给药和治疗方法
【专利摘要】本发明涉及在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白-2(NF2)基因的基因产物，并且如果未检测到基因产物或同工型1基因产物，则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。本发明还涉及在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的NF2基因的功能性同工型1蛋白质或其功能性片段，并且如果未检测到基因产物或同工型1基因产物，则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。
【专利说明】给药和治疗方法
发明领域
[0001]本发明涉及治疗癌症的方法。
[0002]发明背景
[0003]粘着斑激酶(本文简称为FAK)是一种非受体蛋白酪氨酸激酶，其在粘着斑(focaladhesions)中具有信号传导和支架的功能。FAK是细胞粘附、迁移和存活的中心调节因子(central regulator)。因此，FAK抑制为治疗多种癌症提供了重要途径。在治疗中，将对FAK抑制剂无响应的患者与对FAK抑制剂响应的患者分开是重要的，以便可对无响应患者提供替代治疗。
[0004]附图简述
[0005]图1显示了通过蛋白质印迹法检测到的多种细胞系中NF2的基因产物(蛋白质)的蛋白质印迹检测图像。图1A显示多种NF2同工型，而图1B仅显示NF2的同工型I。
[0006]图2显示人细胞系NC1-H2052 (NF2突变株，其中未检测到merlin同工型I)和人细胞系MST0-211H(野生型NF2，其中检测到merlin同工型I)中FAK[图2A]和磷酸化的FAK(pFAK)[图2B]的蛋白质水平的蛋白质印迹检测图像。
[0007]图3显示在5种间皮瘤细胞系和I种肺细胞系中NF2的同工型l(merlin同工型I)的蛋白质基因产物的免 疫组织化学检测图像(左图为其中未检测到merlin同工型I的细胞；右图为其中检测到merlin同工型I的细胞)。
[0008]图4为按merlin同工型I状态分类的经化合物A治疗的患者的Kaplan-Meier无进展生存期图。
[0009]图5为经化合物A治疗的患者的治疗持续时间的条线图,其中标注了 HierTlin同工型I的状态。
[0010]图6为在经化合物A治疗的患者中，在最佳响应时的肿瘤测定中(研究者评估)，相对于基线的变化百分数的柱状图(其根据RECIST标准测定)，其中标注了 merlin同工型I的状态。
[0011]发明概述
[0012]本发明涉及在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白_2(NF2)基因的基因产物，且如果未检测到基因产物或同工型I基因产物，则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。本发明还涉及在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的NF2基因的功能性同工型I蛋白质或其功能性片段，且如果未检测到基因产物或同工型I基因产物，则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。
[0013]发明详述
[0014]在机体的组织和器官中，细胞外基质(ECM)为细胞结构(cellularorganization)提供环境和骨架。ECM和组织细胞间的相互作用在发育、内稳态、细胞生长和细胞存活的调控中起着重要作用。细胞和ECM间或细胞-细胞间的异常相互作用可导致结构改变，提高细胞迁移、侵袭和生长性质，最终导致人类疾病形成。癌症是失调的细胞迁移与生长发展成侵袭性和转移性疾病的人类疾病的最佳实例。
[0015]与ECM的细胞相互作用包括通过ECM组分衔接细胞受体的细胞粘附。ECM结合，或者更确切地说纤维结合蛋白结合至跨膜整合素家族的蛋白质，在该ECM-细胞界面处形成动态的蛋白质簇，通常被称为粘着斑复合体(focal adhesion complexes)(或粘着斑(focal contacts))。这些复合体将ECM与细胞骨架连接。在该界面处，结构和信号传导复合体的形成对该细胞具有重要的调节作用。据描述，许多具有支架和信号传导性质的蛋白质集中于粘着斑上。所述非受体蛋白酪氨酸激酶，粘着斑激酶(FAK)，也称为PKT2或蛋白酪氨酸激酶2，在粘着斑中具有信号传导和支架的功能，并且已显示作为该复合体、细胞粘附、迁移和生存的中心调节因子[1-3]。
[0016]FAK由研究者独立地发现，该研究者试图了解整合素依赖性细胞粘附的控制，以理解贴壁依赖性细胞生长以及在肿瘤细胞情况中的非贴壁依赖性细胞生长[4，5]。其它研究者探索v-src癌基因的基质以了解其转化机理。作为src在粘着斑中的基质和结合搭档，FAK的发现提供了对非贴壁依赖性细胞生长和保护免受细胞失巢凋亡的机理的初步了解[6，7]。多项研究已将FAK表达水平和/或活化状态与癌症生成和进展相关联。FAK的活化常常可通过磷酸化的FAK(pFAK)的水平，更确切地说可通过酪氨酸397 (FAK的自磷酸化位点，也是src的结合位点)磷酸化的pFAK的量推断。更高水平的pFAK与癌症的早期阶段向更晚期阶段转变相关，且重要的是，与转移性疾病相关[3，8，9]。
[0017]国际申请PCT/US2009/062163号，其国际申请日为2009年10月27日；国际公开W02010/062578号，其国际
