血小板分析系统的制作方法

血小板分析系统的制作方法
【专利摘要】诊断患者的血清或血浆样品中的HIT(肝素诱导的血小板减少症)的方法以及包括进行该方法的试剂盒的系统。系统包括试剂，以设计用于特定血小板分析的诊断试剂盒的形式；系统可以进一步包括专用的、简单和容易使用的仪器，诸如血细胞计数器，适合于进行所述分析。分析系统主要用于测试血小板或与血小板反应的自身抗体或同种抗体，在与血小板功能障碍和流血倾向相关的特定和重要的临床状况、和导致血栓形成的高凝固性中。另外，血小板功能容量的测试包括对于兴奋剂和抑制剂的应答、和血小板激活标志物，其作为持续、体内血栓形成前活性的指示物。
【专利说明】血小板分析系统
发明领域
[0001]本发明涉及血小板分析系统，包括用于血小板相关的临床症状的诊断的特定试剂盒，和任选地包括血小板分析仪。
【背景技术】
[0002]在普通人群中血液凝固障碍是最常见的临床问题之一。称为“高凝固性”或“血栓形成倾向”的凝固的增加趋势是发病率和死亡率的主要原因。
[0003]在美国每年有大约500，000血栓形成事件，其中保守估计每年100，000死亡-大于AIDS、乳腺癌和交通事故合并相关的死亡发生。另外，毎年一百一十万心肌梗死和多于150,000中风死亡发生。
[0004]在癌症患者中，血栓形成是在恶性肿瘤自身之后的第二致死的原因。然而，只有在血栓形成事件出现之后，才给予治疗。
[0005]在女性中，高凝固性是妊娠血管并发症的主要危险因素，妊娠血管并发症包括:血栓形成，重度先兆子痫，子宮内生长受限和胎儿死亡，和分娩后的血栓形成或激素治疗后的血栓形成。根据最近的文献，在发达国家，分娩后女性死亡的主要原因是急性肺血栓栓塞症。
[0006]另ー个问题是与血小板相关的出血的增加趋势，其在一般人群中也是常见的。大约25%的具有月经过多-増加的月经出血-的女性具有这种异常。
[0007]涉及血栓形成和出血的发病机制的主要因素是循环血液的血小板。
[0008]血小板的性质可以通过流式细胞术测量。
[0009]流式细胞术(缩写为:FCM)是计数和检查微观粒子的技术，诸如细胞，通过将细胞悬浮在流体的流中和通过电子检测装置使它们通过。它允许毎秒多至数千个颗粒的物理和/或化学特征的同时多參数的分析。流式细胞术在健康病症诸如血癌的诊断中常规地使用。
[0010]单波长的光束(通常为激光)对准到液体的流体聚焦的流之上。多个检测器瞄准在流通过光束的点:ー个与光束一致(正向散射或FSC)和数个垂直于它(侧向散射或SSC)以及ー个或多个荧光检测器。每个穿过光束的0.2-150微米的悬浮粒子散射光线，和颗粒中找到或附着于颗粒的荧光化学品可以激发成为比光源波长更长的发射光。散射和荧光的这种组合被检测器获得，和通过分析在每个检测器(一个用于每个荧光发射峰)的光強度波动，然后可能得到关于每个单独的颗粒的物理和化学结构的各种类型的信息。FSC与细胞体积相关和SSC取决于颗粒的内部复杂性(即，细胞核的形状，细胞质颗粒的量和类型或细胞膜粗糙度)。这是因为散射掉细胞的内部组分的光)。也參见:Tomer A [TomerA2004], [Tomer A 等人，1988], [Tomer A 等人，1989a]对于血液的 FCM 的一般介绍。
[0011]现代的流式细胞仪能够分析“实时”地毎秒分析数千个颗粒，和可以主动分开和分离具有特定性质的颗粒。流式细胞仪类似于显微镜，除了不产生细胞的图像之外，流式细胞术提供设定參数的“高通量”(大数量的细胞)自动定量。对于细胞分离和分析的进ー步一般介绍，參见 Tomer A [Tomer A, 2002],.[Tomer A 等人，1987]。[0012]现代仪器常常具有多个激光和荧光检测器。増加的激光和检测器的数量允许多个抗体标记，和可以通过它们的表型标记可以更精确地识别目标群[Tomer A, 2004] 0
[0013]由流式细胞仪生成的数据可以ー维作图产生直方图，或以二维点图作图。通过产生一系列的子集提取，它们称之为“门”，在这些图上的区域基于荧光强度顺序地分开。
[0014]以下出版物描述了在血小板上进行的试验，涉及血细胞计数。
[0015]SCRIPPS RESEARCH INST[US]的US5656442描述了表征血小板聚集缺陷的方法。在一个实施例中，格兰茨曼血小板无カ症的CAM变体表征为具有配体结合缺陷。在另ー个实施例中，具有骨髓纤维化的患者确定为具有激活缺陷。通过荧光激活的流式细胞术进行分析。系统包括外壳，在分开容器中:(a)与激活血小板结合的激活特异性配体(ASL)；(b)在正常血小板上形成配体诱导的结合位点(LIBS)的激活独立配体(AIL)，其中所述激活独立配体包括选自以下的多肽序列:RGD，LGGAKQAGDV (SEQ ID NO:1),和KQAGDV (SEQ IDN04): (c)抗LIBS抗体；和(d)血小板激动剂。
[0016]BERG DAVID和BERG LOIS HILL [US]的W003028627描述了包括通过流式细胞术测定纤维蛋白原、凝血酶原组分1+2、凝血酶/抗凝血酶复合物、可溶纤维蛋白単体的激活水平的试验的方法。在五次分析的任何两次中偏离正常值用于诊断慢性疲劳综合征、纤维肌痛、或与凝固应答的激活相关的其它疾病。没有提供关于血小板激活的测量的细节。
[0017]PPD BIOMARKER DISCOVERY SCIENCES, LLC 的 US2005214877 描述测量包括血小板的样品中血小板表面蛋白质的量的方法，包括以下的步骤:(a)将样品与具有抗凝剂和至少ー种血小板激活抑制剂的血小板稳定组合物接触；(b)用对于血小板表面蛋白质和血小板刺激因子具有特异亲和力的标记化合物温育样品；和(c)通过血细胞计数(例如，微体积激光扫描血细胞计数)检测结合到血小板的标记化合物，由此可以測量血小板表面蛋白质的量。?
[0018]HECHINGER MARK [US]的US2003194818描述利用流式细胞术、涂布乳胶微球、和荧光染料标记的抗体同时检测样品中的ー种或多种分析物的存在和量的免疫分析方法和装置。通过结合FALS和荧光，使用数种不同尺寸、顔色或形状的珠子，每种珠子涂布不同的分析物，用于同时检测样品中的ー种或多种分析物和细胞成分诸如血小板。
[0019]HECHINGER M ARK [US]的US2003032068描述类似方法和装置，涉及血小板Ig阳性对照试剂和分析，其具有每个患者的荧光阳性区域的设置。血小板对照大小适合于安装在血小板和红细胞之间，目的是使得它作为真实的生物对照是理想的。
[0020]然而，尽管血小板异常的临床重要性,仍然存在血小板分析系统和方法的没有满足的需求，其使得临床医生容易诊断与血小板相关的各种医疗状況。这些状况包括引起流血的血小板功能异常和持续的血液凝固性过高活性，其可以导致血管闭塞和血栓形成，和在孕妇中导致胎盘血管并发症和胎儿死亡。目前使用的血小板分析方法具有某些方法学和实践限制，因此通常提供如以下具体说明的不完整的临床信息。
[0021]免疫性血小板减少症(IT)是以抗体介导的加速血小板破坏为特征的病症[George JN和Rizvi MA], [Tomer A等人1991]。尽管是临床重要的症状，它的诊断由于缺少常规临床使用的可行和可靠的分析目前被限制。因此，目前诊断通常基于主要通过排除推断的临床印象，參见[Neunert C等人]，[Provan D等人],尽管患者表现有时是复杂的。
[0022]而且，疑似传染病的患者可能接受经验疗法诸如高剂量皮质激素类，其可能就有明显的副作用，或高剂量的静脉注射免疫球蛋白，其是昂贵的治疗选择。
[0023]測定总的抗血小板或血小板结合抗体的方法-类似于红细胞的抗球蛋白试验ー已经证明是没用的，由于血小板不同于红细胞表达Fe-受体和自然地结合循环的抗体。
[0024]可以用于确定自身免疫性血小板减小的现有方法，诸如ELISA型试验(MAIPA)，具有显著的方法学和实践限制，具有有限的特异性，是人工密集型的(得到结果需要三天)和需要高度专业得到结果[Chong BH, Keng TB], [Cines DB, Blanchette VS], [McMillan R,等人2003]。因此，它们对于诊断常常不可用的。
[0025]而且，这些分析没有批准用于自身免疫性血小板减小的诊断。
[0026]由于这些原因，美国血液学会没用表明或推荐用于IT诊断的确认实验室分析[Neunert C 等人],[Provan D 等人]。
[0027]重要需要说明的是，如由Chong和Keng表明，虽然不要求确认试验(如，例如APS的诊断所要求的)的原因是还没用足够高灵敏和特异性的可靠试验。而且，基于排除的诊断具有潜在的问题[Cines DB, Blanchette VS], [McMillan R,等人2003],针对血小板专一受体的循环抗体的存在的直接实验室确认将是临床有帮助的[Chong BH, Keng TB]、[CinesDB,Blanchette VS]、[McMillan R,等人 2003]。[0028]APS是影响年轻和中年个体的获得性凝固性过高的状态。综合症与动脉和静脉血栓形成相关，和在妇女中与反复流产有夫。国际诊断标准需要临床事件的出现，和证明在患者的血液中的自身免疫抗体与天然磷脂反应[Miyakis S，等人]。现在的诊断实验室分析是不同程度的方法学和实践限制的[Wong RC, Favaloro EJ]。如在这个文献中说明“虽然过去和持续的努力，对于主要抗磷脂抗体(aPL)_即抗心磷脂(aCL)-、抗(62糖蛋白1、和狼疮抗凝物(LA)的分析的结果存在显著的变异”，和“然而，由于缺少高质量的公开证据，存在对于专家意见的高度依赖性，并且因此现有的aPL试验和报道的共识指南主要基于证明而不是基于证据”。
[0029]另ー个主要问题是实验室发现与临床表现的相关性不是完全明显。例如，根据数个研究，约15%_17%的具有病毒感染的儿童证明是APS假阳性试验。在最近的报道研究[deGroot]中，世界专家报道>30%的APS样品的误诊断，APS样品由他送给完善的临床实验室。关于假阳性和假阴性结果，也參见[Merriman E等人]、[Aboud M等人]、[Pellegrino NMand Caccavo D]、[Bizzaro N 等人]、[Martorell JR 等人]、[Koike T 等人]、[Rusnak 等人]、[Lakos G and Teodoescu M]、[Moore GW 等人]、[Pengo V 等人]、[de Larranaga G 等人]、[Asherson等人]、[Zhu WF等人]、[Uthman Iff等人]、[Bernard C等人]对于方法学的限制，包括假阳性和假阴性等等。重要的是需要说明的是因为常规使用的实验室试验的这些方法学的限制，当它们结果是阳性吋，国际指南要求分开地重复12周的试验[MiyakisS等人]。
