专利名称：一种用于脊椎椎管注射的利马前列素纳米乳制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种纳米乳制剂，特别是一种生物利用度高、 质量稳定、可用于脊椎椎管注射的利马前列素纳米乳制剂。
背景技术：
利马前列素(Limaprost )的化学名称为
(E)-7-[(1R，2R, 3R)-3-hydroxy-2-[(3S, 5S)-(E)-3-hydroxy-5-methyl-l-nonenyl]-5-oxocyclopentyl] -2-heptenoic acid,结构式如下所不
本品为前列腺素El的衍生物，可增加环磷酸腺苷(CAMP)含量、抑制血栓素A2(TXA2)生成，具有血管扩张、增加血流和抑制血小板凝集与黏附的作用，动物实验亦表明可增加神经组织血流量、改善神经机能。临床上用于改善血栓闭塞性脉管炎引发的各类缺血性症状，如溃疡，疼痛、冷感；改善腰椎管狭窄症(直腿抬高试验(straight leg raising test, SLR) 正常的间歇性跛行患者)的主观症状(疼痛和麻木感)和行走能力。腰椎椎管狭窄症常见于中年以上的患者，男多于女，患者主要症状是长期反复的腰腿痛和间歇性跛行。疼痛性质为酸痛或灼痛，有的可放射到大腿外侧或前方等处，多为双侧，可左、右腿交替出现症状。当站立和行走时，出现腰腿痛或麻木无力，疼痛和跛行逐渐加重，甚至不能继续行走，休息后症状好转，骑自行车无妨碍。病情严重者，可引起尿急或排尿困难。部分患者可出现下肢肌肉萎缩，以胫前肌及伸肌最明显，肢体痛觉减退，膝或跟腱反射迟钝，直腿抬高试验阳性。目前，临床上脊椎管狭窄症的主要治疗方法为手术治疗，但是手术治疗风险较大， 易引起脊髓损伤，甚至出现完全性截瘫。口服已上市的利马前列素片剂能起到一定的缓解作用，但是能够到达脊椎椎管病灶部位的有效药量非常少，很难发挥出利马前列素的药效， 而且由于利马前列素片剂为微量制剂，制备方法复杂，片剂的含量均勻度很难保证，提高了生产检验的成本，增加了临床使用的风险。本发明人经过潜心研究，克服了主药利马前列素原料药液体制剂不稳定的缺点，开发出可用于脊椎椎管注射的质量均一的纳米乳制剂，通过直接作用于脊椎椎管的病灶部位，解决了口服制剂由于首过效应而仅少量到达脊椎椎管的缺陷，提高了治疗效果，降低了手术治疗的机率，方便了临床中的使用。目前，关于利马前列素的液体制剂无任何文献报道
发明内容
针对目前前列环素类物质制剂中普遍存在的稳定性差、有效期短、贮存条件高、口服制剂生物利用度低等问题，本发明的目的是制备可用于常温保存、脊椎椎管注射的利马前列素纳米乳制剂。本发明的技术方案如下
一种用于脊椎椎管注射的利马前列素纳米乳制剂，该制剂中含有按重量份计0. 003 0. 01份的主药利马前列素、50 75份的注射用油、10 25份的乳化剂、10 30份的注射用甘油、0. 05、. 2份乳化稳定剂。该制剂可用于脊椎椎管注射。其中乳化稳定剂为枸橼酸和枸橼酸钠的组合物，二者按重量份计为1 1。其中注射用油包含一种或多种选自注射用大豆油、注射用花生油、氢化玉米油、茶油、芝麻油、红花油、棉籽油、椰子油C8/C10甘油三酯、植物油聚乙二醇甘油酯的注射用油。其中乳化剂包含一种或多种选自精制大豆磷脂、精制卵磷脂、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、椰子油C8/C10聚乙二醇甘油酯、杏仁油油酸聚乙二醇甘油酯的乳化剂。此外，该纳米乳制剂还包含注射用甘油。进一步地，该制剂中按重量份数计，所述纳米乳制剂包含利马前列素酸0.005 0.01份，注射用油50 70份，乳化剂15 20份、注射用甘油20 25份、乳化稳定剂0. Γθ. 2 份，余量为注射用水。其中，纳米乳制剂的粒径范围为50 200纳米。利马前列素纳米乳制剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤
a.预热注射用油，加入乳化剂搅拌形成均一的油相；
b.缓慢加入处方量的利马前列素，高速搅拌使其溶解在油相中；
c.将注射用甘油、乳化稳定剂用预热的注射用水稀释形成均一的水相；
d.在高速搅拌条件下，将油相缓慢滴入水相中，形成乳液；