【公开日】为2010年6月03日；公开并要求保护2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1Η-吡唑-5-基]氨基}_4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺(此后称为“化合物A”)，或其药学上可接受的盐，连同尤其是在癌症的治疗中用作FAK活性抑制剂的药学上可接受的盐，上述文献的全部公开内容引入本文作为参考，且其中化合物A为实施例41a的化合物。
[0018]国际申请PCT/US/2008003235号，其国际申请日为2008年3月10日，国际公开W02008/115369号，其国际
【公开日】为2008年9月25日，描述了用作FAK活性抑制剂的其它化合物，上述文献的全部公开内容引入本文作为参考。
[0019]化合物A正作为一项新的癌症治疗剂在人中进行测试。期望能够鉴别更可能对FAK抑制剂如化合物A响应的基因型和表型。
[0020]II型神经纤维瘤病(NF2)是一种遗传性癌症综合征，其由该NF2 (神经纤维瘤蛋白-2或merlin)基因的遗传性种系突变所导致。所述NF2基因为肿瘤抑制因子，且在NF2综合征中观察到肿瘤抑制功能异常或不存在。该综合征的特征在于患者发展神经系统肿瘤，包括神经鞘瘤、脑膜瘤和室管膜瘤。肿瘤的发展伴有剩余等位基因的体细胞失活。还在大部分散在的神经系统肿瘤中发现NF2基因的突变，突出了该肿瘤抑制因子在中枢神经系统癌症中的重要性[10]。此外，NF2的纯合突变(homozygous mutation)也在其它肿瘤类型中得以确认，这些肿瘤类型包括:恶性间皮细胞瘤(50%)、甲状腺肿瘤(17%)、膀胱肿瘤(11%)、皮肤肿瘤(5%)、胃肿瘤(5%)、骨肿瘤(3%)、肾肿瘤(2%)、乳腺肿瘤(2%)和肠道肿瘤(2%) [11]。而且最终，该NF2基因的蛋白质产物(常称为merlin)作为一种重要的神经胶质细胞生长调节因子已涉及调节src结合ErbB2并影响src_FAK通路[12]。这些观察表明merlin可在胶质母细胞瘤中起作用。
[0021]NF2基因的蛋白质产物最常被称为merlin，但也被称为神经纤维瘤蛋白-2。已描述Merlin的多个同工型，而同工型I和同工型2是最常见的[13]。据报道，同工型I隐匿NF2的肿瘤抑制活性并通过其它剪接外显子16和外显子17得到蛋白质的不同羧基端而与同工型2区别。多项研究已鉴定了与merlin相互作用的跨膜蛋白质和细胞内蛋白质，一些通过保守结构域，包括tr1-lobular amino terminal Four point one、埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(Radixin)、膜突蛋白(Moesin)(FERM)结构域相互作用。这些相互作用对于细胞骨架控制、细胞运动性和细胞侵袭是重要的。在HIPPO信号传导通路(在黑腹果蝇中阐释的哺乳动物中保守的通路)中，Merlin还与邻近的蛋白质发生相互作用[14]。HIPPO通路涉及细胞增殖、细胞存活和器官大小。这些细胞活性的HIPPO通路调控允许merlin对癌细胞生长和进展施加影响[13]。
[0022]恶性间皮细胞瘤是一种高度攻击性且致命性疾病，其通常与暴露于石棉相关
[15]。间皮瘤的特征为非常具有侵袭性，并且在约40-50%的病例中，通过染色体22ql2处的染色体变化，NF2基因突变或者丢失。显示在缺失NF2的间皮瘤细胞中merlin的强制表达(forced expression)抑制了细胞运动性以及侵袭性。也已显示merlin的再表达会降低FAK的磷酸化并中断与src和p85 (磷酸肌醇3-激酶的调节亚基)的结合。这些研究表明merlin的失活导致FAK活化并且其是间皮瘤发病机制中重要的一步[16]。
[0023]本发明发现一些NF2突变癌细胞或merlin阴性癌细胞比它们的野生型对应物对FAK抑制剂更敏感；因此，可通过基于患者的NF2突变状态或merlin同工型I表达状态，例如基于存在或不存在NF2 的基因产物如merlin同工型I蛋白对患者进行早期筛选以改善FAK抑制剂的有效性。
[0024]NF2基因和NF2基因突变
[0025]本发明涉及治疗癌症的方法，其包括向患有一种或多种NF2突变的癌症患者给药在药学上可接受的组合物中有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。本发明还涉及在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括向所述需要治疗的人给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述人经测定患有具有以下突变的癌症:至少一种神经纤维瘤蛋白2(NF2)突变，或导致可检测量的NF2基因的基因产物(例如merlin同工型I蛋白质)不存在的任何突变，或导致可检测量的NF2基因的功能基因产物(例如功能merlin同工型I蛋白质或其片段)不存在的任何突变。与无该类突变的患者相比，向患有具有以下突变的癌症的患者给药FAK抑制剂使得一种或多种症状增强:至少一种神经纤维瘤蛋白2 (NF2)突变，或导致可检测量的NF2基因的基因产物(例如merlin同工型I蛋白质)不存在的任何突变，或导致可检测量的NF2基因的功能基因产物(例如功能merlin同工型I蛋白质或其片段)不存在的任何突变。
