓溶解剂之前进行神经成像以排除出血和评估基本的凝血参数。然而，在此期间，梗死半影中的神经元细胞继续死亡，溶栓治疗窗可能关闭。需要一种方法或试剂，其能够在卒中发作之后不久使半影中神经元细胞停止死亡 (“半影冷冻(penumbra freezing) ”)，从而延长治疗窗用于之后的溶栓治疗，以允许进行必要的仔细诊断检查和治疗决策。本发明人发现，当在卒中模型中施用G-CSF时，其能够保护半影区，从而防止梗死面积进一步扩大。本领域中公认，对半影组织的保护程度对于溶栓再灌注的有益效果而言是至关重要的。因为G-CSF在急性缺血性卒中患者中是安全的，并且至少在动物模型中没有指征表明其可引起脑内出血，或者增加全身出血的风险，因此其可以在重症监护开始时立即施用给卒中患者，而不需要广泛的在先诊断检查，或者甚至在入院或运送到医院之前由医务工作者或其他有资格的健康专业人员给予。G-CSF可被认为是急救药物，其可以在救护车中给予以延长时间窗，并可改善溶栓(例如通过t-PA)后的结果。本发明涉及G-CSF用于延长后续的急性卒中溶栓治疗的治疗窗以允许必要的溶栓前诊断检查的用途。一个方面是治疗患有急性卒中的患者的方法，包括首先施用G-CSF，接着进行诊断检查(所述检查使得能够做出溶栓疗法是否适合于该患者的决定)，以及任选地基于诊断检查的结果随后进行溶栓治疗。这样的诊断检查可以是例如排除出血性卒中，其为溶栓疗法的禁忌症。


图1 在通过单凝块注射(clot injection)诱导栓塞性缺血之后M小时的梗死体积。显示从TTC染色的切片得到的校正的水肿体积。在凝块注射(静脉内)1小时之后和凝块注射(腹膜内)4小时之后，用G-CSF处理大鼠，各自120yg/kg体重。与载体组相比，G-CSF处理导致显著更小的梗死(ρ < 0. 05)。图2 在sMCAO模型中扩散加权损伤(diffusion-weighted lesion)的时空进展。 使大鼠进行持久的MCA细丝闭塞，并在闭塞之后监测扩散加权损伤的进展3小时。在闭塞发生之后60分钟和4小时给予G-CSF或载体溶液。在60分钟时间点获取图像之前开始60 分钟剂量。在CBF缺乏方面，组间和组内没有统计学差异。除了载体组中120分钟和180 分钟以外，所有时间点CBF都显著地大于ADC。在90分钟开始，G-CSF组显示出比载体组显著更小的ADC体积。G-CSF组中的最终梗死体积也显著小于载体组(ρ = 0.007)。显示为平均值+/-SEM ；* φ < 0. 05 ；PWI体积(A)，DffI和最终梗死(B)，绝对(C)和相对错配(D)。图3 不同物种(人(SEQ ID NO :6)、小鼠(SEQ ID NO 11)、大鼠(SEQ ID N0:12)、猫(SEQ ID NO: 13)、牛(SEQ ID NO: 14)和猪(SEQ ID NO :15))的 G-CSF 肽序列的比对显示了强保守氨基酸的和较弱保守氨基酸的位置。在进化强保守的氨基酸通常被认为对于蛋白质的结构和功能来说至关重要。发明详述本发明人描述了下述这一发现其使得G-CSF理想地适于作为卒中治疗中的时间窗延长剂以便进行任何进一步治疗，优选卒中溶栓治疗(例如，用rt-PA)。这是一种非常有用的应用，因为限制卒中溶栓治疗(例如rt-PA治疗)有用性的主要问题是由于效力随时间丧失而导致的有限时间窗。基于临床研究，rt-PA通常必须在卒中发作之后的最初3至4. 5小时内施用。有时，某些医师可能在多达6小时之内施用该药物。因为必须对个体患者排除rt-PA的出血副作用的可能性以避免情况恶化，所以常常很难在该时间窗内获得安全的溶栓治疗。可在疑似脑损伤已经出现后很快给予G-CSF，因为其并不会使可能的出血性卒中复杂化，并且其甚至在高剂量下也是良好耐受的。这一发现与下述事实有关在持久细丝闭塞的卒中动物模型中，在持续缺血的情况下，G-CSF使扩散加权缺乏的情况保持稳定。这种效应也称为“半影冷冻”(“penumbra freezing”)。这意味着脑组织破坏可以延迟至直到可应用溶栓治疗以重新打开闭塞的血管。在单独的G-CSF可能不足以能够使卒中完全恢复的情况下，本发明出乎意料的发现使得能够进行联合或连续治疗，其包括先向对象施用G-CSF的步骤以及随后施用血栓溶解剂 (例如rt-PA)的步骤。在先的G-CSF施用允许推迟开始溶栓治疗至卒中发作后的最初几天内，优选在第一个M小时内，更优选在第一个12小时之内。这允许在卒中之后或疑似卒中之后对患者进行更精细的诊断检查，以确保安全有效的附加溶栓治疗。