低过敏原的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用作低过敏原的突变体多肽。更具体地，本发明提供了突变体Bet?v1蛋白和此类多肽用作用于使桦树花粉过敏症脱敏的低过敏原的用途。此外，本发明提供了包含此类多肽的疫苗制剂；此类制剂的用途；以及抵抗桦树花粉过敏症而进行免疫接种的方法。
【专利说明】低过敏原
发明领域
[0001]本发明涉及可用作低过敏原的突变体多肽。更具体地，本发明涉及特定的突变体Bet vl多肽以及此类多肽作为用于使桦树花粉过敏脱敏的低过敏原的用途。此外，本发明涉及包含此类多肽的疫苗制剂；此类制剂在免疫接种中的用途；以及抵抗桦树花粉过敏而进行免疫接种的方法。
[0002]发明背景 [0003]过敏是由对通常无害的蛋白质、过敏原的免疫反应引起的。过敏性疾病在世界范围内正在达到流行病的比例。工业化国家超过25%的人口患有I型过敏并且数量正在稳定增加。桦树花粉过敏是I型过敏的非常常见的形式。Bet vl是桦树花粉的主要过敏原。更多关于Bet vl过敏原、其异构过敏原和变体的信息,见于WHO网站www.allergen, org。
[0004]I型过敏基于免疫球蛋白E(IgE)抗体的形成。当过敏原分子结合两个结合至肥大细胞或嗜碱细胞表面上的受体的IgE抗体并且诱导IgE-Fc ε RI复合物的交联时，症状发生。这触发了生物介质(例如组胺和引起炎症反应和症状(例如过敏性哮喘、鼻炎、食物和皮肤过敏以及甚至过敏性反应)的脂质介质)的脱粒。
[0005]IgE是由两个相同的轻链和重链组成的大分子。在IgE的重链中存在5个结构域:VH、C ε 1、C ε 2、C ε 3和C ε 4。完整IgE分子的大小为约200kDa。结合至其Fe ε RI受体的C ε 2-C ε 4片段以及C ε 2-C ε 4片段的晶体结构已被测定(Garman等人，Nature2000 (406): 259-266，和 Wan 等人，Nature Immunology, 2002 (3): 681-686)。
[0006]最近几年，已测定了大量不同过敏原的三维结构。在结构上，这些过敏原变化相当大，并且还未鉴定出可解释过敏原引起IgE抗体产生的能力的共同结构基序。然而，有研究表明过敏原性仅限于少数蛋白质家族，因而提出蛋白质的结构特征也可在过敏原性方面起作用的证据(Jenkins 等人，J Allergy Clin.1mmunol.2005 (115): 163-17O; Raudauer 等人，J Allergy Clin Immunol.2008 (121): 847-852; Rouvinen 等人，PloS0NE2010(5):e9037)。
[0007]当研究过敏原性时关键的问题包括所谓的B细胞表位、过敏原的IgE抗体结合位点。然而，不幸地，该B细胞表位不能直接从过敏原的三维结构推导出来。此外，在被个体患者的IgE识别的确定的过敏原的表位中存在差异。因此，通过使用各种技术和各种基础，例如通过分析与来自过敏症患者的多克隆IgE血清混合物反应的过敏原性片段或肽、过敏原的定向诱变、使用表位模拟物(模拟位)和生物信息学建模研究来搜寻B细胞表位。然而，迄今，还不存在任何过敏原的优势表位的一般性图谱。
[0008]关于桦树花粉，例如，Holm等人(The Journal ofImmunology2004(173):5258-5267)产生了包含4和9个点突变体的Bet vl突变体，其目的在于操作“选择的区域”中的表面拓扑学。此论文未描述该“选择”是如何作出的。具有4个氨基酸置换的突变体代表分子表面上的3个不同区域，而具有9个氨基酸置换的突变体代表分子表面上5个不同的区域。这些Bet vl突变体在一些情况下具有减弱的结合人血清IgE和触发人嗜碱细胞组胺释放的能力。它们还能够诱导抗未突变的Bet vl的IgG抗体。
[0009]其它经修饰的重组过敏原也已被报导:
[0010]国际专利公布W002/40676和W003/096869公开了桦树花粉过敏原Bet vl的许多突变体形式。这些突变体是通过基于对Bet vl多肽的保守表面结构的序列分析、在推定的IgE结合位点引入随机突变体而产生的。W003/096869公开了使用过敏原表面上的不同“小组(small group) ”上的4个主要突变。 [0011]国际专利公布W02007/073907公开了在氨基酸位置54、115或123处包含3个氨基酸置换或缺失的Bet vl多肽。没有证据显示这些突变体具有降低的组胺释放能力。