[0030]肝素是用于处理和预防血栓形成的标准的抗凝血剂疗法。肝素诱导的血小板減少和血栓形成(HIT)，是可以在对于肝素敏感的患者中形成的免疫介导的严重并发症。用全剂量的肝素处理的约5%的患者形成HIT。显示HIT的约50%的患者形成血栓形成,一半具有严重的发病率和死亡。诊断HIT具有严重的临床困境。目前，需要快速临床决定以立即停止肝素和开始可选的抗凝血剂疗法，适合于具有HIT的患者[Sheridan D,等人]、[KeltonJG,等人]、[Chong BH.]、[Alving B.]、[Aster RH.]、[Thielmann M 等人]。[0031]基于检测肝素-血小板-因子4种复合物的抗体的现在方法诸如ELISA和凝胶粒子分析(例如，PaGIA)具有某些方法学和实践限制。
[0032]通过这些方法可以检测抗体，然而，在多至30%的用肝素处理的患者仅5%显示临^ HIT [Sheridan D,等人]、[Kelton JG,等人]。另外，这些分析具有>10%范围的假阴性[Alving B.]、[Arepally G,等人，]、[Hirsh J.等人]、[Visentin GP 等人]，它们仅检测肝素血小板4种复合物，它们不是在所有患者中都形成。另外，多至80%的假阳性结果可能在具有自身免疫APS的患者中出现，即，患者在一方面将终生进行不必要治疗，而在另一方面回避了需要的治疗[Pauzner R,等人]。
[0033]功能性血小板聚集分析(HIPA)是复杂的，需要多个正常的供体(通常四个)，具有低的灵敏性[Thielmann M等人]、[Chong BH等人]、[Favoloro EJ等人]和低的重复性。而且，它包括血小板清洗步骤，已知引起血小板激活的操作因此不可避免地混淆分析結果。
[0034]功能、放射活性血清素-释放分析(SRA)认为是金标准，然而，它是不切实际的，和在有限的研究实验室之外是不可用的[Sheridan等人]、[Kelton JG等人]、[Alving B]、[Arepally G等人]、[Visentin GP等人]、[Favoloro EJ等人]。因此,为了克服这些上述限制，我们研发了实际、快速、灵敏和特异性功能流式细胞学方法用于诊断HIT。功能性方法測定了在肝素存在下诱导血小板激活的患者的血清/血小板的容量-类似于金标准放射活性SRA的概念。
[0035]15年前描述了使用流式细胞术的另ー个方法[Tomer A, 1997]。然而，因为已经发现这种方法需要高度的专门技术，它在常规临床实验室中是不可得的。
[0036]血小板的止血功能的缺陷导致流血倾向-这在普通人群中不是不常见的。因此，血小板功能的测试是重要的临床评价。
[0037]浊度聚集血小板功能评价方法是测试血小板功能的经典和最常见的方法，使用了约50年。它是基于悬浮液中血小板的刺激和用磁铁搅拌以形成血小板聚集，与完全的悬浮液相比，它允许更多的光透视。更现代的仪器-虽然不是非常常见-是西门子公司的PFA100，它模拟读数的方法中差别的这种反应。PFA-100将血液样品吸入一次性测试卡中，通过微小的孔径切ロ进入在毛细管末端的生物活性膜。卡的膜涂布胶原和腺苷二磷酸(ADP)或者胶原和肾上腺素，诱导血小板塞形成，其关闭了孔。
[0038]通常应用的方法使用相对高剂量的兴奋剂以实现終点结果，因此不能够测试血小板激活过程的三个阶段，导致最后的聚集，如该方法在此描述那样，这对于血小板功能紊乱的诊断是重要的。
[0039]另外，使用高剂量的刺激物去掉了检测轻度到中度功能紊乱的可能性，诸如在血小板忙存库疾病中出现[BS Coller和DL French], [Shattil SJ等人]，[FitzgeraldR, Pirmohamed M.]。这些方法也不能够检测ー些血小板功能病症，诸如斯科特综合症和其它病症[BS Coller 和 DL French], [Shattil SJ 等人]。
[0040]血小板在正常的止血中起到关键的作用。对于它们功能最重要的是膜糖蛋白(GPs)，它们指定涉及血小板粘附和聚集的关键的配体相互作用，对于正常止血是必要的。
[0041]先天的血小板功能障碍是遗传性流血病症，其可能产生于血小板糖蛋白-受体异常。因此，这些病症与过量流血有夫，特别是从皮肤和粘膜流血。Berard-Soulier综合征和血小板无カ症是血小板-受体缺陷的主要先天性失常[BS Coller和DL French], [ShattilSJ 等人],[Fitzgerald R, Pirmohamed M.]。
[0042]Berard-Soulier综合征产生于GP Ib-1X(CD42)复合物中的缺陷，其起到作为血管假性血友病因子(vWF)的结合位点的功能，它反过来介导血小板连接到内皮下膜的组分，由于损伤暴露于血管壁[BS Coller 和 DL French]、[Nurden A, Nurden P.] > [Harold RRobert and Alice D Ma]、[Shattil SJ 等人]。
[0043]这种综合征也与血小板减小相关。因此，它常常与免疫性血小板减少症(IT)混淆，例如，当与图13-14中示出的源头病人一起出现时，他计划准备不必要的外科手术-脾切除木。在这里需要重点说明的是，像这种的ー些血小板病症有时需要多于一次试验来获得正确的诊断-诸如在现有的情况中排除IT。因此，在这里建议的血小板分析系统仅是用于评估血小板病症的的ー种系统。
[0044]血小板无カ症产生于主要的血小板功能受体GPII/IIIa(⑶41a)的缺陷，其对于纤维蛋白原-介导的血小板聚集是必要的[BS Coller和DL French]、[Shattil SJ等人]、[Fitzgerald R, Pirmohamed M.」。
[0045]阿司匹林抑制花生四烯酸途径酶环氧酶I，C0X-1)，其需要用于在凝固过程中形成血小板前列腺素兴奋剂血栓素A2。
[0046]噻吩并吡啶作用剂特异性和不可逆地抑制ADP受体的P2Y12亚型，其对于血小板激活和聚集是重要的[Shattil SJ等人]。
[0047]目前的临床指南对于以下推荐用血小板抑制剂慢性治疗:所有的冠状动脉疾病(CAD)、周围性血管疾病(PVD)、包括脑循环限制的心脑血管疾病(CVD)的患者，短暂脑缺血发作(TIA)、或中风的患者；眼睛中视网膜血管血栓形成，血管血管形成术(诸如通过导管的冠状动脉扩张-具有或不具有支架)，和具有血管闭塞和血栓形成的风险的其它种类的患者。
[0048]尽管如此，已经发现具有复发性血栓形成的多种患者对于这些作用剂的应答不具有足够的应答，综合征称之为〃阿司匹林抵抗〃 [Fitzgerald R, Pirmohamed M.]、或lopidogrel resistance [Qureshi Z, Hobson AR.」。
[0049]有对于包括仪器和诊断试剂盒的诊断的实际系统的需求。提出的系统应该允许可行性和高度信息化的实验室分析的性能。分析对于最常见的血小板相关的病症应该是高度可靠的和能够提供有用的医疗信息。
[0050]在设计系统中特定的目标是提供測定循环的血小板激活标志物的高度需要的试验，该标志物作为持续、体内血栓形成前活性的指示物。这些试验通过临床凝固实验室中的通常使用的血小板分析方法是不可得的。
[0051]所有提出的分析是对于临床实验室中日常使用的优化、简化、精确和调节的。

【发明内容】

[0052]根据一方面，提供循环血小板的综合分析的系统和方法，用于诊断常规临床实验室中血小板相关的病症。
[0053]该系统包括试剂，以设计用于特定血小板分析的诊断试剂盒的形式；该系统可以进ー步包括专用的、简单和容易使用的仪器，诸如血细胞计数器，适合于进行所述分析。
[0054]分析系统主要用于测试血小板或与血小板反应的自身抗体或同种抗体，在与血小板功能障碍和流血倾向相关的特定和重要的临床状况、和导致血栓形成的高凝固性中。另外，血小板功能容量的测试包括对于兴奋剂和抑制剂的应答、和血小板激活标志物，其作为持续、体内血栓形成前活性的指示物。系统也能够诊断与免疫和抗体介导的病症诸如免疫性血小板减少症相关的特定的医疗状况。
[0055]使用该系统，试验方法特别适合于测试以下的ー种或多种:
[0056]a.体内的血小板激活状态，作为持续血栓形成前活性的标志物(其可以导致血栓形成)，在包括心血管、脑血管和周围血管疾病、糖尿病、癌症和具有血管并发症的怀孕的各种临床状况中。
[0057]b.特定的抗体介导的状况，包括i)肝素诱导的血小板減少，ii)自身-免疫性血小板减少症(ITP)，iii)同种免疫性血小板减少症，例如，新生儿同种免疫性血小板减少症-NAIT，iv)输血后紫癜-PTP，和V)抗磷脂抗体综合征(APS)中的抗血小板磷脂自身抗体的存在。
[0058]c.血小板功能容量:应答各种兴奋剂(激动剂)_定量评价抗血小板药物的抑制作用，在心脏和血管疾病的患者的临床护理中广泛使用，包括阿司匹林和氯吡格雷-定量评价；
[0059]d.先天性血小板功能缺陷诸如Berard-Soulier综合征和血小板无カ症，以及与流血病症(过量流血的倾向)相关的其它缺陷。
[0060]检测方法:ー种基本诊断方法包括进行标准的流式细胞术-优选地使用相对小、专用的仪器。然而，专用方法可以使用检测抗体或蛋白质(例如，膜联蛋白A5)结合的其它技术，诸如化学发光、凝胶颗粒聚集分析和酶联免疫吸附分析(ELISA)/在材料表面或在塑料颗粒上固定抗体或抗原的固相分析。
[0061]检测信号可以表示为荧光、光`、顔色或者颗粒的聚集。
[0062]试验的样品可以是全血或者血小板，例如，血小板富集的血浆(PRP),所有固定和非固定的。
[0063]系统和方法包括以下的分析:
[0064]1.血小板免疫力，包括i)自身免疫性血小板减少症(ITP)，ii)同种-免疫性血小板减少症，例如新生儿-同种免疫性血小板减少症-NAIT，和输血后紫癜-PTP ；
[0065]2.抗血小板磷脂自身抗体的APLA/APS或休斯综合征(抗磷脂抗体综合征)；
[0066]3.HIT (肝素诱导的血小板减少)，用于患者的抗体的容量，在肝素存在下引起血小板激活；
[0067]4.血小板功能-包括标记血小板，表明:i)应答血小板聚集GPIIb/IIIa(⑶41a)的主要血小板功能受体的刺激，ii)来自增强其活性的血小板颗粒的活性介质的血小板释放反应(应答激活)，和iii)促凝血活性的表达，即，凝血酶生成和血栓过程的增强；
