用于激发t细胞的方法

用于激发t细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及一种体外用于激发适合施用于病毒感染患者的T细胞的方法。本发明也涉及通过所述方法获得的组合物及其用途。
【专利说明】用于激发T細胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学和传染病治疗领域，更具体地涉及ー种活化抗原特异性T细胞的方法及通过所述方法制备的T细胞。
【背景技术】
[0002]对T细胞识别病毒和肿瘤特异性抗原的机制的增加的理解，使得对使用特异性T细胞作为用于传染病和恶性疾病的过继免疫治疗产生了很大的兴趣。可以将细胞免疫治疗广义地定义为施用免疫系统的效应细胞用于疾病的治疗。细胞免疫系统的主要功能是对病原体，包括急性和持续性感染提供保护。
[0003]T细胞识别感染的细胞并通过杀伤这些靶细胞防止疾病发作。然而，病原体与免疫系统的相互作用是复杂的，这通过在存在特异性T细胞时发生慢性感染，从而病原体明显地可以逃避T细胞监视得到证实。
[0004]事实上T细胞检测任何致病入侵者的能力是由其非常多样的受体库赋予的，受体库允许T细胞池识别由主要组织相容性复合体(MHC)分子递呈的大量的肽。而且，通过T细胞受体(TCR)(信号I)的信号转导不足以产生充分的T细胞活化，因为共刺激分子提供了用于增殖、存活和分化所不可缺少的信号(信号2)。实际上，仅接受信号I而没有信号2的原初T细胞被认为是无活动力(非反应)的或通过细胞凋亡而死亡。完全的T细胞活化需要信号I和2共同起作用，并且这些信号的強度决定了接着产生的T细胞池的大小。而且，完全分化为效应T细胞通常依赖于第三信号，其由抗原呈递细胞(APC)以可溶性形式提供，并提供用于需要的效应T细胞类型的指导性信号。这个“三个信号”的概念描述了用于活化原初T细胞以及随后形成效应T细胞的模型。然而，免疫系统提供了大量多种共刺激分子并且这些多种类型的信号2和`3均以其独特的方式有助于T细胞应答的质量。共刺激信号和可溶性形式的信号3可作用于T细胞活化的特定方面，如存活、细胞周期进程、待发展的效应细胞的类型和分化成效应细胞或记忆细胞。
[0005]现在普遍接受了成熟的抗原呈递树突细胞(DC)需要由其它淋巴细胞，包括⑶4+T细胞、NK细胞和NKT细胞“辅助”，以诱导长期生存的记忆⑶8+T细胞。这种“辅助”诱导所述成熟DC进ー步分化，这个过程称为激活(licensing)。“辅助”信号对DC有多种作用，包括上调共刺激分子、分泌细胞因子和上调多种抗细胞凋亡分子，这些都累积性地增强DC最佳活化同源T细胞，特别是CD8+T细胞的能力。而且，“辅助”淋巴细胞也可表达或分泌直接影响T细胞存活、细胞周期进程、待发展的效应细胞类型和分化成效应细胞或记忆细胞的因子。
[0006]持续性或慢性病毒感染，如HIV、HBV或HCV或疱疹病毒CMV和EBV，对社会造成重大威胁，并且对感染个体的治疗方案也是迫切需要的。在病毒持续感染期间，病毒与宿主的免疫反应之间的平衡是至关重要的。免疫系统使病毒受到控制，而病毒通过逃避免疫反应以避免被清除进行对抗，最終在许多情况下，平衡倾向于有利于病毒并引起疾病。在最持久的病毒感染中，病毒抗原持续存在，使病毒特异性T细胞功能失调。[0007]在过去的20年中，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染已成为流行病，超过4千万人感染获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)，并已经有超过2千万人死亡。来自暴露的未感染的数据以及来自长期非进展者的数据强烈地表明HIV特异性CD8+和CD4+T的细胞功能对于保护性免疫力是必不可少的。
[0008]虽然⑶4 (+) T辅助细胞对病毒的反应受损，HIV特异性⑶8 (+) T细胞以高頻度持续存在于HIV感染患者中，但是，与其它分化的效应细胞毒性T淋巴细胞不同，大部分CD8 (+) T细胞持续表达肿瘤坏死因子受体家族成员⑶27。⑶27的配体(⑶70)在HIV感染宿主中也是过表达的，因此HIV特异性⑶8 (+) T细胞上⑶27表达的表达性质和潜在功能结果是令人感兴趣的。源自相同HIV特异性克隆的CD27(+)和CD27(-)T细胞的分析显示CD27的保留不干扰效应器功能的获得，并且在T细胞受体刺激后，同时通过⑶27刺激的⑶27 (+)细胞比CD27(-)T细胞对细胞凋亡、白细胞介素2的产生和增殖表现更强的抗性。在转移回HIV感染的患者后，自体HIV特异性CD27 (-) T细胞快速消失，但是源自相同克隆的CD27 (+) T细胞以高頻度持续存在。因此表明在HIV感染中CD27-CD70相互作用可提供具有存活优势的CD27(+) CD8 (+) T细胞，并且可补偿限制或缺乏CD4 (+)T辅助以保持CD8应答(Ochsenbein等，Exp Med.2004Dec6;200(ll): 1407-17)。
[0009]与HIV类似，也已经发现，除HIV外的持续性病毒感染的患者具有不完全分化但不仅表达⑶28也表达⑶27的中间功能效应记忆T细胞亚型。已经显示这些细胞比缺乏⑶28和⑶27的成熟⑶8+T细胞具有更高的增殖能力(Decrion等，Immunology, 121, 405-415，2007)。
[0010]因此，在大部分感染慢性病毒病的个体、长期非进展者的疾病进程的延迟或停滞以及ー些暴露于病毒的个体对感染的保护中，在病毒特异性CTL反应的效力和特异性与病毒载量的大小和临床结果之间具有很强的相关性。増加病毒特异性CTL反应的质量和广度，可能将增加慢性感染个体中病毒复制的控制，以及稳定或改善其临床病程。