[0012]国际专利公布W02009/024208公开了在氨基酸100-125的区域中具有至少4个突变的Bet vl突变体。然而，由于这些突变，多肽的三维结构丧失了，并且没有经报导的组胺释放活性。
[0013]国际专利公布W02008/092992公开了通过修饰非连续致敏性表位(即致敏性物质上具有600-900 A的区域的扁平表面)上的氨基酸残基来阻断致敏性物质的I型表面相互作用的方法，并且提示可相应地制备低过敏原性桦树花粉蛋白。
[0014]Niemi 等人，Structure2007 (15): 1413-21，公开了一 个与 Laver 等人，Celll990(61):553-556的公开内容一致的搜索特定过敏原表位的方法，其声称用于测定任何过敏原的完整表位的唯一合理方法包括测量与IgE抗体复合的过敏原的晶体结构。Niemi等人公开了与β乳球蛋白(BLG)复合的IgE Fab片段的晶体结构。他们还显示了两个IgE/Fab分子是如何结合二聚体BLG的以及当与已知IgG表位结构相比较时IgE表位是不同的，其是位于β折叠区中的“扁平”表面。
[0015]Rouvinen等人，PloS 0ΝΕ2010 (5): e9037使用与天然质谱法组合的生物信息学方法研究了过敏原的二聚体结构的作用。(电喷雾傅里叶变换离子回旋共振质谱，ESIFT-1CR-MS)。对55个已知的过敏原晶体结构的ES1-MS测量显示其80%以对称二聚体或寡聚体存在于晶体中并且大部分是在高蛋白质浓度下形成的瞬时二聚体。利用主要作为二聚体存在的来自牛奶的重组过敏原β乳球蛋白(rBos d5B)和主要作为单体存在的其突变体H146P研究了二聚体结构与过敏原性之间可能的关系。当与天然Bos d5B和重组Bos d5B相比较时，对于单体rBos d5B突变体H146P观察到在某种程度上降低的组胺释放能力。尽管作者得出二聚化对于过敏原可以是非常常见且基本的特征并且一般性地提示了过敏原的纯单体变体的制备可打开特异性免疫疗法的新的可能性，但结构特征在过敏原性中的最终作用仍然未知。根据体外晶体分析不能得出关于过敏原分子如何在人体中即体内表现的直接结论。
[0016]如今，治疗所有过敏性症状的趋势是朝向利用过敏原-特异性脱敏作用主动诱导耐受性而非避免过敏原，所述避免过敏原通常是不可能的或仅仅治疗症状。目前的脱敏疗法基于从天然来源纯化的过敏原，其中批次间变化可导致与发现和维持治疗的正确剂量和效率相关的问题。这些问题可导致过敏性副作用和对新过敏原的致敏作用的潜在风险。
[0017]重组过敏原用于脱敏的用途将消除与批次间变化相关的不利方面，并且最早的重组过敏原处于临床试验中(Valenta等人，Annu Rev Immunol2010 (28): 211-41)。此类过敏原在临床中的效率从而仍待观察。
[0018]存在对安全高效的疫苗和治疗产品的公认和巨大的需要，以应对日益增加的过敏的医疗问题。目前，对过敏的安全高效的疗法的市场开发不足。
[0019]发明概述
[0020]本发明涉及基于SEQ ID NO:3中所示的野生型氨基酸序列模板或其任何其它Betvl野生型同种型的重组低过敏原性桦树花粉Bet vl多肽，所述多肽天然地或通过突变包含: [0021](I)在选自氨基酸残基E101、K80、N82、S84、S99、SI 17和Kl 19的位置上的至少一
个第一氨基酸置换，和
[0022](2)在选自氨基酸残基吧8、025、财3、646、财7和￥158的位置上的至少一个第二
氨基酸置换。
[0023]本发明还涉及上文中定义的用作用于对桦树花粉脱敏的疫苗的低过敏原性多肽。
[0024]本发明还涉及包含至少一种上文中定义的低过敏原性多肽和至少一种药学上可接受的佐剂的疫苗组合物。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗用于舌下施用。
[0025]本发明还涉及抵抗桦树花粉过敏而进行免疫接种的方法，所述方法包括以有效地诱导脱敏和诱导产生抗桦树花粉的保护性抗体的量，给患有桦树花粉过敏症的受试者施用上文中定义的低过敏原性多肽或疫苗组合物。
[0026]当与Bet Vl野生型的组胺释放能力相比较时，根据本发明的低过敏原性多肽具有降低至少20倍的组胺释放能力。在一个实施方案中，所述多肽具有降低至少100倍的组胺释放能力。
[0027]附图概述
[0028]在下文中，参考附图，通过优选实施方案更详细地描述本发明，其中