这种早期G-CSF施用和推迟溶栓治疗(例如施用rt-PA)之组合的优点就本发明人所知，之前未公开过。出人意料地，甚至在血管闭塞期间，G-CSF在保护半影组织方面也是有效的。根据本发明，在卒中发作后的第一个12小时期间、优选地在第一个6小时期间、 更优选地在第一个3小时期间施用G-CSF。G-CSF的优选使用是在小时期间静脉内 (i. v.)或皮下(s. c.)给予至少10μ g/kg体重、至少90μ g/kg体重或至少130μ g/kg体重的剂量，使时间窗长达M小时。根据本发明，其包括G-CSF的施用可以在施用血栓溶解剂之前完成或者可以在施用血栓溶解剂之后继续进行。进一步地，本发明还包括可施用G-CSF仅一次。或者，G-CSF 还可以在至少两个分开的步骤中施用。根据本发明，优选使用人重组G-CSF，例如非格司亭(Filgrastim)。根据本发明， 还可以使用本领域技术人员已知的功能性G-CSF衍生物。本发明方法适于患有卒中或有理由怀疑患有卒中的哺乳动物(优选人)的治疗。作为本发明的一个方面，提供了一种治疗哺乳动物对象卒中的方法，其包括步骤 (a)开始向所述对象施用治疗活性量的G-CSF或功能活性G-CSF衍生物，以及随后的(b)向该对象施用治疗活性量的血栓溶解剂。作为本发明的另一个方面，提供了一种治疗哺乳动物对象卒中的方法，其包括步骤(a)向所述对象施用治疗活性量的G-CSF或功能活性G-CSF衍生物，以及随后的(b)向该对象施用治疗活性量的血栓溶解剂。所述哺乳动物对象可以是人。
作为本发明的一个实施方案，提供了一种如上所述的方法，其中所述对象在步骤 (a)之后和步骤(b)之前进行诊断检查，以排除在步骤(b)期间发生出血或其它不良副作用的风险。上述步骤(b)的“血栓溶解剂”意指能够至少部分溶解纤维蛋白-血小板凝块的任何试剂。血栓溶解剂的实例包括链激酶、尿激酶原、尿激酶、去氨普酶和组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)。虽然可以使用天然的t-PA，但优选使用重组t-PA(rt-PA，例如阿替普酶)。本发明还可使用上述血栓溶解剂的混合物、生理活性片段或突变体形式。本文使用的术语“组织型纤维蛋白溶酶原激活剂”旨在包括这样的杂合体、片段和突变体，以及天然来源或重组来源的组织型纤维蛋白溶酶原激活剂。作为本发明的又一个实施方案，提供了一种如上所述的方法，其中在卒中发作之后的第一个6小时之内开始步骤(a)的施用G-CSF或功能活性G-CSF衍生物，和/或在卒中发作之后的第一个M小时之内、或在卒中发作之后的4. 5小时至M小时期间、或在卒中之后的6小时至M小时期间，开始步骤(b)的施用所述血栓溶解剂。作为本发明的再一个实施方案，提供了一种如上所述的方法，其中在卒中发作之后的第一个6小时、第一个4. 5小时或第一个3小时之内向所述对象施用步骤(a)的G-CSF 或功能活性G-CSF衍生物，和/或在卒中发作之后的第一个M小时之内、或在卒中发作之后的4. 5小时至M小时期间、或在卒中之后的6小时至M小时期间，开始步骤(b)的施用所述血栓溶解剂。作为本发明的一个实施方案，提供了一种如上所述的方法，其中在步骤(a)的 G-CSF或功能活性G-CSF衍生物的施用、开始施用或施用结束与步骤(b)的开始施用所述血栓溶解剂之间存在至少0. 5小时、至少1. 5小时或至少3小时的时间段。优选地，该时间段用于所述对象的诊断检查，评价溶栓治疗的出血或其它不良副作用的风险。作为本发明的另一个方面，提供了一种治疗患有急性卒中的哺乳动物对象的方法，包括初始G-CSF施用或初始G-CSF施用的开始，接着诊断检查(所述检查评价对象溶栓治疗的风险)，以及任选地基于该诊断检查的结果随后进行溶栓治疗。这样的诊断检查可以例如排除作为溶栓治疗之禁忌症的出血性卒中。作为本发明的另一个实施方案，提供了一种如上所述的方法，其中以至少IOyg/ kg体重、至少90 μ g/kg体重或至少130 μ g/kg体重的剂量静脉内或皮下给予步骤(a)的所述 G-CSF。作为本发明的又一个方面，提供了 G-CSF或其功能活性衍生物，其用于制备用于治疗患有急性卒中的哺乳动物对象的药物组合物，其中所述对象在卒中发作之后的最初6 小时之内或卒中发作之后的3至6小时的时间段内或在卒中发作之后的4. 5至6小时的时间段内被收治进卒中单元或临床，并且其中在不使用本发明方法时评价对象对于溶栓治疗的出血或其它严重不良副作用之风险所必需的诊断检查所消耗的时间将导致超出溶栓治疗的治疗窗。