一种大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法

专利名称：一种大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法
技术领域：
本发明属于中药制备技术领域，涉及一种中药药物活性成分的提取制备方法，特别是涉及大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法。
背景技术：
大黄硝石汤源自汉代张仲景《金匮要略》，由大黄、芒硝、黄柏、桅子组成，是治疗热重于湿型黄疸表热里实者的代表方剂。方中大黄与芒硝配伍加强泄热通腑祛瘀之力，桅子与黄柏配伍加强清热燥湿之力，大便一通则“里实”随之消除，小便亦自然爽利，全方荡涤里实，逐三焦湿热从二便而出，共奏泄下通腑退黄之功。我国历代医家在辨证论治的基础上对该方进行化裁，治疗黄疸兼有里热便秘腹满症候，有力地指导着临床实践。现代此方多用于治疗急、慢性病毒性肝炎，胆结石，急性胃炎，急性胰腺炎，胆囊炎等疾病。然而后世医家对该方的研究多集中在临床应用方面，对其药理研究、药效物质等的基础研究尚停留在单味药层面。大黄味苦，性寒，归脾、胃、肝、大肠、心包经，其苦寒沉降，泻实热，走而不守，斩关夺门，有将军之号。大黄治疗黄疸主要与以下药理作用有关①泻下作用大黄泻下有效成分为结合型蒽醌苷，其中番泻苷A和大黄酸苷类是主要活性成分，番泻苷A活性最强，大黄酸苷类含量最高。现代研究证实，大黄经口服后，通过小肠时，结合型的蒽苷大部分未经吸收直接抵达大肠，被肠道细菌的β -糖苷酶分解，通过进一步水解、还原、裂解为大黄真正的泻下成分大黄酸蒽酮或大黄酸蒽酮-8-葡糖糖苷，刺激大肠粘膜下及肠壁肌层内神经丛，显著促进横结肠和降结肠蠕动(沈海葆.矿物药在温病治疗中的作用[J].江苏中医，1990，(11):518)；此外，大黄还可以通过抑制肠壁Na+-K+-ATP酶，抑制钠离子通过肠壁转运到细胞，使钠离子和水滞留于肠腔，肠腔容积扩大，机械刺激肠壁使蠕动增加，促进胃肠功能以及胆汁分泌和胆囊收缩(骆和生，等.中药方剂的药理与临床研究进展[M]. 广州华南理工大学出版社，1991，163、刘兴祥.大黄的药理作用及其临床应用[J].中国中西医结合杂志，1992，12 (9): 571)。②抗病原微生物作用大黄具有广谱抗菌、抗病毒作用。大黄素、芦荟大黄素对金葡菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌在体外有抑菌作用(中药药理学[M].北京人民卫生出版社，2000，330;198;219)。王文风等报道(大黄醇提片抗痢疾杆菌和肠炎病原菌的实验研究[J].中成药，1991，13(3) :27)大黄蒽醌衍生物大黄酸、大黄素和芦荟大黄素对临床常见的100株厌氧菌有很强的抑制作用，其作用可能与干扰细菌细胞壁的形成和细胞膜的通透性有关。也有人认为其抑菌机理是与DNA相结合，抑制DNA、 RNA和蛋白质的生物合成从而抑制细菌生长(西R五夫著.杨纯正摘译.大黄的生物活性及其有效成份[J].国外医学·中医中药分册，1986，8(3):27)，且大黄提取液稀释100 倍有促使人体产生干扰素的作用(骆永珍摘译.中药与免疫[J].国外医学·中医中药分册，1984，6(1) :47)，可帮助机体清除肝炎病毒，而起抗病毒作用。北京高元元等应用大黄提取物原液对乙型肝炎表面抗原体灭活作用进行了研究，结果表明，HBsAg阳性血液与大黄提取液1 :1混合，作用10分钟以上即可使HBsAg灭活(高元元，等.大黄提取物对乙型肝炎表面抗原体外灭活作用的研究[J].北京医科大学学报，1993，(增刊)146)。③抗炎作用大黄对多种实验性炎症模型表现出显著的抗炎作用。大黄没有肾上腺皮质激素样作用， 说明大黄的抗炎作用与垂体-肾上腺皮质系统无关(张连春.冰片芒硝治疗一般外科感染 230例[J],中西医结合杂志，1984，4 (5): 272)。