[0029]图1举例说明Bet vl的推定的IgE表位残基(红色的残基)和参与在实施例1中衍生的Bet vl的二聚化的推定的残基(紫色的残基)；
[0030]图2是用于产生重组过敏原的细菌表达单位的示意图,其中Ptac是启动子，PelB是连接于重组过敏原的编码区的信号序列，星号显示氨基酸置换位点；
[0031]图3是Bet vl的36个同种型的氨基酸序列比对；
[0032]图4显示实施例2中使用的Bet vl野生型多肽(A, SEQ ID NO:1)和N28K-E101K多肽(B, SEQ ID NO:2)的核酸序列；
[0033]图5显示重组Bet vl和Bet vlN28K_E101K多肽对血清IgE与Bet vl结合的竞争性抑制；和
[0034]图6显示用重组Bet vl和Bet vlN28K_E101K多肽进行的组胺释放实验的结果；
[0035]图7显示浓度为3 μ M的重组Bet vl野生型和重组Bet vl突变体N28K-E101K的天然ESI FT-1CR质谱。
[0036]发明详述
[0037]在下列描述、实施例和权利要求中，三字母和单字母代码均用于氨基酸。参见，例如，IUPAC-1UB联合委员会关于生化名称命名委员会.Nomenclature and Symbolism forAmino Acids and Peptides.Eur.J.Biochem.138:9-37(1984)?
[0038]如下举例说明根据本发明的多肽中的氨基酸位点的命名:N28意指在位置28上存在天冬酰胺残基，而N28K意指位置28上的天冬酰胺残基已被赖氨酸残基替代。相应地，ElOl意指在位置101上存在谷氨酸残基，而E101K意指位置101上的谷氨酸残基已被赖氨酸残基替代等。
[0039]桦树花粉过敏是过敏的非常常见的形式，白桦树(疣皮桦(Betula verrucosa))的花粉是欧洲和北美的I型过敏反应的主要原因之一。据估计约10-15%的人口可患有桦树花粉过敏。此外，其它过敏原(例如苹果过敏原)与桦树花粉特异性IgE交叉反应，从而即使当受试者未经受花粉时亦引起过敏反应。 [0040]Bet vl是桦树花粉的主要过敏原,其在超过95%的桦树花粉过敏性受试者中负责IgE结合。Bet vl是具有17kD的分子量的蛋白质。野生型Bet vl的氨基酸序列示于SEQID NO: 3中。WHO过敏原网站(www.allergen, org)列出了 Bet vl的三十六个(36)同种型，图3显示了所述同种型的序列比对。此比对显示出Bet vl是高度保守的。在本发明中用作野生型Bet vl的同种型模板来自同种型Bet via (Bet vl.0101),但这些异构过敏原中的任一种均在适当时可用于提供根据本发明的低过敏原性多肽变体。
[0041]全部36个Bet vl同种型的氨基酸序列如下分别地公开于序列表中:1.0101 (SEQID NO:3)、1.0102(SEQ ID NO:4)、1.0103(SEQ ID NO:5)、1.2501 (SEQ ID Ν0:6)、1.1501 (SEQID NO:7)、1.1502 (SEQ ID NO:8)、1.2801 (SEQ ID N0:9)、1.3001 (SEQ ID NO:10),1.2901 (SEQ ID NO: 11)、1.2301 (SEQ ID NO: 12)、1.0501 (SEQ ID NO: 13)、1.0601 (SEQID NO:14)、1.0602(SEQ ID NO:15)、1.0801 (SEQ ID NO:16)、1.1701(SEQ ID NO:17),1.0401 (SEQ ID NO: 18)、1.0402 (SEQ ID NO: 19)、1.0701 (SEQ ID NO: 20)、1.1001 (SEQID NO: 21)、1.2401 (SEQ ID NO: 22)、1.2601 (SEQ ID NO: 23)、1.2701 (SEQ ID NO: 24)、1.2201 (SEQ ID NO: 25)、1.0201 (SEQ ID NO: 26)、1.0901 (SEQ ID NO: 27)、1.0301 (SEQID NO:28)、1.1401(SEQ ID NO:29)、1.1402(SEQ ID NO:30)、1.1901(SEQ ID N0:31)、1.2001 (SEQ ID NO:32)、1.1801(SEQ ID NO:33)、1.1101(SEQ ID NO:34)、1.1201(SEQ IDNO:35),1.1601(SEQ ID NO:36)、1.2101(SEQ ID NO:37)和 1.1301(SEQ ID NO:38)。