本文上下文中的溶栓治疗可以是例如施用t-PA，如rt-PA。本文上下文中的溶栓治疗的治疗窗可以在卒中发作之后的3小时之内、4. 5小时之内或6小时之内。本文上下文中的诊断检查可以持续至少0. 5小时、至少1. 5小时或至少3小时。本文上下文中的哺乳动物对象可以在被收治进卒中单元或诊所之后立即，或者在卒中发作之后的第一个6 小时之内、第一个4. 5小时之内或第一个3小时之内，接受G-CSF或其功能活性衍生物。进一步，在本文上下文中，如果诊断检查允许，则所述哺乳动物对象可随后接受溶栓治疗。本文上下文中的所述哺乳动物对象可以是人。本文上下文中的G-CSF可以是人G-CSF，优选非
格司亭。上述实施方案的诊断检查意指对患有急性卒中的哺乳动物患者的任何检查，其允许、改善或支持采用溶栓治疗(特别是采用t-PA的溶栓治疗)对患者是适合还是其禁忌症的决定。这样的诊断检查可以是例如，但不限于医学成像，如磁共振成像(MRI)、血液参数(如凝血因子)的分析、或对患者既往病历的调查。因为患有急性卒中的患者常常无意识或意识混乱，所以调查患者既往病历可能很耗时。应在开始治疗前通过诊断检查排除的急性卒中溶栓治疗(特别是t-PA治疗)的禁忌症例如但不限于活跃性内出血、脑血管意外史、近期颅内或脊柱内外科手术或创伤、颅内肿瘤、动静脉畸形、或动脉瘤、出血素质(包括但不限于当前使用口服抗凝血药(例如华法林钠)，国际标准化比值(International Normalized Ratio, INR) > 1.7，凝血酶原时间(PT) > 15秒，在卒中发作之前48小时之内施用肝素和就诊时活化的部分凝血酶原时间(aPTT)延长，或者血小板计数< 100,000/ mm3)、治疗时不受控制的高血压(例如，收缩压> 185mm Hg，或舒张压> IlOmm Hg)、颅内出血、蛛网膜下出血、近期(在3个月之内)颅内或脊柱内外科手术、严重的头部创伤、之前卒中、颅内出血史、卒中发作时癫痫。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种众所周知的生长因子。可以在本文描述的本发明方法中使用的G-CSF是人G-CSF(前体形式，短的剪接变体(SEQ ID NO 2)；成熟形式， 短的剪接变体(SEQ ID NO 4)；前体形式，长的剪接变体(SEQ ID NO 6)；成熟形式，长的剪接变体(SEQ ID NO 8)；非格司亭(SEQ ID NO 10))或已知可获得的各种功能性变体、突变蛋白和模拟物。在随后的讨论中，将这些都称为G-CSF衍生物。可用于本发明的所述G-CSF是与本文描述的人G-CSF氨基酸序列具有至少70%、 优选至少80%、更优选至少90%的同一性的蛋白质。在另一个实施方案中，可以使用的 G-CSF是由与人G-CSF编码序列(前体形式，短剪接变体(SEQ ID NO=D ；成熟形式，短剪接变体(SEQ ID NO 3)；前体形式，长剪接变体(SEQ ID NO 5)；成熟形式，长剪接变体(SEQ ID NO 7)；非格司亭(SEQ ID NO :9))具有至少70%、优选80%、更优选至少90%、95%和 97%同一性的多核苷酸序列编码的那些，这些多核苷酸将在严格条件下与人G-CSF编码序列的编码多核苷酸序列杂交。术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括在该条件下多核苷酸以比其它序列可检测的更大程度(例如，至少为背景的2倍)与其目的序列杂交。严格条件将为如下那些在pH 7. 0至8. 3下盐浓度小于约1. 5M Na离子(通常为约0. 01至1. OM Na 离子浓度(或其它盐))，温度对于短探针(例如10至50个核苷酸)而言为至少约30°C和对于长探针(例如大于50个核苷酸)而言为约60°C，例如，高严格条件包括在37°C下，在50% 的甲酰胺、IM NaClU % SDS下杂交和在60至65°C下，在0. IX SSC中清洗(参见Tijssen， Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分第 2 章，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" , Elsevier, New York(1993)；以及 Current Protocols in Molecular Biology,第 2 章，Ausubel 等编，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York(1995))。氨基酸和多核苷酸的同一性、同源性和/或相似性可以使用 ClustalW 算法(MEGALIGN , Lasergene, Wisconsin)来测定。