[0011]因此，对抗病毒感染和增加CTL反应的ー种策略是过继T细胞治疗，其中涉及效应T细胞的转移，以恢复宿主中特异性T细胞应答。过继细胞转移治疗是施用间接体外活化和扩增的自体病毒反应性T细胞。
[0012]在目前HIV患者的过继免疫治疗的方法中，转移的CTL下降的问题显著。虽然外周血中转移的CTL下降部分反映迁移到淋巴结位点，但是随着时间的推移抗病毒活性丧失表示在HIV复制的这些局部位点CTL死亡或表现功能异常。对转移的⑶8+CTL提供帮助的策略应当改善CTL的存活并阐明CTL用于控制HIV感染和其它病毒感染的进程的治疗潜力。
[0013]因此，非常需要ー种改善的制备在抗原特异性T细胞活化期间增加其増殖和存活的针对病毒感染的用于过继免疫治疗的T细胞群的方法。

【发明内容】

[0014]本发明涉及ー种体外用于激发适合施用于病毒感染患者的抗原特异性⑶4+和/或CD8+T细胞的方法。所述方法包括共培养来自待治疗的患者的靶T细胞、树突细胞、感染材料或感染相关蛋白质或肽、以及淋巴细胞。所述淋巴细胞针对抗原呈递细胞(APC)上的MHC I类和/或MHC II类抗原致敏。所述淋巴细胞通过混合白细胞反应致敏。
[0015]本发明也涉及通过所述方法获得的抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞及其用途。【专利附图】

【附图说明】
[0016]图1说明，针对在常规MLR中照射的同种异体外周血单核细胞(PBMC)上表达的MHC抗原已经致敏的淋巴细胞显著增强了相对于在最初致敏MLR期间用做刺激细胞的照射的PBMC为自体的成熟单核细胞来源的DC上⑶70的表达。
[0017]图2说明，针对在常规MLR中照射的同种异体PBMC上表达的MHC抗原已经致敏的Y射线照射的淋巴细胞显著增强了相对于在最初致敏MLR期间用做刺激细胞的照射的PBMC为自体的成熟单核细胞来源的DC上⑶70的表达。
[0018]图3说明，将针对在常规MLR中照射的同种异体PBMC上表达的MHC抗原已经致敏的淋巴细胞和相对于在最初致敏MLR期间用做刺激细胞的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC共培养6天诱导大量产生IL-12。
[0019]图4说明，将针对在常规MLR中照射的同种异体PBMC上表达的MHC抗原已经致敏的淋巴细胞和相对于在最初致敏MLR期间用做刺激细胞的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC共培养6天诱导大量产生IFN- y。
[0020]图5说明，将针对在常规MLR中照射的同种异体PBMC上表达的MHC抗原已经致敏的淋巴细胞和相对于在最初致敏MLR期间用做刺激细胞的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC共培养6天诱导大量产生IL-2。
[0021]图6说明，将a)针对在常规MLR中照射的同种异体PBMC上表达的MHC抗原已经致敏的照射的淋巴细胞，和b)相对于在最初致敏MLR期间用做刺激细胞的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC共培养，诱导较高数目的来自第三方供体的表达CD27的同种异体反应性⑶8+T细胞。
[0022]图7说明，将针对在常规MLR中照射的同种异体PBMC上表达的MHC抗原已经致敏的照射的淋巴细胞加入至相对于在最初致敏MLR期间用做刺激细胞的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC中，降低了来自第三方供体的细胞凋亡(膜联蛋白V阳性)同种异体反应性⑶8+T细胞的数目。
[0023]图8说明，将针对在常规MLR中照射的同种异体PBMC上表达的MHC抗原已经致敏的照射的淋巴细胞加入至相对于在最初致敏MLR期间用做刺激细胞的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC中，在用相对于初次刺激期间使用的DC为自体的B细胞再刺激的同种异体反应性CD8+淋巴细胞中诱导较强(6倍)的二次增殖反应。
[0024]图9说明，将针对在常规MLR中照射的同种异体PBMC上表达的MHC抗原已经致敏的照射的淋巴细胞加入至相对于在最初致敏MLR期间用做刺激细胞的照射的PBMC为自体的单核细胞来源的DC中，通过相对于在初次刺激期间使用的DC为自体的B细胞再刺激的同种异体反应性⑶8+淋巴细胞诱导IFN- y的产生适度(3倍)增加。
[0025]图10说明，在用a)活化的同种异体细胞和抗原负载扩增(a、b和C)，用抗原负载的自体DC但无活化的同种异体细胞扩增(d、e和f)以及用活化的同种异体细胞与非负载的自体DC扩增(g，h和i)后的病毒特异性CD8阳性细胞(分别对CMV、EBV或甲型流感病毒特异)的频度。
【具体实施方式】[0026]定义
[0027]在描述本发明前，应该理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的而不意于限制，本发明的范围仅由所附的权利要求和其等同物限定。
[0028]必需注意，除了上下文清楚指明外，在本说明书和所附权利要求中使用的単数形式“ー个”、“ー种”和“所述”包括复数指示物。
[0029]并且，在应用时，术语“约”用于表示给定值的+/-2%的偏差，优选地表示数值的+/-5%，最优选地表示数值的+/-10%。
[0030]本发明的上下文中，术语“抗原特异性”涉及在自身MHC分子上呈递的短的独特肽序列的独特T细胞受体(TCR)的特异性识别/结合。