[0042]Bet vl的同种型包括具有不同的致敏性潜能的变体。Bet vl的同种型与SEQ IDN0:3的Bet vl野生型氨基酸序列具有至少94%的同一性。例如，与Bet vl.0101具有96%的氨基酸残基同一性的同种型Bet vl.0401和与Bet vl.0101具有至少94%的残基同一性的Bet vl.1001已被鉴定为天然低过敏原，因为它们是介质释放的弱诱导物。与Bet vl.0101相比较，Bet vl.1001包含例如N28K突变。它们也已被认为达到代表出色疫苗候选者的标准。(Wagner 等人，J.Allergy Clin Immunol2008; 121:725-735)。然而,科学、实验或临床数据是不可获得的。
[0043]本发明提供了 Bet Vl的突变的低过敏原性变体，其可用作疫苗用于免疫接种有此需要的受试者，从而预防和/或减轻过敏和使患有桦树花粉过敏的受试者脱敏。
[0044]根据本发明的重组桦树花粉Bet Vl多肽具有野生型氨基酸序列，但它们在所选的氨基酸位置上包含突变以减弱或完全消除它们诱导IgE产生的能力，但保留它们诱导保护性IgG抗体产生的能力，即，它们是低免疫原性的。
[0045]具体地，本发明涉及基于如SEQ ID NO:3中所示的野生型氨基酸序列模板或其任何其它Bet vl野生型同种型的氨基酸序列的重组低过敏原性桦树花粉Bet vl多肽，所述多肽天然地或通过突变包含:
[0046](I)在选自氨基酸残基E101、K80、N82、S84、S99、SI 17和Kl 19的位置上包含至少
一个第一氨基酸置换，和[0047](2)在选自氨基酸残基吧8、025、财3、646、财7和￥158的位置上包含至少一个第
二氨基酸置换。
[0048]在一个实施方案中，本发明的多肽具有如SEQ ID NO:3中所示的野生型氨基酸序列的模板。在另一个实施方案中，本发明的多肽具有选自SEQ ID NO:4-38的野生型氨基酸序列的模板。
[0049]在本发明的一个实施方案中，重组低过敏原性桦树花粉Bet vl多肽由SEQ IDNO:39中所示的氨基酸序列代表。SEQ ID NO:39公开了具有用于氨基酸置换的位置(氨基酸位置 25、28、43、46、47、80、82、84、99、101、117、119、158)的 Bet vl 多肽序列，并且还公开了这些位点上的野生型氨基酸。 [0050]在任何所示的位置处的第一和第二置换的任何组合产生低过敏原性多肽。在本发明的一个实施方案中，所述多肽包含选自SEQ ID N0:41-47的氨基酸序列或其同种型，和至少一个在选自氨基酸残基N28、D25、N43、G46、N47和Y158的位置上的第二氨基酸置换。优选地，所述多肽具有选自SEQ ID N0:41-47的氨基酸序列或其同种型，和至少一个在选自氨基酸残基吧8、025、财3、646、财7和￥158的位置上的第二氨基酸置换。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含选自SEQ ID NO:41 (其中氨基酸101是K)、SEQ ID NO:42 (其中氨基酸80是Y)、SEQ ID NO:43 (其中氨基酸82是K)、SEQ ID NO:44 (其中氨基酸84是K)、SEQ ID NO:45 (其中氨基酸 99 是 K)、SEQ ID NO:46 (其中氨基酸 117 是 K)和 SEQ IDNO:47 (其中氨基酸119是E)的氨基酸序列；和至少一个在选自氨基酸残基N28、D25、N43、G46，N47和Y158的位置上的第二氨基酸置换。优选地，所述多肽具有选自SEQ ID NO:41(其中氨基酸101是K)、SEQ ID NO:42 (其中氨基酸80是Y)、SEQ ID NO:43 (其中氨基酸82 是 K)、SEQ ID NO:44 (其中氨基酸 84 是 K)、SEQ ID NO:45 (其中氨基酸 99 是 K)、SEQID NO:46 (其中氨基酸117是K)和SEQ ID NO:47 (其中氨基酸119是E)的氨基酸序列；和至少一个在选自氨基酸残基N28、D25、N43、G46、N47和Y158的位置上的第二氨基酸置换。SEQ ID N0:41公开了 Bet vl多肽序列，其中位置101上的氨基酸是置换而非野生型氨基酸E0类似地SEQ ID NO:42-47显示了 Bet vl多肽，其中位置80、82、84、99、117和119上的氨基酸分别是置换而非野生型氨基酸。