各种G-CSF功能性受体、突变蛋白和模拟物的实例包括G-CSF的功能片段和变体(例如，结构和生物学方面与野生型蛋白质类似，并且具有至少一个生物学方面等同的结构域)、其化学衍生物(例如，包含另外的化学部分，如聚乙二醇和其聚乙二醇衍生物， 和/或糖基化形式如Lenogastrim )、和G-CSF的肽模拟物(例如，在结构和/或功能上模拟肽的低分子量化合物(参见例如Abell，Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics, London :JAI Press(1997) ；Gante, Angew Chem. 1994,106 :1780 ；Olson 等，J Med Chem. 1993,36 :3039)。G-CSF衍生物的其它实例包括白蛋白与G-CSF的融合蛋白(Albugranin )或其它融合修饰物，例如在美国专利No. 6，261, 250中公开的那些；PEG-G-CSF缀合物及其它PEG 化形式；描述在 WO 00/44785 和 Viens 等，J Clin Oncology 2002，6 :24 中的那些；G-CSF 的正亮氨酸类似物，其描述于美国专利No. 5，599，690中；G-CSF模拟物，例如在WO 99/61445、 WO 99/61446和Tian等，Science 1998，281 :257中描述的那些；G-CSF突变蛋白，其中已经修饰、删除或插入了单个或多个氨基酸，如在美国专利No. 5，214，132和5，218，092中所描述的；在美国专利No. 6，261，550和美国专利No. 4，810，643中描述的那些G-CSF衍生物；以及嵌合分子，其包含G-CSF的全部序列或部分序列与其它序列片段的组合，例如来立司亭， 参见例如 Streeter 等，Exp Hematol. 2001,29 :41，Monahan 等，Exp Hematol. 2001,29 :416， Hood 等，Biochemistry 2001,40 :13598, Farese 等，Stem Cells 2001，19 :514，Farese 等， Stem Cells 2001，19 :522，MacVittie 等，Blood 2000,95:837。另外，G-CSF 衍生物还包括那些在SEQ ID NO 4的17、36、42、64和74位的半胱氨酸被另外的氨基酸(如丝氨酸)替换(或类似地在SEQ ID N0:10上进行)的那些，如在美国专利No. 6，004，548中描述的，在第一个(N-末端)位置位有丙氨酸的G-CSF ；在具有G-CSF活性的多肽中至少一个氨基被修饰的那些，如在EP 0 335 423中描述的；在蛋白质的N-末端区域中具有氨基酸被替换或删除的G-CSF衍生物，如在EP 0 272 703中描述的；天然G-CSF的衍生物，其具有天然 G-CSF的至少一种生物学特性和在5mg/mL下至少35%的溶液稳定性，其中该衍生物具有至少由Ser17残基替代天然序列的Cys17和由Ser27残基替代天然序列的Asp27，如在EP 0 459 630中描述的；编码G-CSF的修饰的DNA序列，其中N-末端被修饰以增加重组宿主细胞中蛋白质的表达，而没有改变蛋白质的氨基酸序列，如在EP 0 459 630中描述的；通过失活至少一个酵母菌KEX2蛋白酶加工位点以增加使用酵母菌的重组体产率来修饰的G-CSFJn 在EP 0 243 153中描述的；赖氨酸改变的蛋白质，如在美国专利No. 