[0068]5.血小板功能受体缺陷/异常-例如，血小板无カ症Berard-Soulier综合征，以及其它遗传性血小板功能障碍；
[0069]6.血小板功能抑制-测量抗血小板药物对于血小板功能的抑制作用，例如,检测对于阿司匹林或氯吡格雷的抵抗-定量分析，和
[0070]7.循环中血小板激活标志物，作为持续、体外、血栓前活性的指示物。
[0071]分析特别可应用于具有与血栓形成的高风险相关的患者，包括:[0072]冠状动脉疾病(CAD)诸如心绞痛-稳定或不稳定，急性冠脉综合征(ACS)-或心肌梗塞后(MI);周围血管疾病(PVD)，心脑血管病(CVD)，包括脑循环状况诸如短暂脑缺血发作(TIA)、或中风的患者；糖尿病-其与血管疾病高度相关；妊娠高血压症，包括与血栓形成、胎儿生长限制和胎儿死亡相关的先兆子痫；血栓易形成风险-因素，包括:抗磷脂抗体综合征(APS、APLA)、FV-莱顿突变、FII突变、抗凝血蛋白质缺陷:蛋白质C、蛋白质S和ATIII ;在抗凝血疗法诸如华法林的停止之前和之后的持续血栓前活性，和癌症-用于预测血栓形成和提供预防措施。
[0073]需要重点说明的是，在基因型和表型的临床表现之间可能存在高度的差异，因此需要活性高凝固态的功能測定。
[0074]这些分析的总的目的是临床上能够实现处于风险的患者的识别，和能够使医生根据试验结果提供。
[0075]标志物:分析中的标志物例如适合于通过流式细胞术(FCM)或化学发光测量方法检测。
[0076]可以使用血小板标志物，包括用于以下表达的血小板相关的颗粒:a)促凝血活性-使用膜联蛋白A5探针；血小板反应蛋白、和纤维蛋白原结合；b)释放后反应-例如，使用抗P-选择素(CD62p)、抗CD63 ；c)激活血小板表面上的GPIIb/IIa(CD41a)受体。
[0077]可以形成血小板-单核细胞(PMC)、和血小板-粒细胞复合物，和使用用于诊断的特定单克隆抗体检测。
[0078]化学发光测量的标志物-可以包括以下的标志物:血小板因子4(PF4)&血小板β-血小板球蛋白(P-TG)、C-反应蛋白(CRP)、纤维蛋白D- 二聚体，和激活的血小板和血小板相关的颗粒。
[0079]根据一方面，提供诊断患者的血清或血小板样品中的HIT(肝素诱导的血小板减少)的方法，该方法包括:
[0080]阶段A，包括:
[0081]温育由以下组成的第一PI (患者I)样品:患者的样品的第一等分试样与第一健康个体的PRP，和生理相容缓冲液，条件是缓冲液既不含有钙离子也不含有镁离子；
[0082]温育由以下组成的第一 PIH(使用肝素的患者I)样品:患者的样品的第二等分试样与所述PRP，肝素和缓冲液；
[0083]温育由以下组成的第一 NC(正常对照)样品:健康个体的血浆或血清样品的第一等分试样与所述PRP，和缓冲液；
[0084]温育由以下组成的第一 NCH(使用肝素的正常对照):健康个体的血浆或血清的第二等分试样与所述PRP，肝素和缓冲液；
[0085]阶段B，包括:
[0086]温育由以下组成的第二 PI样品:第一 PI样品的等分试样，由以下组成的第二 PIH样品:第一PIH样品的等分试样，和由以下组成的第二NC样品:第一NC样品的等分试样，和由以下组成的第二 NCH样品:第一 NCH样品的等分试样,姆个具有:第一标记,第一标记能够同时标记肝素激活和非肝素激活血小板，第二标记，第二标记能够标记由肝素激活的血小板，和缓冲液；
[0087]阶段C，包括:[0088]在每个第二样品中，通过测量第一标记测量第二样品中每ー个的类似量的血小板；
[0089]在每个所述类似量的血小板中，通过测量由肝素激活的血小板上的第二标记的量，測量肝素激活的血小板的量；
[0090]计算以下之间的差:来自第二 PIH样品的激活的血小板的量和来自第二 PI样品的激活血小板的量之间，和来自第二 NCH样品的激活血小板的量和来自第二 NC样品的激活血小板的量之间，和
[0091]比较所述第二 PIH和第二 PI样品的所述差，和所述第二 NCH和所述第二 NC样品的所述差，
[0092]其中当所述第二 PIH和第二 PI样品的所述差显著大于所述第二 NCH和所述第二NC样品的所述差时，患者的样品中诊断为HIT。
[0093]选择所述第二 PIH和第二 PI样品的所述差是比所述NCH和所述第二 NC样品的所述差显著大的，例如，大至少2.5倍。
[0094]第一标记例如是血小板受体GPIIb/IIIa的标记。
[0095]在一些实施方式中，第二标记是由肝素激活的血小板表达的P-选择素⑶62p的荧光标记的单克隆抗体，该方法包括通过结合到激活血小板的第二标记测量荧光的強度。
[0096]肝素激活的血 小板的量每个可以通过每个类似量的总血小板群的所述第二标记平均总荧光測量。
[0097]在一些实施方式中，方法进ー步包括:
[0098]通过设定标志物在2.5%(正态分布的2SD)的类似量的NC的荧光测量的高-CD62p-荧光端上，计算激活血小板％ ；
[0099]在所述高-⑶62p荧光端，计算PIH中激活血小板％和PI中激活血小板％之间的读数差，和NCH中激活血小板％和NC中激活血小板之间的读数差,和
[0100]比较PIH和PI与NCH和NC样品的所述差，其中阳性结果是PIH和PI的差显著大于NCH和NC差。
[0101]PIH和PI的差例如比NCH和NC差大超过2.5倍。
[0102]在优选的实施方式中，血浆或血清样品不多于IOiiし
[0103]阶段B优选地进ー步包括:温育由以下组成的TRAP样品:TRAP、第一标记、第二标记、和缓冲液，和阶段C进ー步包括測量TRAP样品中的激活血小板的量。
[0104]在一些实施方式中，阶段A可以进ー步包括:
[0105]温育由以下组成的第一 PC(阳性对照)样品:具有HIT的个体的血浆或血清样品与的第一等分试样与所述PRP，和缓冲液；
[0106]温育由以下组成的第一 PCH样品:具有HIT的个体的血浆或血清样品的第一等分试样与肝素，所述PRP，和缓冲液；
[0107]和阶段B进ー步包括:
[0108]温育由以下组成的第二 PC样品--第一 PC样品的等分试样，和由以下组成的第二PCH样品:第一 PCH样品的等分试样,姆个具有:第一标记,第二标记,和缓冲液；
[0109]和阶段C进ー步包括:
[0110]计算第二 PCH样品中激活血小板％和第二 PC样品中激活血小板％之间的差别，和[0111]比较所述第二 PIH和第二 PI样品的所述差与所述第二 PCH和所述第二 PC样品的所述差，
[0112]其中当所述第二 PIH样品和第二 PI样品的所述差类似于所述第二 NCH和所述第二 NC样品的所述差时，患者的样品中进ー步诊断为HIT。
[0113]阶段A中的温育可以是约I小时和阶段B中的温育可以是约15分钟。
[0114]第一 PIH和NCH样品中的肝素的浓度典型地为0.1和0.5IU/mL之间。
[0115]优选地，肝素的浓度为约0.3IU/mL。
[0116]优选地，缓冲液没有钙和镁的PBS。
[0117]在一些实施方式中,第一标记是突光标记的单克隆抗体抗血小板CD41a。
[0118]根据另ー方面，提供包括以下方法中的至少ー个的方法在测定患者的血小板相关的状况中使用:
[0119]如上述诊断HIT;
[0120]患者的血清或血楽;样品中APS诊断，APS诊断包括:
[0121]从不具有APS的个体的血液样品中制备血小板悬浮液；
[0122]通过暴露血小板中膜磷脂，处理来自不具有APS的个体的血小板；
[0123]用所述处理的血小板温育患者的样品，以得到具有暴露的正常血小板的患者的样品的悬浮液(SPEP)；
[0124]纯化未标记的膜联蛋白`；
[0125]在pH=9.2，将过量的FITC加入到纯化的膜联蛋白，形成高度标记的膜联蛋白；
[0126]纯化高度标记的膜联蛋白；
[0127]用所述SPEP温育纯化高度标记的膜联蛋白；
[0128]在用膜联蛋白温育的SPEP的子样品中，測定子样品中结合到血小板的高度标记的膜联蛋白的量，由此低比例表明所述样品中的APS ；
[0129]ITP (免疫性血小板减少症)诊断样品，ITP诊断包括:
[0130]制备:
[0131]A)患者的抗体:
[0132]将第一表面用MoAb抗血小板特异性受体覆盖；随后,用来自正常血小板的溶胞产物温育覆盖的第一表面；
[0133]随后，用患者的样品等分试样温育覆盖的第一表面和溶胞产物；
[0134]随后，加入人免疫球蛋白的第二荧光标记的Ab，或:
[0135]B)患者的抗体-血小板特异性抗原复合物:
[0136]用MoAb抗-血小板特异性抗体覆盖第一表面；随后,用来自患者的血小板的溶胞
产物温育覆盖的第一表面；
[0137]随后，加入人免疫球蛋白的第二荧光标记的Ab ；
[0138]C)制备參照:
[0139]用MoAb抗血小板特异性受体覆盖第二表面；
[0140]随后，用来自正常血小板的溶胞产物覆盖第二表面；
[0141]随后，用正常的血清或血浆温育覆盖第二表面和溶胞产物；
[0142]随后加入人免疫球蛋白的第二荧光标记的AbjP[0143]D)比较吸附到所述温育第一表面上的第二标记的抗体的第一定量与吸附到所
[0144]述温育第二表面上的第二标记抗体的第二定量，其中第一定量显著地多于第
[0145]二定量表明所述样品中的ITP ;
[0146]诊断样品的血小板功能，该方法包括:
[0147]A)评估血小板刺激: [0148]I)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每个用血小板糖蛋白的两个标记的MoAb，以提供患者的标记血小板和正常个体的血小板，第一所述标记的MoAb具有第一带中的測量，和第二所述标记的MoAb具有第二带中的測量；
[0149]2)随后，将ADP或TRAP中每ー个加入到所述样品，以提供患者和正常个体的刺激标记的血小板；
[0150]3)随后，通过在所述第一带中或所述第二带中测量识别所述样品中的标记血小板；
[0151]4)随后，測量患者的所述识别的标记血小板和正常个体的所述识别的标记血小板，其中当标记的血小板通过第一带识别时，所述识别的标记血小板的测量是在所述第二带中，当标记的血小板通过第二带识别时，所述识别的标记血小板的测量是在所述第一帯中；
[0152]5)其中所述患者的所述识别的标记的血小板的測量等于或大于平均数+2标准差(2SD)，正常个体的所述标记血小板的所述测量表明患者的所述样品血小板激活；
[0153]B)评价血小板促凝固:
[0154]I)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每个用血小板糖蛋白标记的MoAb和膜联蛋白V ；
