专利名称：来自毛根鞘的干细胞和角质形成细胞前体细胞用于老化皮肤再生的用途的制作方法
来自毛根鞘的干细胞和角质形成细胞前体细胞用于老化皮
肤再生的用途本发明涉及来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞用于为了美容目的和为了预防皮肤疾病使老化但健康且未损伤皮肤再生的用途。此外，本发明涉及用于老化皮肤再生的美容方法。目前，年轻漂亮的皮肤已经日益地得到社会心理的中肯，并且由于该原因，大量的被认为能对抗或逆转皮肤老化的局部制剂被投放市场。然而，但是在很大程度上缺乏任何持续效果的合理医学科学证据。一方面，皮肤老化取决于年龄，个体差异很大(内在的或者年代性老化)，并且另一方面依赖于外部损伤因素，特别是累积的阳光(UV)-暴露、营养不良、药物滥用、机械性损耗，还有尼古丁滥用(外在老化)。老化皮肤本身表现出表皮以及真皮变薄(萎缩)，皱纹形成增加和丧失弹性(真皮的弹性组织变性)，皮肤干燥和丧失膨压以及可能的皮肤色素沉着不规则(例如目光斑)。 皮肤的终生再生(稳态)一方面基于通过最底层(基底层)中角质形成细胞的干细胞分裂连续更换表皮，当上行至角质外层(角质层)时随后分化成角质盘。在老化皮肤中该过程是失调的，由此导致萎缩。如果角质形成细胞的分化极大地机能异常，退化会变得有可能，即发展成所谓的白色皮肤癌(鳞状，基底细胞癌)或者癌前病变(光线性角化病)。这主要是长期阳光暴露皮肤区域的情况，这强调了 UV-辐射的触发相关性。因此，不仅仅因为美容原因，用于老化皮肤再生的可持续治疗方法是需要的。具有完全功能性的表皮对于保护真皮下面的结构和功能也是重要的，因为皮肤的该两个区室的细胞系统(表皮的角质形成细胞和真皮的成纤维细胞或血管内皮)通过可溶性因子(例如细胞因子、生长因子)彼此通信。因此，具有完全功能性的表皮还可有助于真皮的年龄相关性改变一即带有具有弹性组织变性和血管扩张(毛细管扩张)的真皮萎缩一的再生。对于表皮稳态具有决定性的重要的角质形成细胞前体细胞或者干细胞位于上皮毛根鞘(外层根鞘0RS)内，即在较下层的真皮内，并且因此，被保护不被有害的UV-辐射 (特别有害的UV-B仅仅穿透表皮)。这些ORS细胞可在生长期从拔取的头发分离并且还可以在实验室中增殖。皮肤的色素再沉着已知应用从自体毛根鞘衍生的ORS干细胞或者黑素细胞前体细胞(Vanscheidt 和 Hunziker，Dermatology，904，2009，WO 2009/049734)。此外，慢性创伤用来自自体毛根鞘的表皮角质形成细胞前体细胞处理(EpiDex , Euroderm ；Tausche φ, Wound Repair and Regeneration, 11(4), 248-252, 2003, EP 1 198 557 Bi, EP 1 326 654 Bi)。除了慢性创伤处理，还公开了用角质形成细胞前体细胞处理其它皮肤缺陷，例如手术去除皮肤肿瘤或者纹身后或者由于损伤等之后进行处理(EP 1 198 557B1, EP 1 702 979 Al)。表皮神经嵴干细胞(EPI-NCSC)是多能干细胞，它衍生自胚胎神经嵴并且位于毛根鞘内。这些干细胞永久自我更新并且能够分化成神经嵴的所有重要的细胞衍生物，包括神经元、神经支持细胞、平滑肌细胞、骨/软骨细胞和黑素细胞。这些干细胞甚至可以产生中胚层代表性的细胞类型。在脊柱损伤的小鼠模型中表明，这些干细胞可以与成体骨骼肌纤维融合，所引入的细胞核是有功能的并且成体骨骼肌是干细胞的细胞核长期存活的适宜环境(Sieber-Blum 和 Hu，Stem Cell Rev. , 4 (4), 256-60, 2008) 作者从在小鼠骨骼肌中的这些研究得出结论，此类多能干细胞可提供有吸引力的特性用于未来的细胞替代疗法和 /或生物医学开发。