[0051 ] 在本发明的一个实施方案中，所述至少一个第一氨基酸置换位于选自氨基酸残基ElOl和S99的位置上,并且所述至少一个第二氨基酸置换位于选自氨基酸置换N28和D25的位置。
[0052]在本发明的另一个优选的实施方案中，所述至少一个第一氨基酸置换位于位置ElOl上，并且所述至少一个第二氨基酸置换位于位置N28上。在本发明的一个优选实施方案中，重组低过敏原性桦树花粉Bet vl多肽由SEQ ID N0:40中所示的氨基酸序列表示。SEQ ID NO:40显示在位置28和101上具有置换的Bet vl多肽序列，这些位置上的氨基酸是赖氨酸⑷。
[0053]本发明的低过敏原性多肽变体还包含含有超过一个第一和第二置换的变体。术语“至少一个第一置换”和“至少一个第二置换”意指所述第一和第二置换可各自包含1、2、3或4或更多个置换，并且第一和第二置换的任何组合都是可能的，只要低过敏原性Bet vl多肽诱导保护性抗体反应的能力保留。因此在本发明的一个优选实施方案中，第一氨基酸置换在位置ElOl上包含置换,并且所述第二氨基酸置换在位置N28和D25上或位置N28、D25和Y158上。在本发明的另一个优选实施方案中，第一氨基酸置换在位置ElOl和S99上包含置换，并且所述第二氨基酸置换在位置N28上。在本发明的另一个优选实施方案中，所述第一氨基酸置换在位置ElOl和S99上，并且所述第二氨基酸置换在位置N28和D25上。
[0054]在本发明的其它优选实施方案中，Bet vl的置换是至少ElOl和N28、E101和D25、ElOl 和 N43、ElOl 和 G46、ElOl 和 N47、ElOl 和 Y158、K80 和 N28、K80 和 D25、K80 和 N43、K80 和 G46、K80 和 N47、K80 和 Y158、N82 和 N28.N82 和 D25、N82 和 N43、N82 和 G46、N82 和N47、N82 和 Y158、S84 和 N28、S84 和 D25、S84 和 N43、S84 和 G46、S84 和 N47、S84 和 Y158、S99 和 N28、S99 和 D25、S99 和 N43、S99 和 G46、S99 和 N47、S99 和 Y158、SI 17 和 N28、SI 17和 D25、S117 和 N43、S117 和 G46、S117 和 N47、S117 和 Y158、K119 和 Ν28、Κ119 和 D25、K119和N43、K119和G46、K119和N47或K119和Y158。在本发明的其它优选实施方案中，所述置换是这些组合之一。 [0055]在本发明的一个优选的实施方案中，总共存在至少2、3或4个氨基酸置换。优选地，本发明的多肽具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个置换。更优选地，所述多肽具有2、3或4个置换。本发明的优势之一是仅需要少数置换(至少2个)用于所需的效果。
[0056]根据本发明的多肽是低过敏原性的，并且当与相应的未突变的Bet vl野生型的组胺释放能力相比较时显示降低至少20倍，优选100倍的组胺释放能力。
[0057]根据本发明的低过敏原性多肽可用作抗过敏特别是桦树花粉过敏的疫苗。按照本领域技术人员已知的标准制药方案配制包含根据本发明的多肽的疫苗。根据本发明的疫苗特别适合于舌下施用。根据本发明的低过敏原性变体是通过突变位于Bet vl的表位表面上的所选特定氨基酸残基(例如具有大侧链的残基)而获得的。所选的氨基酸残基是其侧链向外指向溶剂的那些氨基酸残基。突变此类残基引起过敏原的基本三维结构的最小改变。然而，优选地，诱变修饰表位表面的程度使得肥大细胞表面上的IgE抗体的结合和交联被阻止或强烈减少，然而变体的总体结构仍然与野生型过敏原的总体结构十分相似。此类突变有利于对IgG和具有结合野生型过敏原和突变的变体过敏原的能力的其它保护性抗体的诱导。突变的作用被确定为过敏原特异性IgE抗体对经修饰的Bet vl过敏原的更低亲和力。优选地，突变使特异性IgE抗体的亲和力减小至少20倍，更优选20-100倍，最优选超过100倍。所产生的经修饰的Bet vl过敏原可用于诱发过敏性患者对桦树花粉的耐受性。