④调节免疫作用大黄能抑制体液免疫，增强细胞免疫，可消除免疫变态反应，具有免疫调控作用，可稳定机体内环境。大黄不仅能使四氧化碳所致大白鼠急性肝损伤程度减轻，血清丙氨酸转氨酶下降，而且能提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能(程经华，等.大黄注射液治疗急性黄疸型肝炎作用机理的初步探讨 [J].中国中药杂志，1989，14(10):46)。⑤活血作用对大黄针剂、精制大黄片、生大黄片和生黄粉的体外血凝实验，均有明显的抗凝作用(吴才贤，等.大剂量单味大黄治疗急性黄疸型肝炎的初步观察[J].中西医结合杂志，1984，4(2) :89，50)。一些研究者提出大黄活血化瘀的机理可能为提高血浆渗透压，促进细胞外液向血管内转移，使血液稀释，血液粘度下降，增强其活动性有利于活血作用(张志圣.大黄的药理及其在急腹症中的应用[J].福建中医杂志，1985，(1))，调节机体血液循环的正常运行，使红细胞压积减少，解除微循环障碍，恢复组织细胞的正常代谢和血液供应，从而改善肝脏的营养，促进损伤的修复。
桅子性苦寒，无毒，入心、肝、肺、胃经，具有清热泻火利尿的作用，从而能够治疗黄疸，与其抗菌、抗炎、保肝利胆及胰腺保护等作用有关。①桅子具有保肝作用桅子提取物对结扎总胆管的GOT升高有明显的降低作用，但是桅子抗胆红素血症作用与Y、Z蛋白关系不大(阴健，等.中药现代研究及临床应用[M]北京北京学苑出版社，1993，471)。桅子生品及各种炮制品的95%乙醇提取物，灌胃给予小鼠进行其护肝作用比较，发现生品对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用最强，炒品、炒焦品、姜炙品也有较好的作用，炒炭品则无此作用。加热炮制可使桅子的护肝作用降低，且随温度升高，作用逐渐降低，炮制温度达200°C时，护肝作用消失，主要是由于有效成分桅子苷受热破坏分解所致(张学兰， 等.桅子不同炮制品护肝作用比较研究[J].中成药，1996，18 O): 18)。桅子正丁醇提取物对ANIT引起的肝组织灶性坏死、胆管周围炎和片状坏死等病理变化有明显保护作用(沈映君.中药药理学[M].北京人民卫生出版社，2000，330; 198; 219)。②桅子的利胆作用 胆结石患者口服桅子水煎液后，经胆囊X光片显示，用药后患者的胆囊都有明显收缩，容积变小，长径和宽径缩小，说明桅子水煎液能促进胆囊收缩，加速其排空(李月玺，等.25种中药对胆囊运动功能影响的B超观察[J].中国中药杂志，1995，20 (12):7 )。进一步研究，桅子所含环烯醚萜苷类成分均有利胆作用，藏红花苷、藏红花酸及格尼泊素均可使胆汁分泌量增加。桅子主要成分京尼平苷于大鼠十二指肠给药，对胆汁分泌呈显著的持续性的促进作用。京尼平苷苷元、京尼平静脉内及十二指肠内给予，均与去氢胆酸钠作用同等或有胜之，呈利胆作用，说明京尼平苷是通过水解生成京尼平而发挥利胆作用的(阴健，等.中药现代研究及临床应用[M].北京北京学苑出版社，1993，471)。③桅子对胰腺的作用对于实验性急性出血坏死性胰腺炎大鼠，桅子能明显地改善胰、肝、胃、小肠血流，尤其能使胰腺的血流基本保持正常供给，能减轻胰腺炎的胰腺病损，降低早期死亡率，有效地改善急性胰腺炎的预后(李月玺，等.25种中药对胆囊运动功能影响的B超观察[J].中国中药杂志，1995，20(12) :7 )。桅子水煎液灌胃可使胰腺炎时升高了的胰腺细胞的线粒体、溶酶体膜脂的荧光偏振度降低，表明桅子水煎液对胰腺细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜均有稳定作用 (贾玉杰，等.桅子对急性胰腺炎大鼠胰腺细胞亚细胞器的保护作用[J].中国中西医结合杂志，1996，16(6) 355、贾玉杰，等.急性胰腺炎时SOD和GSH变化及桅子的影响[J].大连医学院学报，1993，15 303、滕佳琳.桅子[J].山东中医学院学报，1993，17 (3) :64)。 ④桅子具有抗菌抗炎的药理作用，可以对抗多种病原体，桅子对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、卡他球菌、白喉杆菌、人型结核杆菌等具有中等强度抗菌作用。水浸液在体外能抑制各种皮肤真菌。水煎液在体外能杀死钩端螺旋体及血吸虫，并且有抗埃可病毒的作用(郭霖，等.茜草科药用植物药理作用研究概述[J].中医药信息，1994，11(1) :37、周帮靖.常用中药的抗菌作用及其测定方法[M].重庆科学技术出版社重庆分社，1987，188)。桅子对多种炎症模型均有抑制作用。黄柏味苦、性寒，归肾、膀胱经，能清热燥湿，泻火解毒，退虚热，消肿祛腐。其泻火解毒功效主要与其抗病原微生物作用、抗炎作用有关。黄柏水煎剂或醇浸剂在体外对多种致病菌有不同程度的抑制作用，对各种痢疾杆菌的抑制作用强。此外，黄柏对结核杆菌、钩端螺旋体等也有较强的抑制或杀灭作用，所含的多种季胺生物碱是黄柏抗菌有效成分，如小檗碱、巴马亭、药根碱等均有较强的抗菌活性。有报道称黄柏水提液能促进饥饿家兔胆汁及胰液分泌。实验证明黄柏确有利胆作用，能促进胆汁分泌，并促进胆红素的排出(沈映君.中药药理学[M].北京人民卫生出版社，2000，330; 198; 219)。硝石又名消石，始载于《神农本草经》，谓消石“御览引云一名芒硝，大观本作黑字”，芒硝首载于《名医别录》，经本草研究考证，仲景《金匮要略》中大黄硝石汤所用硝石即今日之芒硝，其主要成分为十水合硫酸钠(Na2SO4 · IOH2O,分子量322. 19)，味咸、苦，性寒， 归胃、大肠经。硝石在方中主要配合大黄起到祛瘀泻热的目的，药理基础为其泻下及抗炎的作用。①泻下作用芒硝可使肠腔渗透压增高，肠液积留肠腔，肠段膨胀，肠内容物体积增大，促进肠蠕动而排出稀便，产生较剧烈的泻下作用，说明芒硝含硫酸钠，内服后产生钠离子和硫酸根离子，不易被肠壁吸收，形成高渗状态，引起机械刺激而产生泻下作用(沈海葆.矿物药在温病治疗中的作用[J].江苏中医，1990，(11) :518)。②抗炎作用芒硝性味苦寒，有消肿清热的作用，可以加快淋巴循环，增强网状内皮细胞的吞噬功能(骆和生， 等.中药方剂的药理与临床研究进展[J].广州华南理工大学出版社，1991，163)。
前期研究发现，方中大黄与黄柏在合煎时，大黄中蒽醌类成分与黄柏中的生物碱类成分会发生反应，形成难溶于水的大分子复盐，导致有效成分提取量减损(裴妙荣，等.中医方剂中酸碱对药的配伍化学研究[J].中国中药杂志，2009，34(15) 1989-1993)，并采用量子化学方法确定了大黄酸与小檗碱合煎生成的大分子复盐结构。同时，研究发现此复盐在人工胃液、肠液中的溶解度很低，药理学实验验证了大分子复盐的生物有效利用度很低(裴妙荣，等.中医方剂中酸碱对药的配伍化学研究[J].中国中药杂志，2009，34 (1 : 1989-1993、裴妙荣，等.酸碱对药所含酸碱性成分共煎形成复合物的结构研究[J] ·中国中医药，2009，34 (23) 3054-3059)。因此，现有大黄硝石汤的全方煎煮制备方法存在着黄柏所含碱性成分与大黄所含酸性成分在煎煮过程中发生缔合反应而生成不溶性沉淀(此沉淀不被机体吸收利用)，使有效成分减少、药效作用降低的问题。

发明内容
本发明的目的是提供一种大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法，以避免出现药物有效成分减失、药效作用降低的问题。本发明大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法是按照下述步骤进行的
1)将大黄以6 8倍量水煎煮30 40min，煎液趁热过滤，浓缩至每ml含生药量0.5 0. 6g，上D-101型大孔树脂柱，水洗至澄清后，以75%乙醇洗脱至无色，收集75%乙醇洗脱液，回收溶剂后低温烘干，粉碎成细粉，即得大黄提取组分；
2)以6 8倍量50%乙醇回流提取黄柏1 1.证，提取液回收溶剂后，低温烘干，粉碎成细粉，即得黄柏提取组分；