本发明的目的是使老化但健康且未损伤皮肤再生。该目的通过使用来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞用于老化但健康且未损伤皮肤再生而得以解决。术语“健康且未损伤皮肤”描述无缺陷的皮肤，特别是没有创伤以及没有炎症性、 感染性或者变性皮肤疾病、良性或恶性皮肤肿瘤或者其前体(例如光线性角化病、恶性雀斑样痣)、术后皮肤转化例如皮肤移植后皮肤转化等。术语“老化皮肤”在本发明上下文中指优选具有至少一种下列老化症状的内在和/ 或外在老化皮肤变薄(萎缩)、细皱纹形成、丧失弹性(弹性组织变性)、在低水平创伤后出血倾向增加的易损性以及可能的色素沉着不规则，并且还具有深皱纹或皱缩，具有干燥的、可能的鱼鳞/角化皮肤表面、降低的皮脂腺活性、降低的皮肤膨压、降低的皮肤脂肪含量、倾向于破裂和假瘢痕、小血管扩张(毛细管扩张)、再生能力的丧失以及与此相关的伤口愈合功能障碍。这些表现形式源于调节皮肤细胞(特别是角质形成细胞和成纤维细胞) 增殖和分化并且由此调节皮肤稳态的转录因子或者肿瘤抑制基因(例如NF-K B、C-MyC, P53)活性失调。例如，对于NF-kB有可能表现出，在年老的小鼠中，阻断NF-KB弓丨起了处于两周内的生物学上更年轻的皮肤病症达到有限的时间段。根据本发明，老化但健康且未损伤皮肤的再生除了具有美容方面的优势外还具有医学优势。引入到皮肤内的角质形成细胞前体细胞不仅使表皮变厚成为完全分化的角质形成细胞，而且还有规则地分裂并由此随着时间的推移替代分裂更慢的“老”细胞以及变性的细胞。此外，它们通过分泌细胞因子和生长因子正面影响在它们直接环境中的细胞(成纤维细胞、血管内皮细胞、黑素细胞)，这作为整体而言从长远看改善了皮肤的健康和老化状况，由此减少了皱纹形成(胶原纤维的再生)，增加了弹性(弹性纤维的再生)和降低了可能存在的色素沉着不规则(黑色素产生和分布的调节)。通过影响皮肤的微循环改善了皮肤的营养状态，这例如还增加了营养状况和皮脂腺活性并且由此皮肤的油状况正常化。因此，根据本发明的老化但健康且未损伤皮肤的再生不仅包括美容性再生，而且还包括皮肤的医学预防性再生。在优选的实施方案中，本发明涉及来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞用于老化但健康未损伤人和哺乳动物皮肤再生的专用美容用途。在进一步优选的实施方案中，本发明涉及来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞用于预防人和哺乳动物皮肤疾病的用途，所述皮肤疾病优选选自基于皮肤内聚、皮肤稳态、皮肤分化和/或皮肤屏障作用的遗传性或获得性机能障碍的皮肤疾病，优选大疱性表皮松解、着色性干皮病、早老、鱼鳞病、手术干预后和X-射线照射后状态以及外源性诱导的萎缩或增生，特别是增生性瘢痕和瘢痕瘤，优选局部或全身皮质类固醇诱导的萎缩。因此，本发明还涉及所述细胞用于制备用于预防皮肤疾病的药物的用途。
