专利名称：左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于缺血性心脏病的防治技术领域，特别涉及左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物及其应用。
背景技术：
缺血性心脏病是由于冠状动脉循环改变引起冠状动脉血流与心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害。即在心脏冠状动脉原有或无动脉粥样硬化斑块形成的基础上，由于冠脉的痉挛或内皮损伤引起的血栓形成使冠脉管腔发生狭窄或闭塞，冠脉的供血与心肌的需血之间发生矛盾，引起心绞痛发作或心肌梗死。流行病学调查缺血性心脏病的发病率逐年增加，随着人们生活方式的改变该病日益成为危害人类生命健康重要疾病。心肌缺血早期血管内皮功能障碍引起内皮生成一氧化氮(NO)减少，NO含量的减少加重了心肌的损害。目前考虑应用血管扩张药改善心肌缺血一般有以下几种方法1)硝酸甘油给药口服硝酸甘油，存在明显的“首过效应”，生物利用度极低，故口服硝酸甘油制剂效果非常差。舌下含服可迅速被口腔黏膜吸收，剂量大于40 μ g/min时不仅扩张静脉系统，对动脉阻力血管也起作用。预防心绞痛发作也可应用缓释剂或药膜皮肤贴敷。2)硝酸异山梨酯给药有片剂、气雾齐 、缓释齐 、软膏、静脉注射齐 。该药同样有缓释制剂可减少用药次数。此外，硝酸异山梨酯口腔喷雾剂，药物喷在口腔颊黏膜上，可迅速吸收，每按压2次喷出的药液相当于含硝酸甘油0. 3mg或硝酸异山梨酯5mg的效果。长期连续应用硝酸酯类药物可以产生耐药性和药物依赖性。机体对硝酸酯类药物产生的耐药性仅是部分性的，增加剂量仍然有效；这种耐药性在停药数小时后即可消失，再次应用该药物仍可重新发挥作用。产生耐药性的机制主要是由于血管平滑肌细胞膜的巯基受体减少，导致平滑肌细胞内NO和cGMP的合成减少造成的。机体对硝酸酯类药物可以产生药物依赖性，如果突然停药，可产生反跳性冠状动脉痉挛，引起撤药综合征，表现为剧烈胸痛，可以发生心肌梗死甚至猝死。故长期使用硝酸酯类药物，不宜突然停药。3)钙通道拮抗药给药常用的制剂有硝苯地平、地尔硫卓和维拉帕米。硝苯地平对血管平滑肌作用强，能扩张冠状动脉与外周血管，对心脏传导系统无明显影响。扩张血管，降低血压，引起的反射性交感神经兴奋足以抵消其对心肌的负性肌力作用，甚至表现为正性肌力作用，从而改善缺血区心肌收缩功能。地尔硫卓对冠状动脉及其侧支循环血管均有较强的扩张作用，能降低血压、减慢心率及减小心肌耗氧量，对心肌有直接的负性肌力与负性频率作用，可延长窦房结与房室结的传导时间。维拉帕米能扩张外周血管，降低血管阻力，对冠状动脉的扩张作用较弱，但能抑制因交感神经兴奋或麦角新碱引起的冠状动脉痉挛。能直接抑制心肌产生负性肌力作用，同时抑制窦房结和房室结的兴奋性及传导功能。葡萄糖-胰岛素-氯化钾(GIK)作为细胞能量代谢调节剂用于辅助治疗缺血性心脏病(IHD)已有40余年的漫长历史。GIK给缺血心肌提供更多能量(葡萄糖)，并由胰岛素抑制缺血心肌细胞摄取和利用自由脂肪酸、促进心肌细胞摄取和利用葡萄糖，最终促进缺血心肌的功能恢复。近年的临床试验反复证实，GIK可显著降低急性心肌梗死(AMI)患者的死亡率；新近对胰岛素(一种经典激素)作用机制的研究表明，胰岛素除促进细胞能量代谢及蛋白质合成外，还可激活细胞“生存信号(survival signaling) ”系统，抗损伤、抗凋亡、促进细胞修复和生存。在治疗缺血性心脏病中早期使用GIK注射液可以显著的降低病人的死亡率，减少梗死心肌面积和心肌细胞的凋亡。其中重要的机制是GIK中的胰岛素通过激活心肌细胞生存信号途径“AKt-eNOS-NO”保护心脏、抗心肌损害。同时以往的研究发现GIK还可以促进 eNOS合酶的活性，增强心脏的保护作用。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物及其应用，通过增加血清当中的N0，减轻心肌细胞的损害，降低缺血性心脏病引起的心肌损伤、心脏凋亡和心脏功能障碍。