3)将桅子分别以6 8倍量水煎煮二次，每次30 40min，煎液趁热过滤，浓缩至每ml 含生药量0. 6 0. 7g，上D-101型大孔树脂，水洗至澄清后，采用95%乙醇洗脱至无色，收集 95%乙醇洗脱液，回收溶剂后低温烘干，粉碎成细粉，即得桅子提取组分；
4)按大黄提取组分18 20重量份，黄柏提取组分6 8重量份，桅子提取组分30 32重量份，芒硝68 70重量份，将上述4种组分混合均勻，制成大黄硝石汤药物活性成分。其中，大黄提取液的大孔树脂柱上样量为每Iml树脂上样大黄生药量0. 7 0. Sg。 桅子提取液的大孔树脂柱上样量为每Iml树脂上样桅子生药量1. 2 1. 3g。进一步地，可以在本发明制备得到的大黄硝石汤药物活性成分中加入制备不同剂型所需的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用的口服剂型，如丸剂、散剂、片剂、胶囊剂等。由于大黄硝石汤在煎煮过程中发生成分间的相互作用，出现了部分药味有效成分减失的现象，本发明采用将各个单味组分分别提取，精制后再进行组合的方法，解决了全方煎煮时引发的黄柏所含碱性成分与大黄所含酸性成分发生缔合反应而生成不溶性沉淀的问题。同时，本发明在药物提取过程中尽量避免提取溶剂、提取工艺对各药味的影响，降低了毒性有机溶剂的使用，避免有效成分发生化学变化。通过上述方式，本发明有效解决了大黄硝石汤全方煎煮有效成分减少、药效作用降低的问题。
具体实施例方式取大黄约lOOOg，加入7L水煎煮40min，煎液趁热过滤，浓缩至每ml含生药量
0.53g，按照每Iml树脂上样大黄生药量0. 73g的上样量上D-101型大孔树脂柱，水洗至澄清后，再以75%乙醇洗脱至无色，收集75%乙醇洗脱液，回收溶剂后低温烘干，粉碎成细粉得到大黄提取组分。取黄柏约lOOOg，加入50%乙醇7L，回流提取lh，提取液回收溶剂后，低温烘干，粉碎成细粉得到黄柏提取组分。取桅子约lOOOg，加入7L水煎煮40min，再加入同样体积的水煎煮30min，每次煎液趁热过滤，合并两次煎液，浓缩至每ml含生药量0. 65g，按照每Iml树脂上样桅子生药量
1.24g的上样量上D-101型大孔树脂，先水洗至澄清，再采用95%乙醇洗脱至无色，收集95% 乙醇洗脱液，回收溶剂后低温烘干，粉碎成细粉得到桅子提取组分。将大黄提取组分18g，黄柏提取组分6g，桅子提取组分30g，芒硝68g混合均勻，制成大黄硝石汤药物活性成分。采用湿热黄疸造模大鼠，以谷丙转氨酶、谷草转氨酶及血清总胆红素为指标，对本实施例的药效进行动物试验考察。
模型组血清酶及总胆红素含量较空白组明显升高(* P < 0. 01)，说明造模大鼠符合黄疸模型要求。各治疗组AST、ALT与TBiL含量较模型组显著降低(Δ P < 0. 01)，说明各组对湿热黄疸模型均具有显著治疗作用。大黄硝石汤药物活性成分组的AST、ALT与TBiL含量明显低于联苯双酯阳性对照组(▼ P<0. 05)，且与大黄硝石汤组比较ALT与TbiL也有显著下降趋势(☆ P < 0. 05)。综合分析，依据血清酶指标以及总胆红素指标在黄疸判定方面的作用，对各组进实验动物健康Wistar大鼠50只，中国医学科学院实验动物研究所提供，雌雄各半，体重200士 10g，周龄5 7周。实验试剂谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及血清总胆红素(TBiL)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所第一分所，批号20100104。葡萄糖粉，石家庄市葡萄糖厂，批号090801，临用前用蒸馏水配成50%溶液。普通食用色拉油，经高温灭菌处理。α-萘异硫氰酸酯(ΑΝΙΤ，别称异硫氰酸-1-萘酯)，北京通县育才精细化工厂产品，批号911209， 临用前用色拉油配成12mg/ml的混悬液。