可以使用自体以及同种异体和异种细胞，而自体细胞对于避免免疫反应是优选的。在进一步的方面中，本发明涉及用于老化但健康且未损伤皮肤再生的美容方法， 包括在老化但健康且未损伤皮肤上应用来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞的步骤。对于老化皮肤的处理，采用优选来自患者本身毛根鞘的干细胞或者优选从它们衍生的角质形成细胞前体细胞，即所谓的自体角质形成细胞前体细胞。来自毛根鞘的角质形成细胞前体细胞包含多能干细胞，其在一生中都再生上皮皮肤结构。因为该原因，对于年老的供体它们也具有高的增殖潜能。这些干细胞或者前体细胞不仅可以非创伤性制备，而且还可以从任何几乎不长头发供体重复制备，并且无需皮肤活组织检查。因此，这些细胞的应用使得可以几乎无创伤可能性地持续再生老化皮肤，特别是表皮。来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞以及它们的制备、分离、增殖和储存是皮肤学领域技术人员十分熟悉的。优选地，用于开展本发明的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞从毛根鞘，特别是生长期(毛发生长初期阶段)内的外部上皮毛根鞘制备。这些细胞的制备是十分简单的，无痛的并且不具有任何健康风险。例如，用于制备细胞的毛发可以通过拔取终毛得到，特别是头皮的生长初期毛发。当毛发来源于待处理的人或哺乳动物时是有优势的。优选地，术语“制备”还包括至少部分分离和/或富集以及增殖或对培养细胞的选择。在优选的实施方案中，例如通过浓度0.01%至10%，优选0.025%至0. 和更加优选大约0. 05%胰蛋白酶的胰蛋白酶溶液，任选与EDTA —起并且优选在PBS中，于优选大约 20°C或者更优选37°C下优选在5至60分钟、更优选10至15分钟内，从所去除毛发的毛根鞘酶促释放所述细胞。该类型的酶促去除对于待制备的细胞是特别温和的。同样，其它的酶系统，例如分散酶可以采用。用于制备的进一步可能的步骤包括通过加入血清和Ca/Mg 终止酶促释放，将悬浮液离心和将包含细胞的沉淀物悬浮于/引入到适宜在皮肤上应用的溶液中或者生物可降解的或者非生物可降解的载体基质中。优选的应用是将包含细胞的沉淀物悬浮于包含凝血酶的溶液中，这使得可以以薄层将所应用的细胞立即固定在用血纤蛋白原预处理的皮肤上，并且因此能够在任何身体区域的皮肤上同质非闭塞性应用。优选地， 对于本发明的方法，采用来自毛根鞘的自体干细胞和/或角质形成细胞前体细胞。任选地，可将细胞作为悬浮液或者沉淀物或者任选作为细胞提取物使用。当这样做时，它们可以引入到生物相容性溶液中或者生物相容性载体中。应用步骤优选地通过每一待处理皮肤区域具有IO2至109、更优选具有IO3至IO5个细胞/cm2的悬浮液，通过例如注射器或者作为喷雾剂或者以生物相容性载体或者非织造网方式给与而开展。这可以使用生物相容性溶液(例如PBS、细胞培养基、凝血酶)或者通过生物相容性生物载体(例如血纤蛋白、透明质酸、胶原)或合成载体(例如聚氨基甲酸酯、 羧基甲基纤维素、聚赖氨酸、纳米微粒)的方式开展。细胞可以作为活的能增殖的或者生长停滞的细胞(例如通过用丝裂霉素C处理或者X-射线照射的手段)使用或者还可以作为细胞提取物(例如冻干物、超声处理物、刺激物)使用。此外，可以采用在不同的体外培养条件下(例如可变的PO2-和/或pC02-浓度，可变的培养基，可变的基质底物，可变的与细胞直接接触的或者在两室培养系统中分开的饲养层细胞，深层培养或者器官型培养)从这些细胞衍生的细胞。在本发明上下文中，术语“应用”包括将细胞简单地应用在皮肤上。优选地，为了此目的，例如通过血纤蛋白粘附，将细胞固定在皮肤上，并且用通常的包裹绷带保护。然而，任何其他适宜形式的应用是可以的，例如通过将细胞整合在生物或合成基质中并且随后应用它们。此外，细胞可以优选地直接引入到皮肤内。为了此目的，待处理的皮肤在应用前被物理性和/或机械性去表皮，并且这优选地通过皮肤磨削术、表面应用激光(例如 Fraxel re:pair CO2-激光，Soltamedical，美国)、或者表面针穿刺(例如Dermaroller , Skintes, CH)实现，因此产生了平坦的或者优选单点，即表皮中的格子型点阵缺陷，这使得在例如经表皮应用中可以将应用的细胞穿透到皮肤内。