4，904，584中描述的； 半胱氨酸改变的蛋白质变体，如在WO 90/12874(US 5，166，322)中描述的；为了帮助在原核表达之后分子的折叠，向G-CSF分子的任一末端添加氨基酸，如在AU-A-10948/92中描述的；在SEQ ID NO 4的G-CSF的50-56位和SEQ ID NO 8的G-CSF的53至59位的序列 Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile (SEQ ID NO 16)或 / 和在 SEQ ID N0:xx(174 形式)的成熟 G-CSF 的 43、79、156 和 170 位或在 SEQ ID NO 8 的成熟 G-CSF 的 46、82、159 或 173 位的四个组氨酸残基中的至少一个被取代的，如在AU-A-763 80/91中描述的；以及引入限制性位点以促进所选区域的盒式诱变和引入侧翼限制性位点以促进基因整合进所期望的表达系统中的编码合成G-CSF的核酸序列，如在GB 2 213 821中描述的。G-CSF类似物的其它实例包括SEQ ID N0 17)和其它描述于美国专利No. 6，632，似6中的。上述内容通过引用并入本文。
G-CSF的各种功能性衍生物、变体、突变蛋白和/或模拟物优选地保留少20%、优选50%、更优选至少75%、和/或最优选至少90%的野生型哺乳动物G-CSF的生物活性一生物活性的量包括 25%,30%,35%,40%,45%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%, 95%;以及其中所有的值和子范围。进一步地，所述G-CSF的功能性衍生物、变体、突变蛋白和/或模拟物也可以具有相对于野生型哺乳动物G-CSF活性的100%或更高的生物活性一生物活性的量包括至少105%、至少110% )、至少125%、至少150%和至少200%。为了测量G-CSF的生物活性，可以单独或组合使用几种已知的测定方法。在实施例1中阐述了测定G-CSF功能的一个实例。用于测定G-CSF功能的其它方法是已知的，包括使用小鼠骨髓细胞的集落形成测定；用G-CSF诱导刺激骨髓细胞增殖；用依赖于 G-CSF 生长或应答于 G-CSF 的细胞系(例如，AML-193 ；32D ；BaF3 ；GNFS-60 ；HL-60 ；Ml ； NFS-60 ;0CI/AMLla;和TOHI-3B)进行的特异性生物测定。这些及其它测定描述在下述文献中=Braman 等，Am J Hematology 1992,39 :194 ；Clogston 等，Anal Biochem. 1992，202 375 ；Hattori 等，Blood 1990,75 :1228 ；Kuwabara 等，J Pharmacobiodyn. 1992，15 :121 ； Motojima 等，J Immunological Methods 1989,118 :187 ;Sallerfors 禾口 Olofsson, Eur J Haematology 1992,49 199 ；Shorter 等，Immunology 1992,75468 ；Tanaka 禾口 Kaneko， J Pharmacobiodyn. 1992,15 359 ；Tie φ, J Immunological Methods 1992,149 115 ； Watanabe 等，Anal Biochem. 1991，195 :38。在一个实施方案中，将所述G-CSF进行修饰的或制备，或者作为G-CSF模拟物存在，所述模拟物增强了其透过血脑屏障的能力，或改变了其对脑组织的分布系数。这样的修饰的一个实例是添加PTD或TAT序列(Cao等，J Neurosci. 2002,22 :5423 ；Mi 等，Mol Ther. 2000,2 :339 ；Morris 等，Nat Biotechnol. 2001,19 :1173 ；Park 等，J Gen Virol. 2002,83 :1173)。这些序列也可以以突变形式使用，并将额外的氨基酸添加到蛋白质的氨基或羧基末端。而且，向静脉内应用的任何G-CSF制剂中添加缓激肽或类似物质将有助于其递送至脑或脊髓(Emerich 等，Clin Pharmacokinet. 2001,40 :105 ；Siegal 等，Clin Pharmacokinet. 2002,41 :171)。在一个实施方案中，G-CSF的生物活性通过与另一种造血因子融合而增强。增强的活性可在如上所述的生物活性测定中测量。G-CSF的这种优选的修饰或配制将导致抗凋亡作用的增加和/或神经发生增加。这种修饰的一个实例是髓细胞生成蛋白-1 (Myelopoietin-I)、G-CSF/IL-3 融合蛋白(McCubrey 等，Leukemia 2001,15:1203)或祖细胞生成素-I (Progenipoietin-I) (ProGP-I)，祖细胞生成素-1是一种结合人胚胎肝酪氨酸激酶flt-3和G-CSF受体的融合蛋白。