[0155]2)随后，用血小板离子载体温育每个所述样品；
[0156]3)随后，通过测量血小板糖蛋白的标记的MoAb，识别所述样品中类似量的标记血小板；
[0157]4)随后，測量在所述类似量的血小板上的膜联蛋白V的荧光；
[0158]5)其中患者的血小板的膜联蛋白V荧光等于或大于平均数+2个标准偏差(2SD)，正常个体的血小板的膜联蛋白V荧光表明患者的所述样品中血小板促凝固；
[0159]所述样品中的Berard-Soulier综合征诊断，诊断包括:
[0160]I)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每ー个用排除⑶42的血小板特异糖蛋白的第一标记MoAb，和用⑶42的第二标记MoAb ；
[0161]2)随后，通过测量第一标记MoAb识别所述样品中的标记血小板，
[0162]3)随后，由患者的所述识别的标记血小板測量所述第二 MoAb和由正常个体的所述识别的标记血小板測量所述第二 MoAb，
[0163]其中患者的亲戚的所述识别的标记的血小板的所述第二 MoAb的测量比正常的小，但是比患者大，表明携帯者状态；
[0164]所述样品中的血小板无カ症综合征诊断，该诊断包括:
[0165]I)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每个用排除⑶41a的血小板糖蛋白的标记MoAb，和用CD41a的MoAb ；
[0166]2)随后，通过测量排除⑶41a的血小板糖蛋白的MoAb识别所述样品中的标记的血小板，
[0167]3)随后，測量患者的所述识别的标记血小板的⑶41a的MoAb和正常个体的所述识别标记血小板的⑶41a的MoAb，
[0168]4)其中⑶41a的MoAb的第一测量等于或小于所述标记的血小板的所述第二荧光的⑶41a的MoAb的测量的平均数_2个标准偏差(2SD)，表明患者的所述样品中的血小板无力症综合征，以及在表明综合征和表明正常个体之间中的第一測量表明血小板无カ症携帯者；
[0169]所述样品的药物抑制效果诊断，诊断包括:
[0170]A)
[0171]I)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每个用血小板糖蛋白⑶41a或CD61、CD62p 和激活 CD41a 的标记 MoAb ；
[0172]2)随后，用选自以下的一种或多种的兴奋剂温育所述样品:ADP、花生四烯酸和TRAP ；
[0173]3)通过测量血小板糖蛋白⑶41a的MoAb，识别所述样品中的标记血小板；
[0174]4)随后测量血小板糖蛋白⑶62p和患者的所述识别的标记血小板的激活⑶41a以及正常个体的所述识别标记的血小板，
[0175]5)中患者的血小板糖蛋白⑶62p的MoAb的测量等于或小于所述正常个体的血小板糖蛋白CD62p的MoAb的测量的平均数-2标准偏差(2SD)測量，或者患者的血小板糖蛋白激活⑶41a的MoAb的测量等于或小于所述正常个体的血小板糖蛋白激活⑶41a的MoAb的測量，表明患者的所述样品中的药物`抑制效果；
[0176]B).当在血小板功能诊断中，测定评估血小板促凝固，其中血小板用钙离子载体刺激，然后用标记的膜联蛋白A5温育；
[0177]測定循环血小板或血小板相关颗粒激活标记，作为持续、实时体内、血栓前活性的指示物，包括:
[0178]I)用ー个或多个标记荧光温育患者和正常对照血液的等分试样或PRP样品；
[0179]血小板和血小板相关颗粒的免疫检测的受体特异性MoAb，受体特异性MoAb，排除抗激活CD41a(GPIIb/IIIA)抗体、抗-P-选择素CD62p抗体的受体特异性MoAb ；
[0180]抗激活CD41a(GPIIb/IIIA)抗体；
[0181 ] 抗-P-选择素CD62p抗体；
[0182]血小板阴离子-磷脂的膜联蛋白A5蛋白用于检测血小板促凝血活性；
[0183]2)随后在室温温育15-30分钟，用缓冲液稀释所述样品和分析，
[0184]其中患者的样品的信号水平等于或大于正常的平均数+2个标准差表明循环血小板或血小板相关颗粒的激活。
[0185]根据还另一方面，提供包括用于进行上述HIT诊断的试剂盒的系统。
[0186]根据另一方面，提供包括进行上述一种或多种诊断的试剂盒的系统。
【专利附图】

【附图说明】
[0187]为了更好理解本发明和显示他如何可以实现血小板相关病症的诊断的效果，现在參照附图，仅举例说明。[0188]现在具体详细地參照附图，需要强调的是示出的细节是只是举例来说明和为了本发明的优选实施方式的说明性讨论的目的，并且为了提供相信是本发明的原理和概念方面的最有用和容易理解的描述而提出。在这点上，除了本发明必要的基本理解，并未试图更详细地显示本发明的结构细节；參照附图的描述使得本领域技术人员在实践中可以以数种形式如何来具体化。在附图中:
[0189]图1.測定血小板特异受体的循环自身抗体和同种抗体的方法。聚苯乙烯涂布针对血小板特异糖蛋白的单克隆抗体。然后，特异糖蛋白从正常的人血小板提取和固定在微珠的表面。患者血清或血浆用糖蛋白涂布的珠子温育。然后，洗涤珠子，用第二荧光标记的抗人免疫球蛋白温育，和分析结合抗体的水平，与正常对照样品比较。
[0190]图2.血小板特异糖蛋白的小鼠单克隆抗体结合到聚苯乙烯微珠，如上述。在这个对照分析中，与用抗人抗体温育的对照样品相比，用抗小鼠抗体显示高荧光水平。
[0191]图3.测试ITP患者的实施例結果。患者的血清或血浆育固定在微珠上的血小板CD41a(GPIIb/IIIa)反应。特异性是高的，抗体与没有其它血小板受体糖蛋白反应。
[0192]图4.具有ITP的不同患者的血清或血浆与固定在微珠上固定的血小板CD42b (GPIb)反应的示例性結果。特异性是高的，抗体与没有其它血小板受体糖蛋白反应。
[0193]图5.測定血小板特异受体的血小板结合的自身抗体和同种抗体的方法的示意图。微珠涂布血小板特异糖蛋白的单克隆抗体。然后从患者的血小板提取体内形成的抗体-血小板-抗原复合物和固定在微珠的表面上。然后洗涤珠子，用第二荧光标记的抗人免疫球蛋白温育，和与正常对照血小板样品比较，分析结合的人抗体的水平。
[0194]图6.由具有ITP的患者的血小板上体内形成的抗体-抗原复合物的分析，显示结合到血小板⑶41a(GPIIb/IIIa)复合物的自身抗体。与正常对照样品相比，显示高水平的抗体结合。FLl表不突光I。·
[0195]图7.血小板特异性受体的循环同种抗体的分析。来自具有输血后紫癜-PTP的患者的血清或血浆与血小板⑶41a(GPIIb/IIIa)复合物和⑶61 (GPIIIa)糖蛋白亚单元反应，CD61 (GPIIIa)糖蛋白亚单元是典型的PTP。特异性是高的，没有抗体与其它血小板受体糖蛋白反应。.[0196]图8.新生儿同种免疫性血小板减少症-NAIT中的循环同种抗体的分析:具有NAIT的孕妇显示她的血清或血浆对小孩或丈夫人-血小板-抗原Ia(HPA-1a)等位基因的反应。孕妇是HPA-1b等位基因的纯合体。与正常对照相比，显示非常高的免疫荧光信号。
[0197]图9显示具有抗-磷脂-抗体综合征-APS(Pt)的患者的血清或血浆对于膜联蛋白A5结合到血小板膜磷脂的抑制作用。对于来自正常对照(NC)的血浆没有观察到抑制作用。通过流式细胞术进行分析。
[0198]图10显示来自具有APS的患者的血清或血浆的流式细胞术检测。与正常对照相比，观察到患者的样品的膜联蛋白A5结合到血小板磷脂的显著减小，与APS的诊断一致。
[0199]图11描述与正常对照(NC)相比，在APS患者(Pt)中减少的膜联蛋白A5结合到血小板磷脂。在患者和健康对照之间显示高的分辨率。
[0200]图12显示具有肝素诱导的血小板減少(HIT)的患者的样品的测试。血清/血浆样品在肝素不存在(0.0)(上图)和存在(0.3U/mL)(下图)下用正常血小板温育。
[0201]A-正常对照；B-阳性对照-HIT对照；C_临床上疑为HIT的患者。患者的样品(C)显示激活血小板的显著增加，从没有肝素的1.4%到具有肝素的24.7%。与正常对照相比，在阳性对照和测试的患者中都显示高百分比的激活血小板(方框的右上方象限)。
[0202]图13显示通过流式细胞术的Bernard-Soulier综合征的诊断。患者的血液血小板显示正常的GPIIb/IIIa的表达，但是GPIb的缺陷表达，其是Bernard-Soulier病的特征。 患者的小孩显示GPIb的中间表达，表明携带者状态。
[0203]图14显示Bernard-Soulier综合征的流式细胞术测定的精确性,具有FITC-标记和1251-标记的抗-GPIb结合到血小板之间具有高度相关性。识别三组，具有GPIb的严重缺陷(坐下角)的患者，具有GPIb的中间表达的三个亲戚(图的中间)代表携带者状态， 和正常对照(右上)显示GPIb的高度表达。
[0204]图15显示通过循环血小板增加的p-选择素(⑶62p)的增加的表达，表明与健康的正常对照(NC)相比，在血栓形成风险(Pt)中体内激活状态。P-选择素是在血小板上表达的颗粒糖蛋白，然后激活和释放反应。因此，它是体内血栓前活性的标志物。
[0205]图16显示在血栓形成的高度风险的患者中，通过膜联蛋白A5结合检测的血小板促凝血活性的表达，显示激活血小板群(空箭头)和高度激活血小板颗粒(黑色箭头)，表明体内高度血小板激活状态与患者的血液中的持续血栓前活性一致。
【具体实施方式】[0206]在详细地说明本发明的至少一个实施方式之前，应该理解本发明没有必要限制其应用到在以下说明书中说明的细节或通过实施例示例的细节。本发明能够能够是其它实施方式或者能够以各种方式实施或实践。
[0207]术语“包括”("comprises","comprising", "includes", "including")和“具有”("having")连同它们的变化一起意味着“包括但不限于”。
[0208]术语“由......组成”具有与“包括但限制于”具有相同的含义。
[0209]术语“基本由......组成”意味着组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤
和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分不实质地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖性特征。
[0210]如在本文使用，单数形式“一”(〃a〃、〃an〃和〃the〃)包括复数指示，除非在上下文清楚地以其它方式清楚地指示。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