[0031]本发明的上下文中，术语“激发”和“活化”涉及在原初抗原特异性T细胞中发生的程序化活化过程，所述原初抗原特异性T细胞由同时存在或不同时存在“辅助”细胞的抗原呈递细胞刺激。[0032]本发明的上下文中，术语“应答细胞”涉及不同的淋巴细胞亚群，包括但不限于通过活化和/或增殖应答共培养的同种异体PBMC的T细胞、NK细胞和NKT细胞。
[0033]本发明的上下文中，术语“致敏细胞”涉及不同的淋巴细胞亚群，包括已经通过共培养的同种异体细胞(包括PBMC)预活化的T细胞、NK细胞和NKT细胞。
[0034]本发明的上下文中，术语“靶细胞”涉及通过同种异体或自体APC或抗原呈递自体APC刺激的CD4+或CD8+T细胞。患者淋巴细胞(靶细胞)收集的部位可以，例如为外周血或骨髄。
[0035]本发明的上下文中，与单核细胞来源的DC相关的术语“成熟”涉及用微生物产物(如LPS)或炎性介质(如TNF- a和/或IL_1 ^ )刺激未成熟DC而诱导的“成熟标记物”(包括但不限于CD40、CD86、CD83和CCR7)的表达。
[0036]未成熟DC是表征为高内吞活性和低T细胞活化潜力的细胞。未成熟DC经常取样于周围环境的病原体，如病毒和细菌。未成熟DC吞曬病原体并将它们的蛋白质降解成小碎片，在成熟时使用MHC分子将那些片段呈递在它们的细胞表面。同时，它们上调在T细胞活化中作为共受体的细胞表面受体，如CD80、CD86和CD40，极大增强了它们活化T细胞的能力。它们也上调CCR7，所述CCR7是诱导树突细胞经过血流进入脾或通过淋巴系统进入淋巴结的趋化因子受体。在此，它们作为抗原呈递细胞:通过向其呈递源自病原体的抗原和非抗原特异性共刺激信号，它们活化辅助性T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。成熟的DC可能由单核细胞、(身体中循环的白细胞)产生，并且依赖于正确的信号，可以转变成DC或巨噬细胞。而单核细胞由骨髄中的干细胞形成。单核细胞来源的DC可以从外周血单核细胞体外产生。
[0037]本发明的上下文中，术语细胞的“非増殖”用于指使细胞不能进行细胞分裂以形成子代。然而，细胞可能能够对刺激物应答，或生物合成和/或分泌细胞产物(如细胞因子)。使细胞非增殖的方法是本领域已知的。优选的使细胞非增殖的方法为用抗增殖的药物如丝裂霉素C处理或照射如Y射线照射处理。已经被固定或透性化和不能分裂的细胞也是非增殖细胞的实例。
[0038]本发明上下文中，术语“混合淋巴细胞反应”、“混合淋巴细胞培养”、“MLR”和MLC可互換使用，指的是包含同种异型不同的最少两个不同细胞群的混合物。至少ー种同种异型不同的细胞是淋巴细胞。将所述细胞在合适的条件下一起培养一段时间以产生淋巴细胞的刺激。MLR的惯常的目的是提供同种异体刺激，如可引发淋巴细胞的増殖；但是除非特别指明，不需要在培养期间的増殖。在适当的上下文中，这些术语或者可以指源自这种培养的细胞混合物。
[0039]如文中使用的，术语“治疗”指的是试图改变待治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理学过程期间进行。期望的效果包括防止疾病的发生或重发，缓解症状和減少疾病的任何直接或间接病理学后果、降低疾病进展的速度、改进或减轻疾病状态和缓解或改善预后。
[0040]术语“抗原呈递细胞”、“APC”等包括来自待治疗患者或者来自表达与来自待治疗的患者的APC上表达的MHC II类抗原相同的至少ー种MHC II类抗原的非相关血液供体的PBMC、单核细胞、B细胞或单核细胞来源的DC。
[0041]本发明的上下文中，“慢性感染”为逃避宿主的免疫系统的长期持续性感染。慢性感染可以由细菌或病毒引起。引起慢性感染的病毒的非限制性实例是人类免疫缺陷病毒(HIV)、こ型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、巨细胞病毒(CMV)和EB (Epstein-Barr)病韋(E)BV )。
[0042]本发明的上下文中，术语“培养”指的是在多种培养基中细胞或生物体的体外增殖。应该理解，在培养中生长的细胞后代可以与亲代细胞(在形态、遗传或表型上)不完全相同。本领域技术人员可以选择合适的培养基，这种培养基的实例为RPMI培养基或Eagles最低基础培养基(EMEM)。
[0043]术语“主要组织相容性复合体”和“ MHC”指的是编码需要用于将抗原呈递至T细胞和用于快速移植物排斥的细胞表面分子的基因复合体。在人中，MHC复合体也已知为HLA复合体。由MHC复合体编码的蛋白质被称为“MHC分子”并且被分类为I类和II类MHC分子。I类MHC分子包括由与(62- 微球蛋白非共价连接的MHC中编码的链组成的膜异二聚体蛋白质。I类MHC分子由几乎所有有核细胞表达，并且显示在抗原呈递至⑶8+T细胞中起作用。I类分子包括人中的HLA-A、-B和-C。I类分子通常结合长度为8-10个氨基酸的肽。II类MHC分子也包括膜异二聚体蛋白质。
[0044]已知II类MHC分子也參与抗原呈递至⑶4+T细胞，并且在人中，包括HLA-DP、-DQ和DR。II类分子通常结合长度为12-20个氨基酸残基的肽。术语“MHC限制”指的是允许T细胞仅识别被加工后的抗原的特性，并且产生的抗原肽与自身I类或自身II类MHC分子
联合展示。
[0045]本文中使用的术语“疫苗”、“免疫原”或“免疫原性组合物”指的是，当施用于人或动物受试者时能赋予一定程度特异免疫力的化合物或组合物。如本公开内容中所使用的，“细胞疫苗”或“细胞免疫原”指的是包含至少ー个细胞群(任选地失活的细胞群)作为活性成分的组合物。本发明的免疫原和免疫原性组合物是有活性的，这表示它们能刺激至少部分由宿主的免疫系统介导的特异性免疫学反应(如抗病毒抗原或抗病毒反应)。免疫学反应可以包含抗体、免疫反应性细胞(如辅助/诱导物或细胞毒性细胞)或其任意组合，并且优选针对在治疗针对的病毒上存在的抗原。可以通过施用单剂量或多剂量在受试者中引起或再刺激所述反应。