实施例实施例1 G-CSF减少栓塞模型内的梗死面积脑缺血的栓塞模型可能代表了比细丝模型更接近人类情形的卒中模型。迄今为止，还没有在栓塞模型中显示出G-CSF的功效。在此，通过将预形成的血凝块注射到大鼠颈内动脉内来建立栓塞卒中模型。用异氟烷(对于诱导而言5%，对于外科手术而言2%，对于维持而言1.2%)麻醉重约320g的雄性Wistar大鼠(n = 20)。将ΡΕ-50聚乙烯管插入股动脉中，用于监测平均动脉血压(MABP)和获得测量血气(pH，PaO2, PaCO2)、电解质(Na+，Κ+，Ca2+)和血糖的血样。 用直肠探针连续监测体温，并用恒温控制加热灯保持在37. 0+/0.3°C。对于栓塞卒中(ES)， 在约1秒钟时间中在翼腭动脉(pterygopalatanine artery, PPA)和颈内动脉(internal caroted artery, ICA)分叉处，将一个红色血凝块(直径=0. ；35讓，长=18mm)注射到20 只动物的颈内动脉中。使用激光多普勒血流仪(Laser Doppler Flowmetry)监测闭塞成功。Verum(G-CSF，非格司亭(SEQ ID NO 10))和载体(缓冲溶液Q50mM山梨醇、 0. 004%吐温-80和IOmM乙酸钠缓冲液(pH 4))组接受两次注射在血凝块注射后1小时静脉内输注(120 μ g/kg体重，30分钟)，和在血凝块注射后4小时腹膜内推注(120 μ g/kg 体重)。在M小时时，如前所述对动物进行神经学评分(评分等级0 无缺陷，1 不能伸长左前爪，2 左前爪抓握力降低，3 通过拉尾部向麻痹侧转圈，4 自发对侧转圈，以及5 死亡；Menzies等，Neurosurgery 1992,31 :100)，并处死以通过用2，3，5-三苯基四唑氯化物 (TTC)染色测定梗死体积，采用水肿校正(Men g等，Ann Neurol. 2004，55 :207)。处理没有显著地改变生理参数(血液pH、血气分压(PaC02，PaO2)、电解质(Na+，K+， CA2+)的血浆浓度和葡萄糖的血浆浓度)。而且，处理没有影响MABP (重复测量AN0VA，ρ > 0. 05)，然而，在30分钟时，MABP有明显的与组无关的降低，之后血压再次升高。在ES之后16和M小时之间，20只动物中有12只过早地死亡，因此，其也包括在TTC分析中。通过死后TTC染色测定的梗死体积为^5+/-20mm3(载体)和 206+/-16mm3(G-CSF,平均值+/-SEM ；P = 0. 003)(图1)。然而，这一梗死面积相当大的降低并没有反映在M小时时的神经学评分上，在处理组间没有显示出任何差异(载体 4. 0+/-1. 33 ；G-CSF :4. 2+/-1. 32)，很可能反映出对较大梗死评级的不灵敏。实施例2在持久灌注缺乏的存在下，G-CSF使DWI损伤的发展停止如前所述，使用4-0硅氧烷涂层的尼龙细丝缝线进行MCA的持久细丝闭塞(右中脑的缝合闭塞(sMCAO ;Bouley等，Neurosci Lett. 2007，412 185)。在环境空气中，用异氟烷(对于诱导而言5 %，对于外科手术而言2 %，对于维持而言1.2%)麻醉重约320+/19g的 Wistar大鼠(η = 15)。将ΡΕ-50聚乙烯管插入股动脉中，用于在大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCA0)之前以及在其闭塞之后 30、60、90、120、180 分钟监测平均动脉血压(MABP)和获得测量血气(PHJaO2，PaCO2)、电解质(Na+，K+，Ca2+)和血糖的血样。用直肠探针连续监测体温，并用恒温控制加热灯将体温保持在37. 0+/-0. 3°C。通过MRI测量在180分钟的时间段内对灌注缺乏和DWI损伤进行监测。这些MRI 实验在配有Biospec Bruker控制台(Billerica，MA，USA)和20G/cm梯度的插入物(ID = 12cm，上升时间120 μ s)的4. 7T/40cm水平磁体上进行。使用表面线圈(ID = 2. 3cm)进行脑成像，和使用主动去耦颈线圈用于灌注标记(Meng等，Arm Neurol. 2004，55 :207)。