[0058]可用于过敏原特异性脱敏的根据本发明的低过敏原性变体多肽具有两个特征:1)强力减弱IgE介导的反应的能力；和2)保持的野生型3D折叠，从而保持诱导产生能够结合野生型过敏原的IgG抗体的能力。
[0059]IgE结合表位的结构的知识将极大地简化如上文中提及的低过敏原性变体的设计。然而，与IgE抗体复合的Bet vl的结构不幸地是不可获得的。被个体患者的IgE识别的确定的过敏原的表位中存在多少差异还是未知的。在表位扫描中使用肽也是不可靠的并且实际上仅当扫描线性表位时才有用(Niemi等人，Structure2007 (15): 1413-21)。单个肽的构象以及物理性质(例如溶解度)可与形成天然蛋白质结构的多肽链的相应部分的构象以及物理性质显著不同。因此，突变体Bet vl过敏原的设计是基于使用分子图形学程序(例如PyMOL)的分子表面分析，以通过制备和测试突变体来阐明表位的结构和测试潜在命中。此外，在设计中考虑了 Bet vl的二聚化的能力。[0060]Bet vl (蛋白质数据库代码1BV1)的晶体结构被用于定义Bet vl的四级结构。TOBePISA互联网服务器被用于创建Bet vl的对称二聚体的坐标。据估计肥大细胞表面上的簇中IgE抗体之间的距离为约5nm(KnoI, EF ;Mol.Nutr.Res.50 (2006):620)。通过研究距离对称轴2.5nm内的围绕二重对称轴的Bet vl 二聚体的分子表面，在Bet vl的分子表面(图1)上鉴定了两个推定的表位。
[0061]推定的表位由氨基酸残基V2-E6 ；R70-D75 ;N78_S84 ;E96_K103 和 K115-H121构成，而Bet vl 二聚体的单体-单体界面由氨基酸残基K20-K32、S39-P50、V74-H76和D156-N159 构成。 [0062]仔细分析了这些推定的表位，以鉴定可作为突变点的氨基酸残基。优选的突变点应当具有减小过敏原对IgE抗体的结合但仍然维持野生型过敏原的三维结构的能力。假定的表位包括氨基酸残基K80、N82、S84、S99、E101、S117和Kl 19。单体-单体界面包括残基D25、N28、N43、G46、N47和Y158。残基ElOl和N28被认为是最有趣的突变点，因为它们分别位于假定表位的中心和单体-单体界面上的策略性位置中。在本发明中，第一氨基酸置换存在于表位区域中并且第二氨基酸置换存在于单体-单体界面中。
[0063]这两个残基在Bet vl的全部36个同种型中高度保守。无天然变异存在于残基101中。天然变异见于残基28，其以天冬酰胺(在31个同种型中)、赖氨酸(在2个同种型中)或酪氨酸(在3个同种型中)存在。残基D25、N43、G46、N47、K80、S84、K119和Y158是保守的，而残基N82、S99和S117略有变化，如图3中显示的。
[0064]下一步骤是选择对于每一个残基的适当突变。作为实例，S99是小的亲水性和中性氨基酸残基。将干扰IgE结合的突变从而将具有“相反的”性质，即大的和/或带电荷的，例如Ser至Lys、Arg、Asp、Tyr和Val。类似地，ElOl和N28可被带相反电荷的残基(Lys>Arg)或疏水性残基(Tyr、Ile或Trp)替代。可相应地设计残基D25、N43、G46、N47、K80、N82、S84、S117和K119处的置换。表1列出了潜在的置换，所述置换可产生SEQ ID NO: 39中所示的根据本发明的Bet vl低过敏原性突变体。
[0065]表1.Bet vl的突变体
[0066]表位突变体
[0067]
【权利要求】
1.一种重组低过敏原性桦树花粉Bet Vl多肽，其基于SEQ ID N0:3中所示的野生型氨基酸序列模板或其任何其它Bet Vl野生型同种型的氨基酸序列，所述多肽天然地或通过突变包含: (1)至少一个在选自氨基酸残基E101、K80、N82、S84、S99、SI17和Kl 19的位置上的第一氨基酸置换，和 (2)至少一个在选自氨基酸残基吧8、025、财3、646、财7和Y158的位置上的第二氨基酸置换。
2.权利要求1的多肽，其中所述野生型氨基酸序列的模板是如SEQID N0:3中所示的。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽具有SEQID NO:39中所示的氨基酸序列。
4.权利要求1的多肽，其中所野生型氨基酸序列的模板选自SEQID NO:4-38.