通过在该消除过程中包括上真皮层，还存在真皮刺激和真皮再生。在本发明方法的优选实施方案中，在应用细胞前，通过表面皮肤磨削术、应用激光和/或表面针穿刺的方法将表皮物理性和/或机械性剥脱。在更加优选的实施方案中，在应用细胞前，通过Fraxel设备激光和/或滚轮磨皮机，以具有可变穿透深度的部分/点阵的去表皮的形式，将表皮剥脱。在应用或者引入过程中，来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞优选以提取物、悬浮液、溶液或包含于生物可容性生物或合成载体中的形式作为富集或者分离的细胞存在。在进一步优选的实施方案中，来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞可以通过培养体外增殖和/或通过专门的培养条件(例如可变的PO2-和/或pC02-浓度， 可变的培养基，可变的基质底物，可变的直接细胞接触的或者两室培养系统内分开的饲养层细胞，深层培养或者器官型培养等)的方式根据有利的标准，例如诸如干细胞和/或角质形成细胞前体细胞含量，干细胞潜能(单能对多能)，增殖能力，分化潜能，存活能力等选择。在本发明上下文中，“选择”意思是指有意地选择特定干细胞和/或角质形成细胞前体细胞或者具有有益特性的伴随细胞(在饲养层细胞环境下没有干细胞或者角质形成细胞前体细胞具有诸如交互刺激干细胞和/或角质形成细胞前体细胞增殖或分化的功能)。在应用后，细胞处理的皮肤优选包裹性覆盖，特别是当皮肤被机械性预处理并且仍然部分“开放”时，以便保护皮肤以及所应用的细胞不被干燥、感染和机械性拉紧并且为了创造细胞生长的最佳环境。为了防止自体、特别是同种异体或者异种细胞的免疫反应，优选施用至少一种抑制(自身)免疫反应的活性剂，优选局部或全身皮质类固醇和/或局部钙调磷酸酶-抑制剂。还进一步发现，额外应用黑素细胞前体细胞对老化皮肤的结构和生理学具有有利的作用。因此，在优选实施方案中，本发明方法涉及特别是在应用干细胞和/或角质形成细胞前体细胞之前、之后或者优选同时，向皮肤额外应用黑素细胞前体细胞。最优选的是在制备来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞的过程中不分离黑素细胞前体细胞。除了干细胞和/或角质形成细胞前体细胞的其它前体细胞和任选的黑素细胞前体细胞，根据本发明使用的细胞可以优选包括毛根鞘中包含的其他细胞。此外，本发明涉及用于在具有老化但健康且未损伤皮肤的哺乳动物和人中预防皮肤疾病的上述方法，特别是用于预防选自基于皮肤内聚、皮肤稳态、皮肤分化和/或皮肤屏障作用的遗传性或获得性机能障碍的皮肤疾病的皮肤疾病，优选大疱性表皮松解、着色性干皮病、早老、鱼鳞病、手术干预后和χ-射线照射后状态和外源性诱导的萎缩或增生，特别是增生性瘢痕和瘢痕瘤，优选局部或全身皮质类固醇诱导的萎缩。该方法的优选实施方案可从上述美容方法类推得到。本发明将通过下列示例性应用的方式举例说明。 实施例从具有特征在于不规则表皮萎缩、细皱纹形成、颊毛细管扩张、干燥和皮肤张力降低的强UV-老化面部皮肤的50岁妇女的头皮拔取50根生长初期毛发，分离毛根并将它们在胰蛋白酶溶液(PBS中的0.05%胰蛋白酶/0.02% EDTA，无Ca/Mg)中于37 °C下温育10 分钟。通过加入含Ca/Mg和20%人AB血清的PBS使胰蛋白酶失活后，通过显微镜证实从毛干毛根鞘释放所有上皮细胞。