[0046]如果能够a)在首次被试验的个体中产生针对抗原(如病毒抗原)的免疫反应；或b)如果没有施用化合物或组合物，将不发生个体中重组、增强或維持免疫应答，那么所述化合物或组合物是“免疫原性的”。当施用单剂量或多剂量吋，如果能达到这些标准的任ー个，则组合物是免疫原性的。
[0047]本发明涉及同种异体致敏的同种异体淋巴细胞(ASAL)的制备，以促进抗原特异性T细胞在其通过自体抗原呈递细胞，包括树突细胞(DC)的活化期间的增殖和存活的增加。
[0048]本发明基于体外研究，所述体外研究使用来自人健康血液供体的外周血单核细胞(PBMC)和其亚群，证实在诱导抗原特异性人CD8+T细胞应答中ASAL的阳性调节作用。使用同种异体的体外模型，追踪在ASAL存在下同种异体反应性CD8+T细胞的増殖和存活，在再刺激后増殖能力増加5倍以上，而细胞凋亡性细胞死亡降低10-5%。
[0049]加入ASAL导致强烈上调抗原呈递DC上共刺激分子⑶70的表达和IL-12和IFN- y的产生，所述IL-12和IFN- y两个因子对T细胞发展成为I型⑶4+和⑶8+T细胞有公知的积极影响。此外，加入ASAL也导致产生公知的T细胞生长因子IL-2。特别地，最近显示，CD70介导的相互作用在连续轮次的整个分裂过程中促进活化的T细胞的存活，从而有助于效应T细胞的累积。
[0050]本发明涉及ー种体外用于激发适合施用于病毒感染患者的抗原特异性⑶4+和/或CD8+T细胞的方法。所述方法包括共培养来自待治疗患者的靶T细胞和DC (优选单核细胞来源的DC)、自体或同种异体感染材料或感染相关蛋白质或肽、以及针对抗原呈递细胞(APC)上MHC I类和/或MHC II类抗原致敏的淋巴细胞。所述APC优选地相对于所述淋巴细胞为同种异体的。所述DC可以是自体的或同种异体的。
[0051]本发明还提供了制备用于过继免疫治疗的T细胞群的方法，包括将T细胞改造(通过病毒转导，转染，电穿孔或其它引入遗传物质的方法)以表达识别靶抗原的T细胞受体或嵌合T细胞受体；在抗⑶3抗`体和致敏淋巴细胞存在下用抗原负载的DC活化这些改造的T细胞；在培养物中扩增这些靶细胞；以及将这些细胞再引入回患者。更具体而言，ー种体外用于激发适合施用于病毒感染患者的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞的方法，其中所述CD4+和/或CD8+T细胞已经被遗传操作。所述方法包括共培养来自待治疗患者的病毒抗原受体转染的靶T细胞与DC (优选单核细胞来源)、抗CD3抗体以及针对抗原呈递细胞(APC)上MHC I类和/或MHC II类抗原致敏的淋巴细胞。
[0052]可以用编码T细胞受体(TCR)的基因转化靶T细胞，或者通过使用能以非MHC限制的方式将兴奋信号传递至T细胞的嵌合抗原受体(CAR)转化靶T细胞。因此，与人类白细胞抗原基因型无关，这些由细胞外的抗原识别域与细胞内T细胞活化域融合组成的杂合蛋白质可以用于患者。在转染之前，优选将靶T细胞预先用抗CD3抗体刺激，以优化随后的转导。本发明中可以使用任何合适的CAR。CAR配体可以由病毒表达。选择和制备合适的CAR在本领域技术人员的技能范围内。
[0053]通过使用本领域技术人员已知的任何合适的方法，如病毒或非病毒载体(參见，例如Samtoook等，分子克隆，实验室手册，第3版，第1_3卷，冷泉港实验室，冷泉港，NY)，可以将编码TCR或CAR的基因转导到T细胞中。病毒载体的非限制性实例包括反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体，非限制性非病毒载体系统包括质粒的电转移和转座子/转座酶系统。
[0054]待扩增的来自患者的淋巴细胞可以源自外周血或骨髓。[0055]病毒感染可以是慢性病毒感染。引起慢性病毒感染的病毒的非限制性实例为HIV、HBV,HCV,CMV和EBV。慢性病毒感染的患者具有非活性病毒特异性CTL，因此是用于本发明的激发抗原特异性Thl细胞或CTL的方法的合适的靶。非活性HIV特异性CTL以高浓度存在于HIV患者中。非活性CTL高度表达⑶70受体⑶27，使得本发明的激发的抗原特异性Thl细胞或CTL特别适合施用于HIV患者。
[0056]ASAL为获得自与DC和靶细胞一起培养的混合淋巴细胞反应的应答细胞。当靶细胞被遗传操作时，也向培养物中加入抗⑶3抗体。ASAL选自由外周血淋巴细胞，包括⑶4+T细胞、⑶8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞组成的组。靶细胞为优选对于DC为自体的⑶4+和/或CD8+T细胞，以及DC优选为单核细 胞来源的。所述单核细胞来源的DC负载有病毒材料或病毒相关蛋白质或肽或病毒来源抗原。
[0057]加入ASAL进ー步导致表达高水平⑶27的靶⑶8+T细胞群的富集。⑶27+CD8+T细胞由于能够提供用于增殖的抗原驱动自分泌信号，它们代表潜在的用于过继免疫治疗的更有效的CTL (细胞毒性T细胞)。这种不依赖辅助体的⑶8T细胞不需要以IL-2或⑶4+T细胞形式的外源辅助以存活和扩增。因此，本发明通过向受试者提供⑶8+T细胞群，提供了用于治疗免疫介导疾病的方法，所述CD8+T细胞群在没有或少量存在额外的细胞因子(如IL-2)或CD4+T细胞时，被程序化了强细胞毒性活性。所述方法特别用于间接体内扩增细胞溶解性、病毒特异性CD8+T细胞，但是也用于扩增病毒特异性CD4+T细胞。