e.在高压条件下，将乳液高压均质或通过微射流至乳剂平均粒径低于200纳米。其中，高速搅拌的转速为8000 10000转/分钟；所述高压为5000 15000 Psi。具体地，本发明所述的利马前列素纳米乳的制备方法包括如下步骤
a、称取处方量的原料药、各种辅料；
b、将处方量的注射用油预热，加入乳化剂手持搅拌形成均一的油相后缓慢加入利马前列素原料药，高速搅拌使其均勻地溶解在油相中；
C、将注射用甘油、乳化稳定剂用适量的预热注射用水稀释后形成均一的水相；
d、将上述水相倒入到搅拌器内，在高速搅拌条件下将油相缓慢滴入水相中，均勻分散后形成乳白色的初乳；
e、取上述初乳转移到高压乳勻机内或微射流装置内，勻化至平均粒径达200纳米以下，调PH值，流通蒸汽过滤，所得的纳米乳灌封于安瓿中，充氮气，即得。更具体地，本发明所述的用于脊椎椎管给药的纳米乳制剂的制备方法包括如下步骤
a、称取各种原料药利马前列素5 10mg、注射用油50 70g、乳化剂15 20g、注射用甘油20 25g、枸橼酸100 200mg、枸橼酸钠100 200mg、其余为注射用水；b、将乳化剂加入到预热至6(T70°C的注射用油中，手持搅拌形成均一的油相后缓慢加入利马前列素原料药，高速搅拌使其均勻地溶解在油相中；
c、将注射用甘油、枸橼酸、枸橼酸钠用适量的预热至6(T70°C的注射用水稀释后形成均一的水相；
d、将上述水相倒 入到搅拌器内，在10000转/分钟的搅拌条件下将油相缓慢滴入水相中，搅拌10分钟，均勻分散后形成乳白色的初乳；
e、取上述初乳加入预热至6(T7(TC的注射用水，注射用水达全量，转移到高压乳勻机或微射流机内，勻化10 12次，取样测定粒径直至平均粒径达200纳米以下，调pH值为 5. 0 5. 9，通过0. 22微米的微孔滤膜，流通蒸汽过滤，所得的纳米乳制剂灌封于安瓿中，充氮气，即得。本发明人经过长期的研究与筛选，研发出了包含枸橼酸和枸橼酸钠的利马前列素纳米乳，该稳定剂既能保证利马前列素处于相对稳定的弱酸环境中，又能够防止利马前列素氧化降解，解决了目前利马前列素由于原料药本身的不稳定性而难于制成液体制剂的缺陷，。本发明制备的纳米乳制剂的粒径范围在50纳米 200纳米之间，外观不透明，呈乳状。可通过脊椎椎管注射靶向地富集于病灶部位，疗效显著，克服了市售品利马前列素片剂口服生物利用度低的缺陷。安全性试验结果表明，本发明制备的纳米乳制剂无菌、热原检查合格，且无溶血性、无刺激性，符合临床用药对安全性和稳定性的要求。
图1为本发明的利马前列素纳米乳的粒径及其分布图。
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的内容所实现的技术均属于本发明的范围。显然，根据本发明的内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。实施例1
将60g注射用大豆油预热至65°C，加入IOg精制大豆磷脂手持搅拌形成均一的油相后缓慢加入3mg利马前列素原料药，在70°C下高速搅拌(8000转/分钟)3分钟，使其均勻溶解在油相中；将20g注射用甘油、35mg乳化稳定剂枸橼酸钠、35mg乳化稳定剂枸橼酸用适量的预热至6(T70°C的注射用水稀释后形成均一的水相；将上述水相倒入到搅拌器内，在10000 转/分钟的搅拌条件下将油相缓慢滴入水相中，搅拌10分钟，均勻分散后形成乳白色的初乳；将初乳加到预热至6(T7(TC的注射用水中达全量，转移到高压乳勻机内，于8000 Psi压力下均质10次，取样测定粒径至平均粒径达200纳米以下，调pH为5. 0 5. 9，通过0. 22 微米的微孔滤膜，流通蒸汽灭菌，所得的纳米乳制剂灌封于安瓿中，充氮气，即得。实施例2
将70g注射用大豆油预热至6(T70°C，加入15g精制卵磷脂手持搅拌形成均一的油相后缓慢加入4mg利马前列素原料药，在70°C下高速搅拌(8000转/分钟)4分钟，使其均勻溶解在油相中；将IOg注射用甘油、25mg乳化稳定剂枸橼酸钠、25mg乳化稳定剂枸橼酸用适量的预热至6(T70°C的注射用水稀释后形成均一的水相；将上述水相倒入到搅拌器内，在10000 转/分钟的搅拌条件下将油相缓慢滴入水相中，搅拌10分钟，均勻分散后形成乳白色的初乳；将初乳加到预热至6(T7(TC的注射用水中达全量，转移到高压乳勻机内，于15000 Psi 压力下均质8次，取样测定粒径至平均粒径达200纳米以下，调pH为5. 0 5. 9，通过0. 22 微米的微孔滤膜，流通蒸汽灭菌，所得的纳米乳制剂灌封于安瓿中，充氮气，即得。实施例3