[0211]在整个本申请中，本发明的各种实施方式可以范围格式呈现。应该理解以范围格式的描述仅是为了方便和简洁，和不应该解释为本发明范围的不变的限制。因此，范围的描述应该被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及在那个范围内的单独数值。
[0212]意识到本发明的某些特征，它们在分开的实施方式的情况中清楚地进行描述，也可以在单个实施方式中组合地进行提供。相反地，本发明的各个特征，它们在单个实施方式的情况中简洁地描述，也可以分开地提供或者以任何的子组合提供或以本发明的任何其它描述的实施方式如其所应地提供。在各种实施方式的情况中描述的某些特征不应该认为是那些实施方式的基本特征，除非该实施方式没有那些元素是不工作的。
[0213]在以下描述的各个图的讨论中，类似数字指类似部件。附图总体上是不成比例的。 为了清除，非基本元素从一些附图中省略。[0214]在此以下描述的系统、试剂盒和方法有助于诊断血小板相关的医疗状况。根据一方面，提供包括试验板的系统，其可以允许进行数个分析。然而，所有这些分析集中于测试与血小板相关凝固病症的对象。分析的总的目的是能够识别具有流血或血栓形成倾向的患者，和允许基于理性的合适医疗介入。
[0215]需要重要说明的是根据一方面，系统代表一个单元，其设计提供可能起因于各种原因的血小板状况的临床应答，因此需要多于一次测试以得到正确诊断。例如，低的血小板计数-血小板减少的状态可能需要免疫性血小板减少症-1T/ITP、APS (抗磷脂综合征)的分析，如果患者也暴露于肝素，由于血小板减少、肝素-诱导的血小板减少-HIT，免疫性血小板减少症-1T/ITP、APS可能是复杂的，和Bernard-Soulier病-也与血小板减小相关的血小板功能缺陷。因此，通过排除混杂状态，可以做出正确的诊断，节省患者不必要或不合适的治疗或外科手术，如例如，有时Benard-SouI ier病患者上所发生,他们错误地诊断为 ITP和给出脾切除术。例如，这是因为缺少合适的实验室实验以排除ITP，诸如以下描述，或者缺少合适的设施进行一些实验，例如，非血液实验室不配备进行多个目前已知的实验。
[0216]根据一方面，提供包括专用仪器和一组试剂的系统，一组试剂以特定诊断试剂盒的形式。以下描述示例性流式细胞仪。可选地，可以调节一些商业可用的仪器-诸如例如通过修改软件-完成期望的实验。
[0217]提供基于检测血小板抗体-抗原反应的测试方法。该方法可以都使用标准的荧光流式细胞术进行，其是非常常见的。然而，在一些实施方式中，可以使用检测这种反应的其它方法。一种方法是化学发光，而且固相型分析、ELISA、凝胶颗粒聚集分析和其它方法可能是合适的。
[0218]测试方法实施方式包括样品制备，使用血液或血小板的新鲜样品，但是可选地，在固定制剂上可以进行所有的分析。
[0219]典型地，以下描述的所有诊断试剂盒和方法使用特定的抗体-抗CD41a -作为血小板一般检测的最佳探针。然而，根据特定实验，检测血小板的其它探针诸如抗-CD42或抗-⑶61也可以代替或另外地使用。
[0220]以下是诊断血小板相关状况的示例性方法和试剂盒的描述。
[0221 ] 1.血小板免疮件-1T或ITP (血小板免疮件血小板减小症I
[0222]为了克服现在可用方法的局限和促进IT的诊断，我们研发了可靠、可行、快速、敏感和特异性流式细胞术方法，该方法使用微珠技术用于测定与血小板特异性糖蛋白受体反应或针对血小板特异性糖蛋白受体的循环自身抗体。该方法可应用于自身免疫和同种免疫的临床症状。
[0223]总之，该方法允许直接和积极识别具有IT的患者-区别IT与其它引起血小板减小的混淆状况，混淆状况诸如减小的血小板产生和APS(其可能与血小板减小相关，但是具有血栓形成的趋势，而不是如在IT中的流血)。直接和可靠地分析将能够使医生直接确认诊断和提供具有IT患者、对于他/她的状况的合适医学治疗。
[0224]通用的技术:
[0225]已经研发了用于测试患者的血浆中血小板-抗原-特异性自身抗体和同种抗体的方法和试剂，以及/或血小板特异性受体:体内形成的抗体复合物，使用荧光微珠分析。
[0226]该方法可应用于使用荧光微珠的任何技术，通过流式细胞术或通过直接的荧光微孔读数。方法也可以使用化学发光的微颗粒、或者显色(如在ELISA中)、或凝胶-颗粒聚集技术(例如用抗原涂布和在抗体存在下聚集的凝胶颗粒，如在血库中通常使用)进行应用，以及抗体或血小板的固定:在固体表面上的抗体复合物。
[0227]根据需要，该方法适合于测试单个样品以及多个样品，和适合于检测与单个血小板糖蛋白反应的抗体，或者通过多重分析检测与多个血小板糖蛋白相互作用的抗体。
[0228]可以提供本技术的产品到临床实验室，以诊断试剂盒的形式，任选地与说明书-方案-用于进行测试，以帮助诊断临床重要的病症的诊断。
[0229]方法1:
[0230]根据一些实施方式，提供测定自身免疫性血小板减少症(ITP)中血小板特异受体的循环自身抗体的试剂盒和方法。该方法基于检测与塑料(或任何合适聚合物)微珠表面上固定(粘附)的血小板特异性糖蛋白反应的患者自身抗体。微珠首先涂布针对血小板特异性糖蛋白的单克隆抗体，然后用提取的血小板糖蛋白温育-如以下完整地说明。
[0231]方法使用患者血小板排除，患者血小板在严重的血小板减少中可能难于得到。
[0232]靶血小板糖蛋白包括但不限制于CD41a (GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、 CD61(GPIIIa)、CD41b(GPIIb)、CD42a(GPIX)和 CD51(aV)。
[0233]材料和方法
[0234]聚苯乙烯珠子(15Um 直径，Polysciences, Inc.400Val Iey Road, Warrington, PA18976, USA)在 4°C和 pH=9.2 缓冲液，用 GPIIb/IIIa(20 u g/mL)终浓度的单克隆抗体(P2克隆，Immunotech, West Brook, ME, USA)通过轻轻混合涂布过夜。珠子然后用PBS缓冲液洗涤。
[0235]正常血小板样品 用0.5%Triton X-100溶解和在1200xg离心5分钟。所有的步骤
在室温进行。
[0236]对于常规分析，2500个抗体涂布的珠子用血小板溶胞产物温育2h，洗涤和在4°C 贮存直到分析。
[0237]对于分析，涂布的珠子用患者的血清或血浆在室温轻轻摇动温育2小时，然后在 PBS+2.5%BSA中洗涤和用荧光素标记的多克隆山羊抗人免疫球蛋白抗体(20ii g/mL)温育I 小时；Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)。
[0238]在温育之后，珠子悬浮液用PBS稀释和通过流式细胞术分析(图1_4、7)。
[0239]流式细胞分析:珠子通过光散射进行最初识别和电控。每个样品收集一千个事件。 使用具有类似荧光素:蛋白质比的山羊抗-兔抗体(载体)测量非特异抗体结合。阴性对照由来自健康个体得到的正常血清组成。测试珠子的平均荧光使用标准的流式细胞仪软件测定。使用涂布的微珠的整个分析需要的时间是约4h(与研究MIPA方法通常需要3天完成相比)。多至12个分析可以在相同时间方便地运行。
[0240]统计分析:使用非参数Kruskal -Wallis检验，进行患者的样品上完成的实验的结果和在正常个体的样品上完成的实验的结果之间的比较。同时测试个体荧光水平和三个正常对照的荧光。患者样品的荧光等于或大于正常样品的平均荧光+2个标准偏差(2SD) 认为是阳性的。当已经建立正常范围之后，可以仅使用一个正常样品用于对照。
[0241 ] 研究具有ITP的临床诊断的18个患者。14个患者显示⑶41a的自身抗体 (平均荧光320±137vs.10个正常个体中的7±2)，和三个患者显示⑶42b的循环抗体(323±147vs.正常个体中的10±3)。分析的特异性是高的，没有检测到血清和其它血小板受体的交叉反应。参见图1、2、3、4。
[0242]通过受试者工作特征(ROC)图方式评估分析的区别性准确性，也就是，在来自ITP 患者的有差别的正常个体中敏感性的图vs.(1-特异性)，当分析的阈值在各处可能值变化时。在ROC曲线下的面积(AUC)是范围从0.5 (没有区别)到1.0 (完全区别)的准确性指数。结果显示85%的灵敏性截断，诊断的特异性是94%。准确性和灵敏性测量代表方法和不应该在每个实验室中必须分开测定。
[0243]方法2:
[0244]研发了检测ITP中的血小板-抗原-特异性血小板-结合自身抗体复合物的第二种技术。在体内形成的血小板特异性抗体-抗原复合物分离和固定在涂布在微珠之上的抗-血小板糖蛋白-特异性单克隆抗体。
[0245]分析方案的进一步描述
[0246]本实施方式提供在体内形成的抗体-血小板抗原复合物的分析。
[0247]聚苯乙烯珠子(15Um 直径；Polysciences, Inc.400Val Iey Road, Warrington, PA18976, USA)用终浓度的 GPIIb/IIIa 单克隆抗体(20 u g/mL)在 4°C温育 2 小时；P2clone, Immunotech, West Brook, ME, USA)。珠子然后用 PBS 缓冲液洗漆。
[0248]患者的血小板样品用0.5%Triton X-100溶解和1200xg离心5分钟。所有的步骤在室温进行。对于常规分析，2500抗体涂布的珠子用患者的血小板溶胞产物温育2小时，洗涤和然后用荧光素标记的多克隆山羊抗人 免疫球蛋白抗体(20 ii g/mL)温育I小时；Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)。
[0249]然后，珠子用PBS悬浮和通过流式细胞术分析。使用具有类似荧光素:蛋白质比的山羊抗兔抗体(载体)测量非特异抗体结合。阴性对照由从健康个体得到的正常血小板溶胞产物组成。使用单克隆抗体涂布的珠子整个分析需要的时间是大约4小时。同时可以方便地运行多至12个分析。
[0250]流式细胞分析:珠子通过光散射进行最初识别和电控。每个样品收集一千个事件。 使用标准的流式细胞仪软件测定测试珠子的平均荧光(图5、6、7、8)。如上描述进行统计分析。在一些实施方式中，提供检测患者的循环自身抗体的方法，抗原是结合的，然后与患者的血清接触。在其它实施方式中，提供包括分离体内形成的Ab-抗原复合物的方法，其中首先复合物自身被分离-需要患者的血小板-不是血清。在严重ITP中，难于得到用于这种分析的足够的血小板，反而，方法首先需要患者的血清。