本发明是通过以下技术方案来实现左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物，其特征在于，以水作为溶剂，包含质量浓度为5 10%的葡萄糖、25 50IU/L的胰岛素、40 lOOmmol/L的氯化钾和1 50g/L的左型精氨酸。所述的左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物应用于抗缺血心脏损伤或抗心衰药物的制备。所述的的左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物应用于抗缺血心脏损伤的治疗性药物或防护性药物的制备。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果在缺血性心脏病(心肌缺血)早期，血管内皮功能障碍引起内皮生成一氧化氮 (NO)减少，NO含量的减少进一步加重了心肌的损害。为了减轻由于缺血导致的心肌细胞的损害，就非常有必要补充血液和心脏中的N0。而体内NO的生成取决于一氧化氮合酶(eNOS) 的功能和其作用的底物左型精氨酸(L-Arg)含量。正常人体中的NO的底物左型精氨酸的含量是相对稳定的，心肌缺血时血管内皮细胞和心肌细胞中的L-Arg被大量耗竭。本发明提供的左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物，是基于eNOs的激活和NO产生的量对保护心脏起着重要的生物学效应，一方面补充外源性的L-Arg，增加在心肌缺血时血管内皮细胞和心肌细胞中被大量耗竭的L-Arg ；另一方面，通过葡萄糖-胰岛素-氯化钾激活eNOS，以加强NO的提供。这样左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物从两方面着手，激活eNOs并补充足够的NO生成底物L-Arg，从而增加血清当中的N0，使受损心肌重新发挥正常的生理功能，从而降低心肌在缺血中的损害，减少梗死心脏面积。心肌缺血的大鼠模型在灌注左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物后， 能够显著的增加血清当中的N0、减少梗死心脏面积；结果表明左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物可应用于抗缺血心脏损伤病的治疗和防御，并兼具辅助抗心衰作用。
图1为缺血后再灌注的不同组别的心脏总NO的含量的结果分析图2为缺血后再灌注的不同组别的梗死面积/缺血面积值的结果分析图。
具体实施例方式本发明提供的左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物，一方面补充外源性的L-Arg，增加在心肌缺血时血管内皮细胞和心肌细胞中被大量耗竭的L-Arg ；另一方面， 通过GIK激活心血管系统eNOS，增强内源性NO产生，以加强NO的提供，发挥心脏保护作用， 使受损心肌重新发挥正常的生理功能，从而降低心肌在缺血中的损害，减少梗死心脏面积， 促进心脏功能恢复。下面结合左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物的制备及大鼠缺血模型的灌注对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。1、左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物的制备以无菌双蒸水为溶剂，首先配制葡萄糖-胰岛素-氯化钾溶液质量浓度为5 10%的葡萄糖、25 50IU/L的胰岛素和40 100mmol/L的氯化钾。将左型精氨酸置成质量浓度为20 %的母液，然后将左型精氨酸母液加入到葡萄糖-胰岛素-氯化钾溶液中，使得左型精氨酸的终浓度为1 50g/L。2、左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物对缺血心脏的保护作用2. 1心肌缺血大鼠模型的制备选用体重200 MOg的雄性大鼠，随机分组伪手术组(Sham)，心肌缺血(30分钟)再灌注生理盐水组(MI/R+Mline)、心肌缺血再灌注L-Arg组(MI/R+L_Arg)、心肌缺血再灌注GIK组(MI/R+GIK)和心肌缺血再L-Arg+GIK组(MI/R+L-Arg+GIK)，每组6 10只。心肌缺血模型使用主要仪器动物人工呼吸机、生物信号记录分析系统和小动物