5.权利要求1-4中任一项的多肽或其同种型，其中所述多肽包含选自SEQIDNO: 41-47的氨基 酸序列和至少一个在选自氨基酸残基N28，D25, N43, G46, N47和Y158的位置上的第二氨基酸置换。
6.权利要求1-5中任一项的多肽,其中所述多肽包含 选自下述的氨基酸序列: SEQ ID N0:41，其中氨基酸101是K， SEQ ID NO:42，其中氨基酸80是Y， SEQ ID NO:43，其中氨基酸82是K， SEQ ID NO:44，其中氨基酸84是K， SEQ ID NO:45，其中氨基酸99是K， SEQ ID N0:46，其中氨基酸117是K，和 SEQ ID NO:47，其中氨基酸119是E ; 和至少一个在选自氨基酸残基N28、D25、N43、G46、N47和Y158的位置上的第二氨基酸置换。
7.权利要求1-6中任一项的多肽，其所述至少一个第一氨基酸置换在选自氨基酸残基ElOl和S99的位置上，并且所述至少一个第二氨基酸置换在选自氨基酸残基N28和D25的位置上。
8.权利要求1-7中任一项的多肽，其中所述至少一个第一氨基酸置换在位置ElOl上，并且所述至少一个第二氨基酸置换在位置N28上。
9.权利要求8的多肽，其中所述多肽具有SEQID NO:40中所示的氨基酸序列。
10.权利要求1-9中任一项的多肽，与野生型BetVl的组胺释放能力相比，其具有降低至少20倍的组胺释放能力。
11.权利要求10的多肽，与野生型BetVl的组胺释放能力相比，其具有降低至少100倍的组胺释放能力。
12.前述权利要求中任一项的多肽，其中总共有至少2、3或4个氨基酸置换。
13.一种疫苗组合物,其包含至少一种权利要求1-12中任一项的低过敏原性多肽和药学上可接受的稀释剂或佐剂。
14.权利要求13的疫苗组合物，其中所述疫苗用于舌下施用。
15.一种重组桦树花粉Bet Vl多肽，其基于SEQ ID NO: 3中所示的野生型氨基酸序列模板或其任何其它Bet vl野生型同种型的氨基酸序列，所述多肽天然地或通过突变包含:(1)至少一个在选自氨基酸残基E101、K80、N82、S84、S99、SI17和Kl 19的位置上的第一氨基酸置换，和 (2)至少一个在选自氨基酸残基吧8、025、财3、646、财7和￥158的位置上的第二氨基酸置换， 以用作疫苗。
16.一种抵抗桦树花粉过敏而进行免疫接种的方法，所述方法包括以有效地对桦树花粉脱敏和诱导产生抵抗桦树花粉的保护性抗体的量，给患有桦树花粉过敏症的受试者施用权利要求1-14中任一项的低过敏原性多肽或疫苗组合物。
【文档编号】A61K39/36GK103649315SQ201280026275
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年4月18日 优先权日:2011年4月18日
【发明者】K·塔金纳恩, M-L·卢卡南, H·索德伦德, S·于尔海, H·霍尔克里, M·尼米南, J·詹妮丝, J·卢维南 申请人:国家技术研究中心Vtt