[0251]方法3:
[0252]研发了用于测定针对血小板特异性受体的循环同种抗体的第三种技术，即，抗体针对在患者的自身血小板上不存在的外源性血小板抗原形成(类似于在暴露于Rh-阳性红细胞的Rh-阴性女性中形成抗-Rh抗体)。该技术基于检测与、涂布针对血小板特异性糖蛋白的单克隆抗体的微珠反应、男性生成的同种抗体。血小板糖蛋白然后固定在微珠表面上。
[0253]在临床试验中，来自具有与输血后紫癒(PTP) —致的临床表现的患者的样品显不抗体与⑶41复合物(GPIIb/IIIa)和⑶61 (GPIIIa)亚单元都反应。参见图7，平均荧光 420±59vs.正常个体中的18±9)。他们的同种抗体针对在GPIIIa亚单元上的表位，这些自然形成具有GPIIb的复合物。[0254]具有新生儿同种免疫性血小板减少症(NAIT)的孕妇，一种涉及生成她胎儿血小板-糖蛋白的母亲同种抗体的病症,其导致胎儿血小板减小和流血-包括内部颅内出血。该技术对于这种严重的病症显示高度的灵敏性，如在图8中示出。
[0255]实践的方案如在方法I中描述。
[0256]方法4:
[0257]研发了检测同种免疫性血小板减少症中抗原-特异性血小板结合的患者的同种抗体的第四种技术。分离血小板特异性抗体-抗原复合物和固定在涂布糖蛋白特异性单克隆抗体的微珠上。
[0258]在具有PTP和NAIT的成人患者中进行体内血小板结合抗体的抗原特异性分析，显示患者的样品超过正常个体的5-7倍的荧光强度增加，类似于在图6中示出的结果。
[0259]实践的方案如在方法2中描述。
[0260]研究临床诊断为ITP的十八个患者。十四个患者显示⑶41a的自身抗体(平均荧光320±137vs.正常个体中7±2)，和三个患者显示⑶42b的循环抗体(323±147vs.正常个体中10±3)。分析的特异性是高的，没有检测到与其他血小板受体的血清的交叉反应。 参见图1、2、3和4。
[0261]结论，荧光免疫珠分析是实际的，具有相对高的灵敏性和特异性，和对于常规诊断可以是临床有用的，和对于具有血小板特异性糖蛋白的抗体的患者的随访，针对如在TP中的自身抗原的自身抗体，或针对如在NAIT中的外源性抗原的同种抗体。
[0262]该分析可应用于各种免疫检测方法，包括荧光流式细胞术和化学发光微珠分析、 酶联免疫吸附分析(ELISA)，也知道为酶免疫分析(EIA)，或者颜色微珠型的分析。它可以包括单个或多个类型的随着尺寸变化的微珠/微球(多重分析)、内部荧光标志物(例如， Quantiplex?珠子；Luminex’ s xMAP Technology,等等)、颜色标志物或与磁性材料有关的标志物。
[0263]2.APLA/APS或休斯综合征(抗磷脂抗体综合征)`[0264]为了克服诊断APS的现在可用方法的诊断限制，我们研发了测定抗磷脂抗体综合征(APS)中针对血小板磷脂的自身抗体的快速、灵敏和特异的流式细胞分析。该分析是病理生理相关的，因为循环血小板是血管闭塞血栓形成事件中的主要成分。该方法基于APS 患者的自身抗体与血小板膜磷脂的明确的结合。这种结合通过用试剂荧光标记的膜联蛋白 A5进一步温育检测，荧光标记的膜联蛋白A5与在血小板磷脂上剩下的自由位点相互作用。
[0265]我们进一步假设由于这种天然试剂具有抗凝血剂活性(减少血小板表面上的有效的凝血剂凝血酶的生成)，通过患者的抗磷脂自身抗体占据其血小板结合位点产生增强的凝血酶生成，因此增加APS中临床的血栓形成的风险。
[0266]该方法是实际和快速的，使用容易得到的试剂，和包含标准设备。该分析对于单个和多个样品是不昂贵和划算的。从得到血液样品在2个小时内提供结果，由此支持临床决定做出和患者管理。
[0267]总的说来，分析是高度特异的，允许病理生理相关的抗磷脂自身抗体的可靠地诊断。
[0268]因此，避免假阳性结果，例如从具有通常使用的抗心磷脂抗体实验中得到，国际指南要求重复，在12周后排除偶发的传染病，其可以引起假阳性结果。[0269]目前分析的结果允许可靠实时的诊断和没有这种严重状况的延迟，然后正确的医
疗管理。
[0270]需要重点说明的是，这种特别的技术已经随着修改和改变演进地发展，包括但不限制于:1)特定、稳定和可靠诊断血小板产品的制备，其适合于在APS的诊断的常规临床实验室中常规使用，和2)用高荧光素标记技术的截短的人重组蛋白质膜联蛋白A5的特定的制备，用于生产涉及血小板、直径1-2 U m的小颗粒的分析的灵敏试剂。
[0271]以下提供用于进行诊断分析的诊断试剂盒实施方式和相关方法实施方式的描述。
[0272]分析的原则:
[0273]-血小板试剂的制备:
[0274]对于常规的临床实验室使用，制备稳定、可靠和方便地血小板试剂。稳定的制剂避免用于实验的新鲜血小板富集的血浆-PRP的需求，和增强其重复性。血小板悬浮液用缓冲液洗涤和用试剂Ca2+离子载体A23187(例如，Sigma)5iiM最终浓度温育15分钟，为了血小板膜磷脂的暴露。然而，血小板悬浮液用1%多聚甲醛在室温温育I小时，和用缓冲液洗涤。 血小板制剂最后冻干，即，冷冻干燥，然后在合适容器中包装用于运输和长期贮存。多聚甲醛随后冻干稳定悬浮液。对于分析，血小板重新悬浮在缓冲液中，到大约250，000/u L的浓度，使用等分试样用于分析，和在冰箱中4°C贮存制剂用于将来使用。
[0275]抗凝血剂低分子量肝素的制备
[0276]肝素:制备浓度为100mg/mL的低分子量肝素钠-Enoxaparin (Sanof1- Aventis Inc, France)。(有效期-非常长>3年)。
[0277]最终10mg/mL的储备液:50 u L的肝素加入450PBS缓冲液=500 y L的10mg/mL。
·[0278]最终2.0mg/mL的工作液:100 ii L的肝素储备液加入到400 U L缓冲液=500 ii L的
2.0mg/mLo
[0279]5u L最终浓度0.lmg/mL的肝素的工作液加入到100 U L终体积的反应混合物。
[0280]-标记的重组人膜联蛋白A5蛋白的制备
[0281]天然形式的蛋白质从Koa Laboratories, Tokyo, Japan得到。为了得到适合于测试小颗粒的血小板(1-2微米直径)的灵敏试剂，进行与荧光素-异硫氰酸酯分子的高度结合。为了得到具有标记与膜联蛋白高比例的标记，例如蛋白质:荧光素比例为约1:6，用于这个步骤的技术如下:在无菌水中制备所有的溶液和试剂。
[0282]材料:
[0283]-0.5M碳酸盐10X缓冲液如下:储备液:
[0284]a.5.3% 碳酸钠。制备 100ml
[0285]b.4.2% 碳酸氢钠，pH 约 8.0。制备 100ml。
[0286]将58ml的(a)与100ml的(b)混合；pH将是约9.5。用醋酸调节pH至9.2。
[0287]工作透析缓冲液:
[0288]用无菌H2Ol = IO稀释10X缓冲液和核对pH;如果必要，调节至pH9.2。制备至少 500ml-1000ml。
[0289]FITC溶液:(新鲜制备)。在DMSO中制备10mg/ml。从冰箱中取出和在称出之前回到室温。
[0290]-蛋白质浓度应该是l_2mg/ml开始。需要400的最小体积以从柱中得到0.5-lmg。为了得到蛋白质的准确浓度(如果未知)，在0D280nm读出洗脱液浓度，除以1.4， 这将给你抗体的蛋白质浓度。
[0291]-用交联葡聚糖凝胶装填柱子,例如F1D-1OSephadexG-25柱，Pharmacia。
[0292]-PBS w/o Ca2+.[0293]-PBS 中 10% 叠氮钠。
[0294]标记的方法:
[0295]第一天:膜联蛋白抗体必须是没有叠氮钠(如果存在)和在PH9.2用于荧光素化 (f Iuoresceination)工作。纯化抗体,例如,通过透析:使用蛋白质纯化盒，诸如最好结果的Peirce的Slide-A-Lyzer (根据制造商的用法说明)。放置在透析缓冲液中,透析至少4 小时，优选地为过夜。
[0296]第二天:将抗体非常轻地从管中取出和非常仔细地测量体积。通过取50 U I等分试样在Icm比色杯中读取在0D280的吸收。存在的抗体的量是:
[0297]mg/ml 抗体=(0D280/1.4) x (ml 抗体)
[0298]如果抗体是2-10mg/ml，加入20 ii g (2 iU)的FITC结合物。
[0299]如果抗体<2mg/ml，加入 IOOii g(10iil)的 FITC 结合物。
[0300]在37°C温育60分钟，同时轻轻地摇动。
[0301 ] 制备PD-10柱，静止放置，将顶部切掉和放置在烧杯上。在柱的顶部放置25cc移液管(顶部切掉)；这将作为需要用于清洗柱子的额外体积的扩大。用20ml的PBSw/o Ca2+ 洗涤，在柱的顶部加入500 u I的PBS中1%BSA和让其通过，然后加入另外20ml的PBS缓冲液和使其流过。柱子现在准备好。
[0302]制备具有10-15个5ml聚苯乙烯管的支架(允许容易地看见级分的颜色)。
[0303]PBS流过柱子，直到在烧结玻璃的顶部没有任何东西剩下。结合抗体到柱子顶部的层。使抗体进入柱子。在柱子的顶部加入2ml PBS和使其流过。在500 Ul级分开始收集洗脱液(第一级分是空白)。通过独特的黄色，可以看见结合FITC的抗体，当黄色级分出来，立刻收集所有的，确保收集大部分的级分，和分开收集更迟的稀释的级分。这种方式抗体将集中在一个级分中。
[0304]使该级分免受直接光和在黄色级分的任一侧上读取约3个管。读取整个的收集的级分。在双波长280nm和495nm，使用第一级分作为空白读数。如果读数是>1.5，然后用 150 u I PBS稀释50 u I和再次读数。
[0305]计算结合抗体的浓度和F/P比例
[0306]抗体浓度mg/ml=0D280_(0.31x 0D495)
[0307]1.4
[0308]F/P 比例=(2.86x 0D495)
[0309]0D280-(0.31x 0D495)
[0310]将1%叠氮钠加入到收集的部分和在4°C贮存。
[0311]测定结合到血小板制剂上自由位点的FITC-标记的膜联蛋白A5的量，和与患者的自身抗体结合的量成反比例(图9-11)，即，正常样品发现高结合而APS患者样品低结合，如在图中示出(在散布图上的所有点来自一个样品，上面来自正常个体，下面来自具有状况的患者)。[0312]材料:
[0313]-处理的血小板制剂-通过上述特定步骤制备。
[0314]-膜联蛋白A5(KoaLaboratories, Tokyo, Japan),通过上述高标记的步骤标记突光。