微量注射泵。心肌缺血大鼠模型的处理为先将大鼠用3%的戊巴比妥钠(30mg/Kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈部正中切开皮肤，插管，维持正常呼吸。在心脏搏动最明显的第四肋间打开胸腔，用开睑器撑开肋骨，撕开心包后暴露心脏的左心耳与左心室表面。在左心耳下方以心脏表面左冠状静脉主干为标志，用5-0无创缝合针于左心耳根部下方2mm处穿过心肌表层，在肺动脉圆锥旁出针；观察心电图，待其恢复稳定15分钟后做一活结以结扎左冠状动脉前降支，以心电图I、II导联ST段弓背样向上抬高、心脏表面相应区域颜色变暗表明缺血成功；30分钟后松结扎线，心电图ST段下降1/2以上、心脏表面变红表明心肌组织恢复再灌注。在灌注后再逐层缝合肋骨、肌肉和皮肤，逐渐减小通气量，大鼠有自主呼吸后拔除气管插管。大鼠股静脉行插管术，建立静脉通路。伪手术组大鼠操作相同，将缝合针穿过左冠状动脉前降支下方，但不结扎。2. 2缺血后再灌注缺血再灌注给药组的3个组别，分别在再灌注期间给予静脉微量注射L-Arg(lmg/ Kg/min)、葡萄糖-胰岛素-氯化钾注射液(葡萄糖5%，胰岛素50IU/L，氯化钾100mmol/ L，0. 125ml/Kg/min)、L-Arg+葡萄糖-胰岛素-氯化钾组(L-Arg lmg/Kg/min+葡萄糖5%， 胰岛素50IU/L，氯化钾100mmol/L，0. 125ml/Kg/min)伪手术组和缺血再灌注生理盐水组给予生理盐水注射液注射(0. 125ml/Kg/min)。为了便于观察左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物对缺血心脏梗死面积
5的影响，对左心室心肌使用伊文氏蓝(Evan’ s Blue)和氯化三苯氮唑(TIC)染色。具体方法如下在缺血后灌注3小时后，再次结扎冠状动脉，向心室内快速注入2% Evan’ s Blue, 自心脏根部剪下心脏，剪去心房、右心室，4°C生理盐水漂洗，垂直于心脏长轴将其切成1 2mm厚的6片环状薄片，37°C水浴中1 % TIC磷酸盐溶液染色15分钟。正常心肌为蓝色，梗死区为白色，缺血未梗死区为红色。2. 3左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物对缺血心肌的影响2. 3. 1心脏总NO的含量的影响NO化学性质活泼，在体内代谢很快转化为NO2—和NO3—，NO2—可进一步转化为N03_。 硝化还原酶特异性将NO3—还原为N02—，通过显色深浅测定其浓度。取心脏，利用硝化还原酶法测量心脏总NO的含量。组织前处理组织勻浆为10%，离心lOOOr/min，离心5分钟，取上清测量。NO的测量使用南京建成公司试剂盒测定。根据心脏总NO的含量的检测结果所绘制的分析图如图1所示，可以看出伪手术组的NO含量最高，缺血再灌注生理盐水组(对照组)NO含量最低，缺血再灌注L-Arg和缺血再灌注GIK有助于NO含量的提高，与对照组具有显著区别(与对照组相比*P < 0. 05, η =7)；而缺血再灌注L-Arg+GIK组NO含量提高更为明显，与对照组更具有显著区别(与对照组相比< 0. 01，η = 7)；与前两组也具有显著区别与缺血再灌注L-Arg组相比，#Ρ < 0.05 (η = 7)，与缺血再灌注 GIK 相比，§ P < 0. 05 (n = 7)。这说明灌注L-Arg+GIK组合物能够更加显著的提高缺血时心脏NO的供给，降低心肌在缺血中的损害。 2. 3. 2对缺血心脏梗死面积的影响伊文氏蓝和氯化三苯氮唑染色检测的缺血心脏梗死面积与缺血面积比的结果分析图如图2所示，可以看出伪手术组的梗死面积/缺血面积值最低，缺血再灌注生理盐水组 (对照组)梗死面积/缺血面积值最高，缺血再灌注L-Arg和缺血再灌注GIK有助于梗死面积的减少，而且缺血再灌注GIK与对照组具有显著区别(与对照组相比*P< 0.05)；而缺血再灌注L-Arg+GIK组对梗死面积的减少更为明显，与对照组更具有显著区别(与对照组相比 **P < 0. 