实验药液联苯双酯，浙江医药股份有限公司新昌制药厂生产，1.5mgX250丸，批号081002，研碎，加蒸馏水配成每ml含联苯双酯0. 2025mg的混悬液。大黄硝石汤水煎液， 按处方称取药材，按原方煎煮方法制备提取液，提取液浓缩至每ml含生药0. 405g。大黄硝石汤药物活性成分，按实施例方法得到大黄硝石汤药物活性成分后，用蒸馏水配置成浓度为0. 061g/ml的混悬液。将大鼠按体重随机分为5组空白对照组、模型对照组、联苯双酯阳性对照组、大黄硝石汤组，大黄硝石汤药物活性成分组，每组10只，雌雄各半。实验动物分组后单笼饲养，自由食水，同等条件下饲养3天，各组动物称重，之后施加处理因素，湿热证造模7天，治疗组预防性给药7天，黄疸造模2天，取材1天，共17 天，具体方法如下空白组每天予0.9%生理盐水2mL/100g灌胃。其他组放于湿热造模箱内(造模箱内温度28 32°C，相对湿度RH>95%)，每日上午予1 1的50%葡萄糖和猪油脂混合液2mL/100g灌胃。湿热证造模7天后，各组每日上午灌胃同前，下午治疗组予已配好的药液2mL/200g，模型组予等剂量生理盐水。预防性给药7天后，除空白组，其他各组予 ANIT2mL/200g灌胃。继续给药2天。腹主动脉取血，收集血液标本，室温静止后3000 r/min离心20min，分离血清，按照血清酶、总胆红素试剂盒操作，检测血清ALT、AST及TBiL含量，各组大鼠血清酶及总胆红素含量结果见表1。
权利要求
1.一种大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法，按照下述步骤进行1)将大黄以6 8倍量水煎煮30 40min，煎液趁热过滤，浓缩至每ml含生药量0.5 0. 6g，上D-101型大孔树脂柱，水洗至澄清后，以75%乙醇洗脱至无色，收集75%乙醇洗脱液，回收溶剂后低温烘干，粉碎成细粉，即得大黄提取组分；2)以6 8倍量50%乙醇回流提取黄柏1 1.证，提取液回收溶剂后，低温烘干，粉碎成细粉，即得黄柏提取组分；3)将桅子分别以6 8倍量水煎煮二次，每次30 40min，煎液趁热过滤，浓缩至每ml 含生药量0. 6 0. 7g，上D-101型大孔树脂，水洗至澄清后，采用95%乙醇洗脱至无色，收集 95%乙醇洗脱液，回收溶剂后低温烘干，粉碎成细粉，即得桅子提取组分；4)按大黄提取组分18 20重量份，黄柏提取组分6 8重量份，桅子提取组分30 32重量份，芒硝68 70重量份，将上述4种组分混合均勻，制成大黄硝石汤药物活性成分。
2.根据权利要求1所述的大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法，其特征是所述大黄提取液的大孔树脂柱上样量为每Iml树脂上样大黄生药量0. 7 0. Sg。
3.根据权利要求1所述的大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法，其特征是所述桅子提取液的大孔树脂柱上样量为每Iml树脂上样桅子生药量1. 2 1. 3g。
4.根据权利要求1所述的大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法，其特征是将制备不同剂型所需的常规辅料加入所述大黄硝石汤药物活性成分中，制成任何一种口服剂型。
全文摘要
一种大黄硝石汤药物活性成分的提取制备方法，是将大黄煎煮得到的水煎液浓缩后，上大孔树脂柱精制得到大黄提取组分，将黄柏以乙醇提取得到黄柏提取组分，将栀子煎煮得到的水煎液浓缩后，以大孔树脂精制得到栀子提取组分，最后将大黄提取组分、黄柏提取组分、栀子提取组分与芒硝混合制成大黄硝石汤药物活性成分。本发明有效解决了大黄硝石汤全方煎煮有效成分减少、药效作用降低的问题。
文档编号A61K33/04GK102293852SQ201110255178
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者李慧峰, 李翠红, 裴妙荣, 高宝益 申请人:山西中医学院