将50g氢化玉米油预热至69°C，加入15g聚氧乙烯蓖麻油手持搅拌形成均一的油相后缓慢加入6mg利马前列素原料药，在70°C下高速搅拌(8000转/分钟)3分钟，使其均勻溶解在油相中；将30g注射用甘油、50mg乳化稳定剂枸橼酸钠、50mg乳化稳定剂枸橼酸用适量的预热至6(T7(TC的注射用水稀释后形成均一的水相；将上述水相倒入到搅拌器内，在 9000转/分钟的搅拌条件下将油相缓慢滴入水相中，搅拌12分钟，均勻分散后形成乳白色的初乳；将初乳加到预热至6(T7(TC的注射用水中达全量，转移到高压乳勻机内，于10000 Psi压力下均质10次，取样测定粒径至平均粒径达200纳米以下，调pH为5. 0 5. 9，通过 0. 22微米的微孔滤膜，流通蒸汽灭菌，所得的纳米乳制剂灌封于安瓿中，充氮气，即得。实施例4
将75g注射用花生油预热至67°C，加入20g精制卵磷脂手持搅拌形成均一的油相后缓慢加入7mg利马前列素原料药，在70°C下高速搅拌(8000转/分钟)3分钟，使其均勻溶解在油相中；将20g注射用甘油、50mg乳化稳定剂枸橼酸钠、50mg乳化稳定剂枸橼酸用适量的预热至6(T70°C的注射用水稀释后形成均一的水相；将上述水相倒入到搅拌器内，在10000 转/分钟的搅拌条件下将油相缓慢滴入水相中，搅拌10分钟，均勻分散后形成乳白色的初乳；将初乳加到预热至6(T7(TC的注射用水中达全量，转移到微射流机内反复微射15次，取样测定粒径至平均粒径达200纳米以下，调pH为5. 0 5. 9，通过0. 22微米的微孔滤膜，流通蒸汽灭菌，所得的纳米乳制剂灌封于安瓿中，充氮气，即得。实施例5
将65g椰子油C8/C10甘油三酯预热至60°C，加入20g聚氧乙烯氢化蓖麻油手持搅拌形成均一的油相后缓慢加入9mg利马前列素原料药，在70°C下高速搅拌(8000转/分钟)3 分钟，使其均勻溶解在油相中；将25g注射用甘油、75mg乳化稳定剂枸橼酸钠、75mg乳化稳定剂枸橼酸用适量的预热至6(T70°C的注射用水稀释后形成均一的水相；将上述水相倒入到搅拌器内，在10000转/分钟的搅拌条件下将油相缓慢滴入水相中，搅拌10分钟，均勻分散后形成乳白色的初乳；将初乳加到预热至6(T7(TC的注射用水中达全量，转移到微射流机内反复微射12次，取样测定粒径至平均粒径达200纳米以下，调pH为5. 0 5. 9，通过 0. 22微米的微孔滤膜，流通蒸汽灭菌，所得的纳米乳制剂灌封于安瓿中，充氮气，即得。实施例6
将75g植物油聚乙二醇预热至65°C，加入25g精制大豆磷脂手持搅拌形成均一的油相后缓慢加入IOmg利马前列素原料药，在70°C下高速搅拌(8000转/分钟)3分钟，使其均勻溶解在油相中；将30g注射用甘油、IOOmg乳化稳定剂枸橼酸钠、IOOmg乳化稳定剂枸橼酸用适量的预热至6(T7(TC的注射用水稀释后形成均一的水相；将上述水相倒入到搅拌器内，在10000转/分钟的搅拌条件下将油相缓慢滴入水相中，搅拌10分钟，均勻分散后形成乳白色的初乳；将初乳加到预热至6(T7(TC的注射用水中达全量，转移到高压乳勻机内， 于15000 Psi压力下均质10次，取样测定粒径至平均粒径达200纳米以下，调pH为5. 0 5. 9，通过0. 22微米的微孔滤膜，流通蒸汽灭菌，所得的纳米乳制剂灌封于安瓿中，充氮气， 即得。 以下试验例为对上述实施例制备的脂微球制剂进行的理化性质及安全性检测试验。试验例1 药物粒径的测定
对本发明的纳米乳制剂的粒径及分布进行了测定，具体方法如下取本发明制备的纳米乳制剂用静态蒸发光散射粒径分析仪(LS13320，Beckman Coulter，美国)，测定所得的纳米乳制剂的粒径及其分布，结果见图1。由图1可见，所得的脊椎椎管注射用的纳米乳制剂的粒径大小符合正态分布。脊椎椎管注射用纳米乳制剂的粒径小于183nm，90%的粒径小于200nm。该测定结果符合注射用纳米乳制剂的相关要求。试验例2:稳定性试验