01)。这说明灌注L-Arg+GIK组合物能够更加显著的减少缺血时心脏梗死面积的减少， 降低心肌在缺血中的损害。2. 3. 3对CK (肌酸激酶)和MPO (髓过氧物酶)的影响组织中肌酸激酶(CK)广泛存在于各种组织中，与三磷酸腺苷(ATP)的再生有关， 此酶的功能是在生理水平上维持细胞内的三磷酸腺苷浓度。CK在细胞受损时可从细胞中释放入血液，从而血浆或血清CK水平的高低可以用于反映细胞、组织受损的程度，如心肌损伤时血清CK升高。临床使用血浆、血清CK测定的最重要意义在于诊断急性心肌梗塞。MPO是一种中性粒细胞活化的标志物，作为炎性介质MPO在细胞受损时释放增加。 组织MPO的水平可以反映心脏缺血再灌注损伤中心肌组织受损程度。利用酶活性检测方法检测血浆中肌酸激酶和心脏组织中髓过氧物酶，具体的结果如表1所示。表1L-Arg+GIK组合物对血浆CK和缺血心肌的MPO的影响
(compared with MI/R士saline，*P < 0. 05，**P < 0. 01) (η = 7)从表1可以看出，出伪手术组的CK含量最低，缺血再灌注生理盐水组(对照组) CK含量最高，缺血再灌注L-Arg和缺血再灌注GIK组的CK含量有所降低，与对照组具有显著区别(与对照组相比*P < 0. 05，η = 7)；而缺血再灌注L-Arg+GIK组CK含量降低更为明显，与对照组更具有显著区别(与对照组相比< 0. 01，η = 7)。这表明缺血再灌注 L-Arg+GIK能够有效的减少CK的释放，减少细胞、组织受损的程度。从表1还可以看出，出伪手术组的MPO含量最低，缺血再灌注生理盐水组(对照组)MPO含量最高，缺血再灌注L-Arg和缺血再灌注GIK组的MPO含量有所降低，与对照组具有显著区别(与对照组相比*P < 0. 01，n = 7)；而缺血再灌注L-Arg+GIK组MPO含量降低与对照组同样具有显著区别(与对照组相比**P < 0.01，η = 7)，但是MPO含量比前两组的还是要低。这表明缺血再灌注L-Arg+GIK能够有效的减少MPO的释放，减少心肌组织受损的程度。综合以上的检测结果，表明灌注左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物，在心脏缺血时能够增加血清当中的N0，减少梗死心脏面积，降低心肌在缺血中的损害，可应用于抗缺血心脏损伤病的治疗和防御。
权利要求
1.左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物，其特征在于，以水作为溶剂，包含质量浓度为5 10%的葡萄糖、25 50IU/L的胰岛素、40 100mmol/L的氯化钾和1 50g/ L的左型精氨酸。
2.权利要求1所述的左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物应用于抗缺血心脏损伤或抗心衰药物的制备。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，应用于抗缺血心脏损伤的治疗性药物或防护性药物的制备。
全文摘要
本发明公开了一种左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物，以水作为溶剂，包含质量浓度为5～10％的葡萄糖、25～50IU/L的胰岛素、40～100mmol/L的氯化钾和1～50g/L的左型精氨酸。所述的左型精氨酸-葡萄糖-胰岛素-氯化钾组合物一方面补充外源性的L-Arg，另一方面，通过葡萄糖-胰岛素-氯化钾激活心血管系统eNOS，增强内源性NO产生，发挥心脏保护作用，减小心肌梗死促进心脏功能恢复。该组合物可应用于抗缺血心脏损伤或抗心衰药物的制备。
文档编号A61P9/04GK102218134SQ201110144009
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者付锋, 刘文冲, 李嘉, 董玲, 蔡晓庆, 高峰 申请人:中国人民解放军第四军医大学