[0058]以CD8+T淋巴细胞总数的百分数表示的细胞溶解性抗原特异性CD8+T细胞的百分数优选至少约5%,更优选至少约10%,更优选至少约15%,更优选至少约20%,甚至更优选至少约25%，甚至更优选至少约30%和最优选至少约35%。
[0059]更具体而言，本发明的方法涉及ー种体外用于激发适合施用于病毒感染患者的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞的方法，其中所述方法包含下述步骤:
[0060]a)将非増殖抗原呈递细胞与相对于所述非増殖抗原呈递细胞为同种异体的外周血单核细胞一起培养，
[0061]b)在允许单核细胞成熟为成熟DC的组合物(下面进ー步描述所述组合物)中培养单核细胞，和
[0062]c)培养来自步骤a)的淋巴细胞，包括但不限于⑶4+T细胞、⑶8+T细胞和/或自然杀伤(NK)与来自步骤b)的成熟DC。
[0063]通过首先在包含GM-CSF和IL_4的组合物中培养单核细胞约2_7天(优选约5天)以获得未成熟DC，随后加入能使未成熟DC成为成熟DC的第二組合物，通过培养至少约12-72小时(优选约24-48小时)而获得单核细胞来源的DC。所述第二組合物包含能使未成熟DC成为成熟的单核细胞来源的DC的组分，所述成熟单核细胞来源的DC可用于活化⑶4+和⑶8+T细胞。在一种实施方式中，所述第二組合物包含TNFa、IL-1 3、干扰素 Y、干扰素 P 和 TLR3 配体，如聚 1:C(Mailliard 等，Alpha-type-lpolarizedDしs:a novel immunization tool with optimized しi'L_inducing activity?しancerRes.2004;64:5934-5937.) o在另ー种实施方式中，所述第二組合物包含干扰素y、TLR3和/或TLR4配体和TLR7和/或TLR8配体和/或TLR9配体。TLR3配体的非限制性实例是聚I:C, TLR7/8配体的非限制性实例是R848，以及TLR9配体的非限制性实例是CpG。
[0064]同种异体淋巴细胞的致敏作用是通过传统的混合淋巴细胞反应(MLR或MLC-混合淋巴细胞培养)诱导的，所述传统的混合淋巴细胞反应包括培养失活的抗原呈递细胞与相对于抗原呈递细胞为同种异体的外周血单核细胞(PBMC)。进行MLR是本领域技术人员公知的(Jordan WJ, Ritter MA.0ptimal analysis of composite cytokine responses duringalloreactivity.J Immunol Methods2002; 260:1-14)。在 MLR 中，来自两个个体的外周血淋巴细胞在组织培养中混合在一起数天。来自不相容个体的淋巴细胞将相互刺激以显著増殖(例如通过氚标记的胸腺嘧啶摄取进行測定)，而来自相容个体的淋巴细胞则不相互刺激。在单向MLC中，来自个体之一的淋巴细胞(通常用毒素，如丝裂霉素处理，或者用照射，如Y射线照射处理)被失活，从而仅使未处理的剰余的细胞群应答外源组织相容性抗原而増殖。
[0065]在MLR中使用的抗原呈递细胞选自由PBMC和单核细胞来源的DC组成的组。单核细胞来源的DC来自患者或来自健康供体，即可以为自体的或同种异体的。
[0066]感染材料或感染相关蛋白质或肽选自由来自患者的灭活病毒颗粒、与患者的病毒感染相同类型的同种异体病毒颗粒以及分离和纯化的病毒蛋白质或肽组成的组。分离和纯化的病毒蛋白质或肽对本领域技术人员是公知的。在一种实施方式中，病毒材料是通过用编码病毒蛋白质的mRNA转染而负载到单核细胞来源的DC中的病毒蛋白质。
[0067]在本发明的方法中，将细胞(来自待治疗患者的T细胞、单核细胞来源的树突细胞、病毒材料或病毒相关蛋白质或肽、以及针对抗原呈递细胞(APC)上的MHC I类和/或MHCII类抗原致敏的淋巴细胞)共培养至少约20天, 优选约6-20天,更优选约8-14天。
[0068]在本发明的方法的一种实施方式中，向细胞培养物中加入抗CD3抗体、外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗IL-4和/或IL-21以优化细胞增殖和存活。
[0069]通过将激发的抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞与新DC、新致敏的淋巴细胞一起培养，以及任选地向细胞培养物中加入抗⑶3抗体和/或外源性1レ2、1レ7、1レ15、抗1レ4和/或IL-21也可以再刺激所述激发的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞
[0070]本发明也涉及通过上述方法获得的免疫原性组合物以及通过上述方法获得的抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞。
[0071]抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞适合施用于患者，并且优选地具有至少以下特征之一:
[0072]一能増殖但不会快速达到细胞凋亡
[0073]—表达低水平的细胞凋亡标记物膜联蛋白V
[0074]一在细胞表面表达⑶27和/或⑶28
[0075]本发明也涉及通过本发明的方法获得的抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞用作为药物和在制备药物中使用。
[0076]此外，本发明涉及通过本发明或如上所限定的方法获得的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞的用途，用于治疗病毒感染，如慢性病毒感染，或用于引发人中的抗感染免疫学反应，以及用于制备用于治疗病毒感染，如慢性病毒感染的药物，或用于制备用于引发人中的抗病毒免疫学反应的药物。可以在第一次刺激后或者在再刺激之后，施用所述CD4+和/或CD8+T细胞。在一种实施方式中，所述CD4+和/或CD8+T细胞与治疗性抗病毒疫苗组合施用。