采用恒温加速试验法，分别在4°C、25°C下进行长期和加速试验，测定实施例的稳定性。 利马前列素降解率的结果如表1和2所示 表1 4°C长期试验的稳定性考察
Wi'g](月) I实施例ι I实施例2 I实施例3 I实施例4 I实施例5 I实施例6
0_0.25%0. 21%0. 18%0. 19%0. 23%0. 25%
3 — 0.48%— 0.44%0.44%0 40%0. 52%0.49%—
6 —1.22%“ 1. 13%I 15%1~11%1.26%1. 52%—
9 — 2.05%— 2.20%2.00%1799%2.10%2.06%—
12 — 2. 55%— 2.64%2.39%2.49%2. 56%—
18 —3.41%“ 3. 56%3.33%^35%3. 39%3.21%—
24 丨4. 52%丨4.66%丨4.41%丨4. 55%丨4. 53%丨4.62%
表中的百分比为利马前列素的降解百分率。表2 25 °C加速试验的稳定性考察
Wi'g](月) I实施例ι I实施例2 I实施例3 I实施例4 I实施例5 I实施例6
0_0.25% 0. 21% 0. 18% 0. 19% 0. 23% 0. 30%
1—0.61%“ 0.58%0. 56%θΓ55% 0. 57% 0.62%—
2—1.87%“ 1.88%182%ΤΤ79% 1.82% 1.91%—
3—2.40%“ 2.44%2. 31%2735% 2. 33% 2.41%— 6丨4.23%丨4. 35%丨4. 15%丨4.28% 丨4. 31% 丨4. 36%
表中的百分比为利马前列素的降解百分率。由表1和2可见按照本发明制备的利马前列素纳米乳注射液，由于加入了稳定剂枸橼酸和枸橼酸钠，使利马前列素处于一个相对稳定的特殊的弱酸环境中，该环境能够防止利马前列素的氧化降解，大大降低了其在液体制剂中的化学不稳定性；同时研究还表明该纳米乳制剂具有靶向作用，通过脊椎椎管的局部注射，可长期地富集于病灶部位。试验例3 本发明制剂的无菌检查
取以本发明方法制备纳米乳制剂，按照无菌检查法(中国药典2000版附录XI D)检查， 以本发明方法制备的脂微球制剂的无菌检查合格。试验例4 本发明制剂的热原检查
取以本发明方法制备纳米乳制剂，按照热原检查法(中国药典2000版附录XI D)检查，以本发明方法制备的 脂微球制剂的热原检查合格。试验例5本发明制剂的刺激性试验
试验方法选取新西兰白种雄性兔(NZW)6只，体重3. (Γ3. 8kg，均于左后耳缘静脉缓慢注射利马前列素纳米乳100 μ g/只，右耳缘静脉缓慢注射10%的葡萄糖注射液100 μ g/只， 每天一次，连续注射三天，于注射第一次开始，每天观察注射部位有无水肿、红斑。末次注射 2小时后，将含有饱和氯化钾的溶液注入心脏，使兔猝死。马上从侧耳部，每一只连续切取含有耳缘静脉的约5X 15mm的组织共4片，固定于10%中性缓冲福尔马林液中，将固定后的组织，按常法包埋，切成薄片HE染色，在光学显微镜下观察。试验结果本发明的提高稳定性的利马前列素纳米乳，给兔耳缘静脉每日注射一次，连续三天，6只兔耳注射部位未见有红肿和红斑发生。病理组织学观察，兔耳表皮结构正常。表皮下乳头层及网织层无炎细胞渗出、无出血，血管内无血栓形成。附件结构正常。试验例6 本发明制剂的脊椎椎管注射的有效性试验
试验方法制备6只腰椎椎管狭窄症的大鼠病理模型，试验前禁食12小时，在试验动物的相邻两椎体即腰2-3及腰4-5分别注射本发明的利马前列素纳米乳0. 5ml，对照组为空白对照(未予进行任何处理)。试验例6 本发明制剂的溶血性试验
试验方法取试管7支，1 5管分别加入0. ImL,0. 2mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL的提高稳定性的利马前列素纳米乳，并用10%的葡萄糖注射液稀释至2. 5mL，6号试管中加入10%葡萄糖注射液2.5mL、7号试管中加入蒸馏水2.5mL (完全溶血对照)。最后每管均加入2%兔红细胞悬液2. 5mL，轻轻摇勻，置37°C水浴中，分别记录15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2 小时、3小时、4小时各管的溶血和凝集情况。试验结果本发明制备的提高稳定性的利马前列素纳米乳1 5管在4小时内均未引起溶血和凝集反应。试验例7 本发明制剂的脊椎椎管注射的有效性试验