[0315]-CD41PE (Immunotech, Westbrook, ME, USA,或等同物)
[0316]-缓冲液(正常盐水中的0.02M HEPES、2.5mM CaC12、pH7.3)。
[0317]-柠檬酸钠缓冲液3.8%，或ACD-A INH配方A。
[0318]-低分子量肝素:如在上述步骤中制备。
[0319]-通过标准离心从患者的血液中制备血清或血浆。
[0320]方案:
[0321]测试抗血小板磷脂自身抗体的患者的血清或血浆的步骤。
[0322]分析的原理:
[0323]APS患者的血清 或血浆用上述用于结合患者的抗磷脂自身抗体到血小板膜磷脂的特定血小板制剂温育。类似地，正常对照样品从健康个体得到的血清或血浆制备。
[0324]在第一次温育后，血小板悬浮液用高FITC(荧光素)_标记的膜联蛋白A5进一步温育，高FITC (荧光素)-标记的膜联蛋白A5占据在血小板膜磷脂上的剩下的结合位点。
[0325]测定结合到血小板制剂上自由位点的FITC-1abeled膜联蛋白A5的量，和患者的自身抗体结合成反比例(图9-11)，即，正常样品中发现高结合的标记-膜联蛋白和APS患者样品发现低结合，如在图中示出。
[0326]步骤1:
[0327]5uL的特定血小板悬浮液加入到50 ii L患者、阴性对照(NC)和阳性对照(PC)血清/血浆，进入具有45 ii L HEPES缓冲液中，含有最终浓度2.5mM的钙。
[0328]加入5 ii L的低分子量肝素工作液。
[0329]-在室温温育60分钟。
[0330]步骤2:
[0331]-将10ii L的藻红蛋白-标记的抗-⑶41MoAb加入到每个管。
[0332]-将高-FITC-标记的膜联蛋白(终浓度IU g/ml)加入到反应管。
[0333]-在室温温育15分钟。
[0334]-用400ii L HEPES缓冲液稀释和通过流式细胞术分析。
[0335]图9-11说明分析的示例性结果。显示APS患者的样品的结果和健康对照的结果之间的高分辨率。
[0336]该诊断技术具有用于可行、快速、准确和病生理相关诊断APS的高潜力。
[0337]3.HIT (肝素诱导的血小板减少)
[0338]为了得到可靠的结果，旧的方法[Tomer A，1997]已经被本方法替代，提供用于常规临床使用的更可行和可靠的方法。
[0339]方法不在包括检测与血小板膜上阴离子磷脂暴露有关的血小板促凝血活性。试剂诸如膜联蛋白V，其允许检测血小板促凝血活性，已经被一种新的试剂替代。使用的缓冲液，HEPES，其需要具有钙的特定制剂，可以激活血小板自身的作用剂，被没有钙-镁的磷酸缓冲盐(PBS)替代。这种缓冲液也提供生化系统的稳定性。可选地，可以使用生理流体或任何缓冲液，只要它不含有钙或任何其它可以激活血小板的作用剂，和允许血小板继续存在。实验管的数量减少一半，每个样品仅使用两个，一个没有和一个具有.3U/mL肝素，而不是使用四种不同浓度:0、0.1,0.3和100U/mL肝素。肝素的浓度可以是在0.1和0.5IU/mL 之间，优选地约0.3IU/mL。同样，在体外激活、确认试剂的性能的对照作为TRAP加入(凝血酶受体激动剂/激活多肽)。
[0340]然而，在老的方法中，为了可靠的结果，需要立即读数，在本方法中，在两个小时内可以可以可靠地完成一次读数。重复性高度增强。两种血小板的需要体积从70 UL减少到 10 u L，当必要时，允许随后加倍和重复。因此，本方法基于血小板与肝素反应的不同参数的检测，使用完全不同试剂，和是高度优化的，产生显著更可行、可靠和可重复的技术，其可以通过任何常规的实验室技术人员进行，因此使得它对于广泛范围的常规临床诊断是合适和可用的。本方法已经在多于200个患者的样品上测试和发现与HIT的临床表现是高度相关的，如以下进一步说明。
[0341]另外，该方法能够测定肝素替代疗法的任何交叉反应性，在诊断HIT的情况下，其可以给予[Alving B], [Hirsh J 等人]。
[0342]因此，本分析是高度特异和灵敏的，允许高度可靠诊断HIT，不论体内形成的肝素复合物的性质如何。根据阳性实验结果，用肝素治疗需要被立即中断，和需要被替代、非免疫交叉反应的抗凝血剂药物替代。
[0343]方法:方法对于临床实验室中可行的常规应用的优化，应用诸如在此描述的诊断试剂盒实施方式与简单的说明书。
[0344]这种优化包括使用不贵和稳定的试剂，测定最佳结果的混合物中每个试剂的相对体积，和最小化体积至微体积(10 u L血小板悬浮液&10 y L患者的血清)，以允许加倍、重复和保存患者材料用于将来测试和监测。
[0345]反应混合物是稳定的，允许方便时间进行读数，并且完成步骤是简单的，在小于2 个小时可以得到结果。
[0346]与专业的生物统计学家合作，彻底地分析最初结果，以确定用于诊断的最可行和可靠的参数。
[0347]已经在大量患者(>200)中测试了优化的方法，同时用其它免疫检测应用于分析， 显示在临床实验室是高度可行以及用于诊断是高度可靠和可重复的。因此，对于以下描述的试剂技术的诊断试剂盒材料对于可行、快速和可靠地HIT诊断是高度有用的。对于分析的总体性能，使用ROC图分析以区别患者和正常个体之间，发现准确性的高指数。在曲线下的面积是0.86，与商业可用的分析显示0`.62的参数相比，这翻译为本分析的约两倍的灵敏性和更高的特异性。
[0348]本方法基于正常血小板的体外激活的证明，然后在肝素存在下用患者的血清温育，模仿病症的体内病理生理的过程。血小板应答通过测量针对血小板CD62的抗体的特异结合，血小板CD62是在激活后外血小板膜上暴露的抗原。
[0349]该技术使用标准的缓冲液诸如没有添加物的PBS和两色流式细胞术来帮助临床实验室中的常规诊断。该程序由两个主要步骤组成。第一个步骤包括用正常的血小板温育患者血清/血浆60分钟，在不存在和存在肝素的药理学浓度时(分别是0.0 ；0.3IU/ml (然而，使用高剂量的100U/mL作为另一个对照保留对于实验室是可选的)。第二个步骤包括针对-⑶41a的MoAb温育来自第一个步骤的等分试样15分钟用于血小板识别，和抗血小板 CD62抗体温育来自第一个步骤的等分试样15分钟用于血小板反应的检测。
[0350]结果从流式细胞分析得到，和没有进一步操作或计算直接确定血小板激活的程度 (参见图12)。
[0351]以下是建议试剂盒的方案和HIT诊断分析的方法实施方式。
[0352]进行HIT的诊断分析的诊断试剂盒、材料和技术的描述。
[0353]材料:
[0354]a.PBS -磷酸盐缓冲盐水(Ca2+/Mg2+free)，(标准缓冲液)
[0355]b.TRAP -凝血酶-受体激活/激动剂肽。[例如，Calbiochem或Tocris Bioscience - MW-1739.500mg,溶解入 0.5mL 去离子水 /DDW=lmg/mL。PBS 中稀释的等分试样1:1。加入8iiL(2iiL，终浓度)到50 ii L终体积的反应混合物]。
[0356]c.单克隆抗体抗-p-选择素(⑶62p)-荧光标记的(例如，FITC-荧光素-异-硫氰酸酯-绿色突光,例如，Biogen, Cambridge, MA;或 Serotec, UK)。
[0357]d.单克隆抗体抗血小板CD41a(GPIIb/IIIa)-荧光标记的(例如，PE-藻红蛋白-澄色突光)(例如，Immunoteck, Westbrook, ME)。
[0358]?可以应用可以光学可分辨的两个荧光探针的任何组合，(例如在以下发出的荧光染料:530/30nm(FITC) ；585/40nm(PE, PI) ；675nm LP (PE-Cy5, PE-Cy5.5, PerCP, PerCP-Cy5.5，PE-Cy7);675/25nm(APC)。
[0359]血液样品。来自正常个体和患者的五毫升血液样品收集入含有1/10体积的3.8% 柠檬酸钠缓冲液(0.129M)(标准真空管)或ACD (枸橼酸缓冲液-NIH式A)的注射器中。血液样品轻轻地混合和没有延迟地处理。
·[0360]血小板富集血衆(PRP)通过缓慢离心(150x g, 5min)制备和血小板计数调整至 250，000血小板/1^(?1^通常在360和400\1091-1之间)。可选地，PRP可以从血库去除术或随机血小板单位中得到。
[0361]PRP-1O ii L& 血小板-10 ii L
[0362]-制备以下的管(12x75mmBD Falcon聚丙烯或等同物)。
[0363]-终反应体积50ii L -塞子塞紧的帽管。
[0364]-阳性对照/冷冻样品-高速度旋转20min，4°C，去除聚集体。将样品保留在冰上。
[0365]-正常对照:贫血小板血浆(PPP)通过从PRP通过较高的离心(2500xg，15min)制备。
[0366]表1
[0367]1.第一温育步骤:
[0368]制备以下管:[0369]
【权利要求】
1.诊断患者的血清或血浆样品中HIT(肝素诱导的血小板減少症)的方法，所述方法包括: 阶段A,包括: 温育由以下组成的第一PI (患者I)样品:患者的样品的第一等分试样与第一健康个体的PRP，和生理相容缓冲液，条件是缓冲液既不含有钙也不含有镁离子； 温育由以下组成的第一 PIH(使用肝素的患者I)样品:患者的样品的第二等分试样与所述PRP，肝素和缓冲液； 温育由以下组成的第一 NC(正常对照)样品:健康个体的血浆或血清样品的第一等分试样与所述PRP，和缓冲液； 温育由以下组成的第一NCH(使用肝素的正常対照):健康个体的血浆或血清的第二等分试样与所述PRP，肝素和缓冲液； 阶段B，包括: 温育由以下组成的第二 PI样品:第一 PI样品的等分试样，由以下组成的第二 PIH样品:第一PIH样品的等分试样，和由以下组成的第二NC样品:第一NC样品的等分试样，和由以下组成的第二 NCH样品:第一 NCH样品的等分试样,姆个具有:第一标记,第一标记能够同时标记肝素激活和非肝素激活血小板，第二标记，第二标记能够标记由肝素激活的血小板，和缓冲液； 阶段C，包括: 在每个第二样品中，通过测量第一标记测量第二样品中每ー个的类似量的血小板； 在每个所述类似量的血小板中，通过测量由肝素激活的血小板上的第二标记的量，测量肝素激活的血小板的量； 计算以下之间的差:来自第二 PIH样品的激活的血小板的量和来自第二 PI样品的激活血小板的量之间，和来自第二 NCH样品的激活血小板的量和来自第二NC样品的激活血小板的量之间，和 比较所述第二 PIH和第二 PI样品的所述差，和所述第二 NCH和所述第二 NC样品的所述差， 其中当所述第二 PIH和第二 PI样品的所述差显著大于所述第二 NCH和所述第二 NC样品的所述差时，患者的样品中诊断为HIT。