在经过细胞筛和随后的离心(1200rpm，10分钟，室温)后，将分离的细胞置于含Ca/Mg和5%葡萄糖的PBS中，并且滴加应用于前额和颊的区域(0. Iml 每5cm2，相当于 5xl03个细胞/cm2)，前额和颊的区域用飞梭雷射CO2-激光预处理(网格样磨削 20%的所处理表皮面积直至上真皮，穿透深度 100 μ m)。随后用现代的创伤绷带包裹性覆盖所处理区域总共一周。三天后第一次更换绷带。之后，所处理的皮肤在早晨用> 50因子的防晒霜处理并且在晚上用护理洗剂处理。在3个月内存在令人印象深刻的皮肤表面光滑化，其中皮肤干燥减轻，张力增加和表皮结构均一化，并且颊部毛细管扩张稍微退化，并且总体上对于患者具有非常满意的美容结果。
权利要求
1.来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞用于老化但健康且未损伤皮肤再生的用途。
2.根据权利要求1的用途，用于人和哺乳动物皮肤的美容性处理。
3.根据权利要求1的用途，用于预防人和哺乳动物中的皮肤疾病，所述皮肤疾病优选选自基于皮肤内聚、皮肤稳态、皮肤分化和/或皮肤屏障作用的遗传或获得性机能障碍的皮肤疾病，优选大疱性表皮松解、着色性干皮病、早老、鱼鳞病、手术干预后和χ-射线照射后状态和外源性诱导的萎缩或增生，特别是增生性瘢痕和瘢痕瘤，优选局部或全身皮质类固醇诱导的萎缩。
4.根据权利要求3的用途，用于制备药物。
5.用于老化但健康且未损伤皮肤再生的美容方法，包括在老化但健康且未损伤皮肤上应用来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞的步骤。
6.根据权利要求5的方法，其中来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞是自体细胞。
7.根据权利要求5或6的方法，其中在应用细胞之前优选通过表面皮肤磨削术、应用激光和/或表面针穿刺将表皮物理性和/或机械性剥脱。
8.根据权利要求7的方法，其中在应用细胞之前，通过Fraxel设备激光和/或滚轮磨皮机，以具有可变穿透深度的部分/点阵去表皮的形式，将表皮剥脱。
9.根据权利要求5至8任一项的方法，其中细胞是作为提取物、悬浮液、溶液或包含于生物可容性生物载体或合成载体中的富集的或分离的细胞形式。
10.根据权利要求5至8任一项的方法，其中来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞通过体外培养繁殖和/或选择。
11.根据权利要求5至10任一项的方法，其中在应用细胞之前、期间和/或之后，施用至少一种抑制(自身)免疫反应的活性剂，优选局部或全身性皮质类固醇和/或局部钙调磷酸酶抑制剂。
12.根据权利要求5至11任一项的方法，其中向皮肤额外应用黑素细胞前体细胞。
13.根据权利要求5至12任一项的方法，其中除了来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞和任选的黑素细胞前体细胞，所述细胞包括毛根鞘中包含的另外的细胞， 优选其它前体细胞。
全文摘要
本发明涉及来自毛根鞘的干细胞和/或角质形成细胞前体细胞用于为了美容目的和为了预防皮肤疾病使老化但健康且未损伤皮肤再生的用途。此外，本发明涉及用于老化皮肤再生的美容方法。
文档编号A61K35/36GK102458424SQ201080024813
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月28日 优先权日2009年6月5日
发明者T·亨齐克 申请人:思亲瑞海尔有限公司