试验方法制备6只腰椎椎管狭窄症的大鼠病理模型，试验前禁食12小时，在试验动物的相邻两椎体即腰2-3及腰4-5分别于椎管内注射本发明的利马前列素纳米乳0. 5ml，对照组为空白对照(未予进行任何处理)，连续注射10天，每天1次，暂停10天后再连续注射10 天、每天1次，以40天为一个治疗疗程。40天后按照腰椎椎管狭窄症的判定指标间歇性跛行的程度来进行疗效的判定。试验结果通过X光片可知实验组的间歇性跛行的程度明显减轻，大鼠的活动性也逐渐增强，空白组大鼠的间歇性跛行的程度有略微的增加，大鼠呈明显的慵懒态、活动量变小。
权利要求
1.一种用于脊椎椎管注射的利马前列素纳米乳制剂，其特征在于该制剂中含有按重量份计0. 003 0. 01份的主药利马前列素、50 75份的注射用油、10 25份的乳化剂、10 30份的注射用甘油、0. 05、. 2份乳化稳定剂。
2.根据权利要求1所述的利马前列素纳米乳制剂，其特征在于该制剂可用于脊椎椎管注射。
3.根据权利要求1或2所述的利马前列素纳米乳制剂，其特征在于该乳化稳定剂为枸橼酸和枸橼酸钠的组合物，二者按重量份计的比例为1 1。
4.根据权利要求1或2所述的利马前列素纳米乳制剂，其特征在于注射用油包含一种或多种选自注射用大豆油、注射用花生油、氢化玉米油、茶油、芝麻油、红花油、棉籽油、椰子油C8/C10甘油三酯、植物油聚乙二醇甘油酯的注射用油。
5.根据权利要求1或2所述的利马前列素纳米乳制剂，其特征在于，所述乳化剂包含一种或多种选自精制大豆磷脂、精制卵磷脂、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、椰子油 C8/C10聚乙二醇甘油酯、杏仁油油酸聚乙二醇甘油酯的乳化剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的利马前列素纳米乳制剂，其特征在于，所述纳米乳制剂还包含注射用甘油。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的利马前列素纳米乳制剂，其特征在于，按重量份数计，所述纳米乳制剂包含利马前列素酸0. 005 0. 01份，注射用油50 70份，乳化剂 15 20份、注射用甘油2(Γ25份、乳化稳定剂0. Γ0. 2份，余量为注射用水。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的利马前列素纳米乳制剂，其特征在于，所述纳米乳制剂的粒径范围为50 200纳米。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的利马前列素纳米乳制剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤a.预热注射用油，加入乳化剂搅拌形成均一的油相；b.缓慢加入处方量的利马前列素，高速搅拌使其溶解在油相中；c.将注射用甘油、乳化稳定剂用预热的注射用水稀释形成均一的水相；d.在高速搅拌条件下，将油相缓慢滴入水相中，形成乳液；e.在高压条件下，将乳液高压均质或通过微射流至乳剂平均粒径低于200纳米。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述高速搅拌的转速为800(Γ10000 转/分钟；所述高压为5000 15000 Psi。
全文摘要
本发明提供一种用于脊椎椎管注射的利马前列素纳米乳制剂，具体为一种包含枸橼酸和枸橼酸钠乳化稳定剂的利马前列素纳米乳，其中该乳化稳定剂中枸橼酸和枸橼酸钠的重量比为1∶1，解决了利马前列素液态制剂不稳定的问题。该制剂可用于脊椎椎管注射，克服了目前口服利马前列素片剂由于首过效应仅有少量药物到达病灶部位的缺陷，提高了治疗效果，降低了手术治疗的机率，方便了临床中的使用。
文档编号A61P19/08GK102327216SQ20111029868
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者刘玉静, 刘红星, 张伟强, 张扬, 王伟, 程栎 申请人:北京泰德制药股份有限公司