[0077]在人受试者的治疗中使用用于过继细胞治疗的T细胞群的方法是本领域临床医生已知的。根据文中描述的和本领域中已知的方法制备的T细胞群可以用于这种方法。例如，使用CMV特异性T细胞的过继细胞治疗用于治疗CMV感染(Einsele等，Blood; 2002 (99) 3916-3922)和 HIV 特异性 CD8+T 细胞用于 HIV 感染患者(Ochsenbein等，J.Exp.Med.; 2004 (200) 1407-1417)。
[0078]在体外初始DC介导的激发期间暴露于ASAL时，在再刺激后，抗原激发T细胞经历增殖增加和细胞凋亡降低。因此，本发明也涉及如果在疫苗接种前和/或疫苗接种期间过继转移回患者，用于基于疫苗接种而增强次级T细胞应答的方法。
[0079]本发明也提供用于改善病毒疫苗治疗的方法。许多病毒表达可以潜在作为用于被免疫系统破坏的靶的外源抗原。病毒疫苗在受试者中产生包含体液成分和细胞成分的全身病毒特异性免疫反应。所述反应通过皮下、肌内或经ロ施用疫苗组合物由受试者自身免疫系统引发。抗体或免疫细胞结合病毒抗原并裂解病毒。然而，在疫苗接种被病毒感染折磨的患者时，仍然需要増加T细胞应答性。因此，在疫苗接种前或疫苗接种时，过继转移预活化的具有高増殖潜力的细胞凋亡抗性病毒特异性T细胞可以增强体内疫苗介导的免疫反应。
[0080]根据本发明的组合物可以与治疗性抗病毒疫苗组合施用。
[0081]通过本发明的方法获得的细胞可以直接施用于生物体，如人，以在抗原特异性T细胞活化时增加其増殖和存活。这些细胞，常常与药学可接受的载体以用于将细胞引入最终与哺乳动物血液或组织细胞接触的任何途径施用。
[0082]适合用于肠胃外施用，例如通过静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂和载体包括含水等渗无菌注射溶液以及含水和非含水无菌悬浮液，所述含水等渗无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使所述制剂与预接受者的血液等渗的溶质，所述含水和非含水无菌悬浮液可以包括悬浮剂、增溶剤、增稠剂、稳定剂和防腐剤。静脉内施用是施用本发明的CD4+和/或CD8+T细胞的优选方法。
[0083]在本发明的上下文`中，施用于患者的⑶4+和/或⑶8+T细胞的剂量应当足以增强患者的免疫反应。因此，向患者施用足以引起对病毒抗原有效的免疫反应和/或减轻、降低、治愈或至少部分阻止疾病的症状和/或并发症的量的细胞。足够达到所述效果的量被定义为“治疗有效剂量”。所述剂量通过产生的细胞的活性和患者的状況，以及待治疗的患者的体重或表面积确定。在确定在治疗或预防疾病中待施用的细胞的有效量时，医生需要评价疾病的进展和针对任何相关病毒抗原的免疫反应的诱导。
[0084]本发明包含上述公开的实施方式的任意组合。
[0085]本发明通过下述非限制性实例进行进ー步说明。
[0086]实施例
[0087]实施例1.⑶70的表达
[0088]材料和方法:在组织培养瓶中通过在无血清X-VIV015培养基中以1:1的比例，将来自健康血液供体的Y射线照射的PBMC与来自同种异体供体(相对于健康血液供体)的未照射的PBMC共培养5-7天，在标准单向混合淋巴细胞反应(MLR)中产生同种异体致敏的同种异体淋巴细胞(ASAL)。对于未成熟DC的增埴,在密度梯度(Lymphoprep, Nycomed,奥斯陆，挪威)上分离获自健康血液供体的外周血单核细胞(PBMC)。分离的PBMC在AM-V培养基(Invitrogen，佩斯里，英国)中重新悬浮，以2.5X IO6个细胞每孔铺在24孔塑料培养板中，并使其粘附2小吋。除去非粘附的细胞，并将剰余的粘附的单核细胞在添加重组人 GM-CSF 和 IL-4 (R&D Systems, Abingdon,英国；均为 1，000U/mL)的AM-V培养基中培养4-6天。在孵育的最后24小时，通过添加含有IFN-a (3，000U/mL)、IFN- y (I, 000U/mL)、TNF- a (50ng/mL)、IL-1 ^ (25ng/mL)(均来自 R&D Systems)和 p_1:C(Sigma-Aldrich; 20 u g/mL)的培养基诱导未成熟DC的成熟。
[0089]通过FACS分析确定，成熟的DC群均含有70%以上的CD83+DC。
[0090]洗涤后，成熟的DC与同种异体致敏的未照射的或Y射线照射(25Grey)的同种异体淋巴细胞在X-VIV015培养基中共培养24小吋，并通过FACS进行分析。通过在无血清培养基(X-VIV015)中用Y射线照射的PBMC作为刺激细胞和未照射的PBMC作为应答细胞进行原代单向MLR5-6天，进行同种异体反应性淋巴细胞的致敏。PE结合的抗人CD70抗体用于FACS研究。
[0091]结果:如图1所示，已经在常规MLR中针对照射的PBMC被激发的同种异体淋巴细胞(同种异体致敏的同种异体淋巴细胞，ASAL)显著增强了相对于在MLR中使用的照射的PBMC为自体的成熟单核细胞来源的DC上⑶70的表达。
[0092]如图2所示，类似地，Y射线照射的同种异体淋巴细胞增强了⑶70的表达。
[0093]如图3、4和5所示，成熟DC与致敏的同种异体淋巴细胞的共培养诱导大量产生IL-12、IFN-Y 和 IL-2。
[0094]实施例2
[0095]材料和方法:參见实施例1的材料和方法。