在 sMCAO之后25、45、60、90、120、150和180分钟对动物成像。用沿χ、y或ζ方向施加的扩散灵敏梯度分别获得三个ADC图。经3分钟获得单脉冲的超声平面图像(EPI)，矩阵=64X64， 谱宽=200kHz, TR = 2s (90° 翻转角)，TE = 37. 5ms, b = 8 禾口 1，300s/mm2，Δ = 24ms, δ =4. 75ms，视野(FOV) = 2. 56x 2. 56cm，七个1. 5mm切片，16个平均值。使用具有单脉冲、 梯度超声、EPI采集的连续动脉自旋标记技术进行定量CBF测量。在4分钟中交替地获得六十对图像(用于信号平均)，一个含有动脉自旋标记，另一个(对照)不含有自旋标记制品。MRI参数类似于ADC测量，不同点在于TE= 13. 5毫秒。在存在沿流向的1. 0高斯/cm 梯度的情况下，动脉自旋标记使用1.78秒矩形射频脉冲。将频率补偿信号转移至未标记的图像。在闭塞发生后M小时时测定最终的梗死体积，同时切除脑，并沿冠状方向切片成七个1. 5mm厚的切片，其与MR切片对应，并用TTC染色。在闭塞之后1小时(静脉内；120 μ g/kg体重，经30分钟)和闭塞之后4小时(腹膜内；120 μ g/kg体重，推注)，用载体(缓冲溶液Q50mM山梨醇，0. 004%吐温-80和IOmM 乙酸钠缓冲液(pH 4))，η = 5)或G-CSF(非格司亭，SEQ ID NO 10 ；η = 10)处理大鼠。预先指定将存活超过16小时的动物包括在本研究中，同时排除在16小时之前死亡的那些。评价G-CSF对表现弥散系数(ADC)和脑血流(CBF)特征以及缺血性损伤的时空发展的作用。两组之间的血气、电解质、pH和血糖水平没有差异。在两个实验中，处理组之间的 MABP也没有显著不同(重复测量AN0VA，ρ >> 0. 05)，然而，在本实验过程中，存在与组无关的明显升高(对于时间这一因素而言，重复测量AN0VA，ρ < 0. 05)。15只动物中有2只在16至M小时期间死亡。使用Quickvol II 分析图像(Schmidt 等，J Neurooncol. 2004,68 :207)。如前所述计算定量CBF和ADC图及其相应阈值衍生的损伤体积(Meng等，Ann Neurol. 2004，55 207)。对于ADC，将用于定义异常DWI和PWI区域的阈值减小至0. 53 X 10-3mm2/s，对于CBF， 将其减小到0. 3mL/g/分钟，如之前所证实的(Meng等，Ann Neurol. 2004，55 :207)。图2概述了阈值衍生的ADC和CBF损伤体积的时空发展。CBF损伤体积在组间(载体和G-CSF)没有差异，并且随时间相对恒定地保持在约230mm3(图2A)。在载体处理的动物中，ADC衍生的损伤随时间以线性方式增加，直到120分钟时曲线变平坦。通过TTC方法在第M小时测定的最终梗死体积稍微高于在闭塞后180分钟测量的最后一次DWI体积。在G-CSF处理的动物中，从闭塞之后25分钟至45分钟，DWI损伤增长，与载体的情况相同。然而，当在应用CSF之后的60分钟时间点获得MRI数据时，该增长似乎开始逆转。在第90分钟，在G-CSF处理的动物中，DffI损伤变得显著小于载体处理的大鼠(对于相互作用处理-时间，重复测量AN0VA，ρ < 0. 0001，然后进行Tukey-Kramer 事后检验)。对于以下的所测量时间点，所述损伤保持稳定，直到在180分钟MRI数据获取结束时，在M小时得大致相同尺寸的最终梗死(图2B)。TTC定义的梗死体积在处理组之间显著不同Q23+/-7mm3(载体)与 124+/-19mm3(G-CSF ；ρ = 0. 007)，很好地对应于这两个组中的3小时ADC损伤体积和载体组中的3小时CBF (图2Β和2Α)。图2C和2D显示了 CBF和ADC衍生体积之间的绝对错配和相对错配。在闭塞之后90 分钟，所有两次测量都变得显著不同(P < 0. 05 ；重复测量AN0VA，接着进行Tukey Kramer 事后检验)。通过多重线性回归模型(因素PWI、动物(随机因素)、处理、时间、时间X处理相互作用)，使用另一种统计方法，并比较相对于DWI体积和处理的随时间的PWI体积表现， 表明处理效果在sMCAO之后84分钟变得明显。本实验表明，G-CSF的作用必须在闭塞发病之后至少90分钟立即进行，以允许对DWI缺乏体积的显著作用。在向神经元9加入G-CSF 之后的5分钟内，体外抗细胞凋亡级联的诱导立即进行，并伴有Akt的磷酸化和活化。相反，骨髓衍生细胞介导的间接作用需要将那些细胞从骨髓释放到血流中，通过血脑屏障，侵入组织，可能接着释放保护因子。就本实验中所观察到的效果来说，这不大可能足够快。