2.根据权利要求1所述的方法，选择所述第二PIH和第二 PI样品的所述差是比所述NCH和所述第二 NC样品的所述差大至少2.5倍。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中第一标记是血小板受体GPIIb/IIIa的标记。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中第二标记是由肝素激活的血小板表达的P-选择素CD62p的荧光标记的单克隆抗体，该方法包括通过结合到激活血小板的第二标记测量荧光的強度。
5.根据权利要求4所述的方法，其中肝素激活的血小板的量每个通过每个类似量的总血小板群的所述第二标记平均总荧光測量。
6.根据权利要求4所述的方法，进ー步包括: 通过设定标志物在2.5%(正态分布的2SD)的类似量的NC的荧光测量的高-CD62p-荧光端上,计算激活血小板％ ；在所述高-⑶62p荧光端，计算PIH中激活血小板％和PI中激活血小板％之间的读数差，和NCH中激活血小板％和NC中激活血小板％之间的读数差，和 比较PIH和PI与NCH和NC样品的所述差，其中阳性结果是PIH和PI的差显著大于NCH和NC差。
7.根据权利要求6所述的方法，其中PIH和PI的差比NCH和NC差大超过2.5倍。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中血浆或血清样品不多于IOyし
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中阶段B进ー步包括:温育由以下组成的TRAP样品:TRAP、第一标记、第二标记、和缓冲液，和阶段C进ー步包括測量TRAP样品中的激活血小板的量。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中: 阶段A可以进一歩包括: 温育由以下组成的第一 PC(阳性对照)样品:具有HIT的个体的血浆或血清样品的第一等分试样与所述PRP，和缓冲液； 温育由以下组成的第一 PCH样品:具有HIT的个体的血浆或血清样品的第一等分试样与肝素，所述PRP，和缓冲液； 和阶段B进ー步包括: 温育由以下组成的第二PC样品:第一· PC样品的等分试样，和由以下组成的第二PCH样品:第一 PCH样品的等分试样，每个具有:第一标记，第二标记，和缓冲液； 和阶段C进ー步包括: 计算第二 PCH样品中激活血小板％和第二 PC样品中激活血小板％之间的差别，和比较所述第二 PIH样品和第二 PI样品的所述差与所述第二 PCH和所述第二 PC样品的所述差， 其中当所述第二 PIH样品和第二 PI样品的所述差类似于所述第二 NCH和所述第二 NC样品的所述差时，患者的样品中进ー步诊断为HIT。
11.根据权利要求1或2所述的方法，阶段A中的温育是约I小时和阶段B中的温育是约15分钟。
12.根据权利要求1或2所述的方法，第一PIH和NCH样品中的肝素的浓度为0.1和0.5IU/mL 之间。
13.根据权利要求12所述的方法，其中肝素的浓度为约0.3IU/mL。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中缓冲液是没有钙和镁的PBS。
15.根据权利要求3所述的方法，其中第一标记是荧光标记的单克隆抗体抗血小板CD41a。
16.根据权利要求1或2所述的方法，包括以下方法中的至少ー个: 权利要求1所述的方法； 患者的血清或血衆样品中APS诊断，APS诊断包括: 从不具有APS的个体的血液样品中制备血小板悬浮液； 通过暴露血小板中膜磷脂,处理来自不具有APS的个体的血小板； 用所述处理的血小板温育患者的样品，以得到具有暴露的正常血小板的患者的样品的悬浮液(SPEP)；纯化未标记的膜联蛋白； 在pH=9.2，将过量的FITC加入到纯化的膜联蛋白，形成高度标记的膜联蛋白； 纯化高度标记的膜联蛋白； 用所述SPEP温育纯化高度标记的膜联蛋白； 在用膜联蛋白温育的SPEP的子样品中，測定子样品中结合到血小板的高度标记的膜联蛋白的量，由此低比例表明所述样品中的APS ； ITP (免疫性血小板减少症)诊断样品，ITP诊断包括: 制备: A)患者的抗体: 将第一表面用MoAb抗血小板特异性受体覆盖；随后，用来自正常血小板的溶胞产物温育覆盖的第一表面； 随后，用患者的样品等分试样温育覆盖的第一表面和溶胞产物； 随后，加入人免疫球蛋白的第二荧光标记的Ab，或: B)患者的抗体-血 小板特异性抗原复合物: 用MoAb抗-血小板特异性受体覆盖第一表面；随后,用来自患者的血小板的溶胞产物温育覆盖的第一表面； 随后，加入人免疫球蛋白的第二荧光标记的Ab ； C)制备參照: 用MoAb抗血小板特异性受体覆盖第二表面； 随后，用来自正常血小板的溶胞产物覆盖第二表面； 随后，用正常的血清或血浆温育覆盖的第二表面和溶胞产物； 随后加入人免疫球蛋白的第二荧光标记的AbjP D)比较吸附到所述温育第一表面上的第二标记的抗体的第一定量与吸附到所述温育第二表面上的第二标记抗体的第二定量，其中第一定量显著地多于第二定量表明所述样品中的ITP ； 诊断样品的血小板功能，该方法包括: A)评估血小板刺激: 1)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每个用血小板糖蛋白的两个标记的MoAb,以提供患者的标记血小板和正常个体的血小板，第一所述标记的MoAb具有第一带中的測量和第二所述标记的MoAb具有第二带中的測量； 2)随后，将ADP或TRAP中每ー个加入到所述样品，以提供患者和正常个体的刺激标记的血小板； 3)随后，通过在所述第一带中或所述第二带中测量识别所述样品中的标记血小板； 4)随后，測量患者的所述识别的标记血小板和正常个体的所述识别的标记血小板，其中当标记的血小板通过第一带识别时，所述识别的标记血小板的测量是在所述第二带中，当标记的血小板通过第二带识别时，所述识别的标记血小板的测量是在所述第一带中； 5)其中所述患者的所述识别的标记的血小板的測量等于或大于平均数+2标准差(2SD)，正常个体的所述标记血小板的所述测量表明患者的所述样品血小板激活； B)评价血小板促凝固:1)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每个用血小板糖蛋白标记的MoAb和膜联蛋白V; 2)随后，用血小板离子载体温育每个所述样品； 3)随后，通过测量血小板糖蛋白的标记的MoAb，识别所述样品中类似量的标记血小板； 4)随后，測量在所述类似量的血小板上的膜联蛋白V的荧光； 5)其中患者的血小板的膜联蛋白V荧光等于或大于平均数+2个标准偏差(2SD)，正常个体的血小板的膜联蛋白V荧光表明患者的所述样品中血小板促凝固； 所述样品中的Berard-Soulier综合征诊断,诊断包括: 1)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每ー个用排除⑶42的血小板特异糖蛋白的第一标记MoAb，和用⑶42的第二标记MoAb ； 2)随后，通过测量第一标记MoAb识别所述样品中的标记血小板， 3)随后，由患者的所述识别的标记血小板測量所述第二MoAb和由正常个体的所述识别的标记血小板测量所述第二 MoAb, 其中患者的亲戚的所述识别的标记的血小板的所述第二 MoAb的測量比正常的小，但是比患者大，表明携帯者状态； 所述样品中的血小板无カ症综合征诊断，该诊断包括: 1)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每个用排除⑶41a的血小板糖蛋白的标记MoAb,和用OMla的MoAb ； 2)随后，通过测量排除⑶41a的血小板糖蛋白的MoAb识别所述样品中的标记的血小板， 3)随后，測量患者的所述识别的标记血小板的CD41a的MoAb和正常个体的所述识别标记血小板的CD41a的MoAb， 4)其中CD41a的MoAb的第一測量等于或小于所述标记的血小板的所述第二荧光的⑶41a的MoAb的测量的平均数_2个标准偏差(2SD)，表明患者的所述样品中的血小板无力症综合征，以及在表明综合征和表明正常个体之间中的第一測量表明血小板无カ症携帯者； 所述样品的药物抑制效果诊断，诊断包括:
A) 1)同时温育患者和正常个体的含有血小板的样品，每个用血小板糖蛋白⑶41a或CD61、CD62p 和激活 CD41a 的标记 MoAb ； 2)随后，用选自以下的一种或多种的兴奋剂温育所述样品:ADP、花生四烯酸和TRAP; 3)通过测量血小板糖蛋白⑶41a的MoAb，识别所述样品中的标记血小板； 4)随后测量血小板糖蛋白⑶62p和患者的所述识别的标记血小板的激活⑶41a以及正常个体的所述识别标记的血小板， 5)其中患者的血小板糖蛋白CD62p的MoAb的测量等于或小于所述正常个体的血小板糖蛋白CD62p的MoAb的测量的平均数-2标准偏差(2SD)測量，或者患者的血小板糖蛋白激活⑶41a的MoAb的测量等于或小于所述正常个体的血小板糖蛋白激活⑶41a的MoAb的測量，表明患者的所述样品中的药物抑制效果；B)当在血小板功能诊断中，测定评估血小板促凝固，其中血小板用钙离子载体刺激，然后用标记的膜联蛋白A5温育； 測定循环血小板或血小板相关颗粒激活标记，作为持续、实时体内、血栓前活性的指示物，包括: 1)用ー个或多个标记荧光温育患者和正常对照血液的等分试样或PRP样品； 血小板和血小板相关颗粒的免疫检测的受体特异性MoAb，受体特异性MoAb，排除抗激活CD41a(GPIIb/IIIA)抗体、抗-P-选择素CD62p抗体的受体特异性MoAb ； 抗激活 CD41a(GPIIb/IIIA)抗体； 抗-P-选择素⑶62p抗体； 血小板阴离子-磷脂的膜联蛋白A5蛋白用于检测血小板促凝血活性； 2)随后在室温温育15-30分钟，用缓冲液稀释所述样品和分析， 其中患者的样品的信号水平等于或大于正常的平均数+2个标准差表明循环血小板或血小板相关颗粒的激活。
17.系统，其包括用于进行权利要求1或2所述的方法的试剂盒。
18.系统，其包括用于进行权利要求16所述的方法的试剂盒。
19.系统，其包 括用于进行权利要求1-16任一所述的方法的试剂盒。
【文档编号】A61K31/727GK103596576SQ201280014196
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年1月19日 优先权日:2011年1月20日
【发明者】阿龙·托梅 申请人:阿龙·托梅