[0096]在共培养DC、照射的同种异体致敏的淋巴细胞和PBMC (相对于DC为同种异体的)6天后，(用抗体包被的磁珠进行阴性选择)分离CD8+淋巴细胞，然后用B细胞(相对于在初次刺激期间使用的DC为自体的)再刺激，对CD27的表达和膜联蛋白V染色。用FACS进行随后的分析。
[0097]结果:如图6所示，在用B细胞再刺激CD8+细胞时，在初次刺激期间加入同种异体致敏的淋巴细胞大大增加了 CD27的表达。
[0098]当用B细胞再刺激CD8+细胞时，在初次刺激期间加入同种异体致敏的淋巴细胞大大降低了膜联蛋白V (细胞凋亡标记物)的表达(參见图7)。
[0099]实施例3
[0100]材料和方法:參见实施例2的材料和方法。
[0101]在用B细胞再刺激之前，将激发和分离的⑶8+细胞用3H-胸苷脉沖。
[0102]结果:如图8所示，在再刺激后，在初次刺激期间加入同种异体致敏的淋巴细胞强烈地增加了⑶8+细胞的增殖反应(通过掺入3H-胸苷測定，cpm/min，第3天)。
[0103]实施例4
[0104]材料和方法:參见实施例3的材料和方法。
[0105]在共培养B细胞和预活化的⑶8+细胞2天后，收集培养上清液，通过常规ELISA(R&D Systems)分析 IFN-Y 的产生。
[0106]结果:图9示出再刺激后，在初次刺激期间加入同种异体致敏的淋巴细胞大大增加了⑶8+细胞的IFN-Y的产生。
[0107]实施例5 =ASAL増加了在初次体外刺激后产生的抗原特异性CD8+T细胞的频度
[0108]材料和方法:使用密度介质分离来自健康血液供体的外周血单核细胞(PBMC)，并且根据标准程序使用单克隆抗体和流式细胞术对HLA-A2进行分型，并冷冻。解冻后，将PBMC在塑料孔中孵育，以通过塑料吸附富集单核细胞，在漂洗掉非粘附的细胞后，在含有GM-CSF和IL-4的细胞培养基中孵育5天。然后将未成熟DC在细胞因子混合物(含IL-1 ^、TNF- a、IFN- a和INF- y )和来自CMV、EBV和甲型流感病毒的抗原重叠MHC I类结合肽的混合物(PX14ProMix CEF pool (标准)；来自Proimmune LTD,牛津,英国的肽文库。这种混合物不限于ー种HLA类型)中孵育48小时(DC的成熟以及用抗原肽脉冲)。
[0109]平行地，在混合白细胞反应(MLR)中产生活化的同种异体PBMC，其中PBMC来自不同的血液供体。在第7天，解冻新ー批的PBMC，并如上所述，用脉冲的DC和活化的同种异体PBMC扩增7天。然后将细胞在含有IL-2的细胞培养基中孵育7天使T细胞受体在细胞表面重新出现(在活化期间T细胞内化它们的受体)。然后(如上所述)将细胞用脉冲的DC再刺激，I小时后进行五聚体染色，以及24小时后，根据制造商的说明进行IFN-Y形成细胞的测定(用于人IFN-Y的ELISpot PLUS，Mabtech，斯德哥尔摩，瑞典)。病毒特异性细胞的数目测定为IFN-Y点每加入的IO6个细胞。加入藻红蛋白结合的五聚体A*02:01-NLVPMVATV(用于 CMV)、A*02:01-GLCTLVAML (用于 EBV)和 A*02:01-NLVPMVATV (用于甲型流感病毒)(均来自Proimmune Ltd)，在室温下黑暗温育10分钟后，加入针对⑶3和⑶8的单克隆抗体(来自BD Biosciences, San Jos6，CA，美国)。在冰上黑暗孵育20分钟后，将细胞在流式细胞仪(FACSCanto，使用FACDdiva软件，BD Biosciences)中分析。病毒特异性T细胞的频度表示为％的⑶8阳性细胞。
[0110] 結果:结果示于图10和下表1中。
[0111]在用活化的同种异体细胞扩增和在无活化的同种异体细胞的对照培养物中孵育后，病毒特异性CD8阳性细胞(分别对CMV、EBV或A型流感病毒特异)的频度升高。如图10中所示。
[0112]表1.显示在用活化的同种异体PBMC扩增后的病毒特异性细胞的频度(表示为IFN-Y点每IO6个细胞)
[0113]
实验 _IFN-Y 产生(細胞/IO6) ( ELISPOT )—
用活化的同种异体PBMC扩增并用脉>5000
冲的DC再刺激的CMV特异性细胞__
无活化的同种异体PBMC扩增并用脉250
冲的DC再刺激的CMV特异性细胞__
用活化的同种异体PBMC扩增并用脉60*
冲的DC再刺激的非病.特异性细胞
[0114]*仅DC给出68个细胞/IO6的背景
[0115]虽然文中详细公开了特定实施方式，其已经通过实施例方式仅用于说明目的完成，并且不意于限制随后所附权利要求的范围。具体而言，本发明的发明人预期可以对本发明进行多种替代、改变和修饰而不背离权利要求所限定的本发明的实质和范围。
【权利要求】
1.ー种体外用于激发适合施用于病毒感染患者的抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞的方法，所述方法包括共培养来自待治疗患者的靶T细胞、单核细胞来源的树突细胞、病毒材料或病毒相关蛋白质或肽、以及针对相对于淋巴细胞为同种异体的抗原呈递细胞(APC)上的MHC I类和/或MHC II类抗原致敏的淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述致敏由包括培养非増殖抗原呈递细胞与外周血单核细胞(PBMC)的混合白细胞反应诱导，其中，所述PBMC相对于非增殖抗原呈递细胞是同种异体的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞选自由PBMC和单核细胞来源的树突细胞组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述单核细胞来源的树突细胞来自患者或来自健康供体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，通过首先在包含GM-CSF和IL-4的组合物中培养单核细胞约1-7天以获得未成熟树突细胞，以及随后加入能使未成熟树突细胞成为成熟树突细胞的第二組合物通过培养至少约12小吋，获得单核细胞来源的树突细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二組合物包含TNFa、IL-1 P、干扰素Y、干扰素a或0和TLR3配体 ，如聚1: C和/或TLR4配体。