在Menzies神经病理学评级中没有检测到组间在第4和M小时的显著差异，很可能反映出评级对较大梗死的不灵敏性。
权利要求
1.一种治疗哺乳动物对象的卒中的方法，包括以下步骤(a)开始向所述对象施用治疗活性量的G-CSF或功能活性G-CSF衍生物，然后(b)向所述对象施用治疗活性量的血栓溶解剂。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(a)之后和步骤(b)之前对所述对象进行诊断检查， 以排除在步骤(b)期间出现出血或其它不良副作用的风险。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(a)使用人G-CSF。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(b)使用rt-PA。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中在所述卒中发作之后的第一个6小时之内开始施用所述G-CSF或功能活性G-CSF衍生物。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中在所述卒中发作后6小时之后施用所述血栓溶解剂。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中在所述卒中发作之后的第一个6小时之内完成所述G-CSF或功能活性G-CSF衍生物的施用。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中在开始施用G-CSF或功能活性G-CSF衍生物之后至少0. 5小时施用所述血栓溶解剂。
9.权利要求2至8中任一项的方法，其中所述诊断检查持续至少0.5小时。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中以至少90μ g/kg体重的剂量静脉内或皮下给予G-CSF。
11.G-CSF或功能活性G-CSF衍生物在制备用于治疗患有急性卒中的哺乳动物对象的药物组合物中的用途，其中所述对象在卒中发作之后的最初6小时之内被卒中单元或诊所收治，并且其中评价所述对象的溶栓治疗的出血或其它严重不良副作用的风险所必需的诊断检查所消耗的时间否则将导致超出溶栓治疗的治疗窗。
12.权利要求11的用途，其中所述溶栓治疗的治疗窗为卒中发作后3小时。
13.权利要求11或12的用途，其中所述诊断检查持续至少0.5小时。
14.权利要求11至13中任一项的用途，其中所述哺乳动物对象在被卒中单元或诊所收治后立即接受G-CSF或功能活性G-CSF衍生物。
15.权利要求11至13中任一项的用途，其中所述G-CSF是人G-CSF。
16.G-CSF，其用在治疗对象卒中的方法中，其中在施用G-CSF之前的6小时内已经观察到所述对象的卒中发作，并且其中在所述施用G-CSF之前，除了观察到所述卒中发作之外， 没有进行进一步的卒中诊断。
17.G-CSF,其用在治疗对象卒中的方法中，其中在施用G-CSF之前的6小时内已经观察到所述对象的卒中发作，并且其中在所述施用G-CSF之后，对所述对象进行诊断检查，以排除由于施用所述血栓溶解剂而导致出血或其它不良副作用的风险。
18.血栓溶解剂，其用在治疗对象卒中的方法中，其中所述对象在其卒中发作之后的6 小时内已经施用G-CSF，并且其中在所述施用G-CSF之后对所述对象进行诊断检查，以排除由于施用所述血栓溶解剂而导致出血或其它不良副作用的风险。
19.权利要求18的血栓溶解剂，具有如在权利要求6至10中任一项所定义的特征。
全文摘要
本发明涉及G-CSF及其衍生物的以下用途用于延长急性卒中后溶栓治疗的治疗窗，从而允许在溶栓治疗前进行必需的诊断检查以避免溶栓出现的出血及其它严重不良副作用。
文档编号A61K38/19GK102316891SQ201080007924
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月17日 优先权日2009年2月17日
发明者阿尔明·施奈德, 马克·菲舍尔 申请人:森格尼斯生物科学有限两合公司