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二組合物包含TNFa、干扰素Y、TLR3配体和/或TLR4配体和TLR7和/或TLR8激动剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述TLR3配体是聚1:C，所述TLR8激动剂是R848。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述感染材料或感染相关蛋白质或肽选自由来自患者的灭活病毒颗粒、与患者的病毒相同类型的同种异体病毒颗粒、以及已知的分离的和纯化的病毒蛋白质或肽组成的组。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述病毒材料为通过用编码病毒蛋白质的mRNA转染而负载至成熟树突细胞中的病毒蛋白质。
11.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，所述细胞培养至少约20天，优选约6-20天，更优选约8-14天。
12.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，向细胞培养物中加入抗CD3抗体和/或外源性 IL-2、IL-7、IL-15、抗 IL-4 和/或 IL-21。
13.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，通过将激发的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞与新树突细胞、新致敏的淋巴细胞一起培养和任选地向细胞培养物中加入抗⑶3抗体和/或外源性IL-2、IL-7、IL-15、抗IL-4和/或IL-21再刺激激发的抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞。
14.根据上述权利要求任一项所述的方法，其中，所述病毒感染为慢性病毒感染。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述慢性病毒感染选自由HIV、HBV、HCV、CMV和EBV组成的组。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法获得的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。
17.适合施用于患者的抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞，其中所述⑶4+和/或⑶8+T细胞: 一具有増殖能力但不会快速达到细胞凋亡 一表达低水平的膜联蛋白V，和/或 一在其细胞表面表达⑶27和/或⑶28。
18.根据权利要求16或17所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞作为药物。
19.根据权利要求16或17所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞用于治疗病毒感染或用于在人中引发抗病毒免疫学反应。
20.根据权利要求19所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，其中，所述CD4+和/或CD8+T细胞与治疗性病毒疫苗组合施用。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，其中，在第一次刺激后施用所述⑶4+和/或CD8+T细胞。
22.根据权利要求18-20中任一项所述的抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞，其中，在再刺激后施用所述CD4+和/或CD8+T细胞。
23.根据权利要求16或17任一项所述的抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞的用途，用于制备药物。
24.根据权利要求16或17任一项所述的抗原特异性⑶4+和/或⑶8+T细胞的用途，用于制备用于治疗慢性病毒感染的药物或用于引发人中抗病毒免疫学反应的药物。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述CD4+和/或CD8+T细胞与治疗性抗病毒`疫苗组合施用。
26.根据权利要求24-25中任一项所述的用途，其中，在第一次刺激后施用所述CD4+和/或⑶8+T细胞。
27.根据权利要求24-25中任一项所述的用途，其中，在再刺激后施用所述CD4+和/或⑶8+T细胞。
【文档编号】A61K39/12GK103533955SQ201280018223
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年4月12日 优先权日:2011年4月13日
【发明者】亚历克斯·卡尔松-帕拉, 安娜-卡林·瓦尔格伦, 本特·安德松 申请人:因缪尼卡姆股份公司