[0026]野生型NF2基因(NM_000268和Gene ID:4771)的表达导致多基因产物即多种同工型的表达。例如，野生型NF2基因的表达导致至少NF2基因的同工型I和同工型2的表达。由于非野生型NF2基因具有一个或多个突变，该非野生型NF2基因的表达可导致NF2基因的一种或多种同工型的基因产物的表达不足。在一些实施方案中，NF2基因中的突变，即NF2突变，导致一种或多种基因产物或其片段不被表达成mRNA或蛋白质。在一些实施方案中，从需要癌症治疗的人获得的样品包含具有NF2突变的细胞，其中所述突变导致可检测的mRNA转录物，该mRNA转录物不翻译成蛋白质，该突变导致未成熟终止密码子(prematurestop codon)。在其它实施方案中，NF2突变导致mRNA和翻译蛋白质的表达不足，例如，由于染色体丢失或NF2基因的其它缺失导致的所述NF2突变。在其它实施方案中，所述NF2突变(例如，由于染色体丢失、NF2基因的缺失，或导致未成熟终止密码子的突变)，导致可检测量的NF2同工型I表达不足或不存在。
[0027]在另外的实施方案中，所述NF2突变导致由所述NF2基因表达的蛋白质的表达不足，其中所述蛋白质为肿瘤抑制因子的同工型。在另一实施方案中，未被表达的所述肿瘤抑制因子同工型为NF2同工型I。在另一实施方案中，NF2基因中的突变导致NF2同工型I基因产物的表达不足。在另外的实施方案中，突变NF2基因的同工型I蛋白质基因产物未被表达。在另一实施方案中，突变NF2基因的同工型I蛋白质基因产物不以可检测的量存在。在另外的实施方案中，NF2同工型I蛋白质基因产物的功能片段，即在体内或体外测量中保留肿瘤抑制活性的片段，不以可检测的量存在。
[0028]在其它实施方案中，NF2基因的基因产物可被表达，即以可检测的量存在，然而所述基因产物可能是非功能性的。基因产物的功能缺失可以任何方式发生，且包括突变。因此，本发明还涉及在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的NF2基因的功能性同工型I蛋白质或其功能性片段，并且如果未检测到基因产物或同工型I基因产物，则向该人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。
[0029]在一些实施方案中，如果在从人获得的癌症中检测到NF2突变，则向其给药FAK抑制剂。在本文的方法中，其中肿瘤抑制同工型的表达不足，例如NF2同工型I的表达不足，所述方法包括向患有癌症的人给药FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。一项实施方案为在有需要的人中治疗癌症的方 法，其包括检测所述癌症中NF2基因的一种或多种同工型的表达，并且如果未检测到肿瘤抑制同工型的表达，则给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。本文的另一实施方案为在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括获得所述癌症的一个或多个细胞的样品，检测所述样品中NF2同工型I的表达，并且如果未检测到所述NF2同工型1，则给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，其中未检测到NF2同工型I，所述检测为NF2基因的同工型I蛋白质基因产物的检测。本文的另一实施方案为在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括获得所述癌症的一个或多个细胞的样品，检测所述样品中存在或不存在NF2的同工型I和一种或多种其它同工型，并且如果未检测到同工型1，则给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。
[0030]在其它实施方案中，野生型NF2的同工型I表达于需要治疗癌症的人的肿瘤或其样品中。在另一实施方案中，所述NF2基因的野生型同工型I基因产物以可检测的量存在。在另一实施方案中，所述野生型NF2的同工型I的片段以可检测的量存在。在另一实施方案中，所述NF2基因的同工型I基因产物的片段为功能性片段，其中所述NF2的同工型I基因产物的片段保留了体外或体内或体内和体外的肿瘤抑制活性。在一些实施方案中，其中NF2的同工型I基因产物为蛋白质或其功能性片段，而且所述同工型I蛋白质以可检测的量存在于人的样品中，所述人经2-[ (5-氯-2- {[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐治疗，而且所述方法还包括加强对癌症的监测。在一些实施方案中，其中所述NF2同工型I基因产物为蛋白质或其功能性片段，而且所述同工型I蛋白质以可检测的量存在于人的样品中，所述人经2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1Η-吡唑-5-基]氨基}_4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺与其它抗癌剂组合治疗，而且所述方法还包括加强对癌症的监测。
[0031]在另一实施方案中，从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的NF2的同工型I基因产物用作生物标记，其中在所述样品中不存在可检测量的NF2同工型I表明所述人适用于用FAK抑制剂治疗。在另一实施方案中，从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的NF2的同工型I基因产物用作生物标记，其中所述基因产物为蛋白质，且其中所述样品中不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白2同工型I蛋白质表明所述人适用于FAK抑制剂治疗。在另一实施方案中，从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的NF2的同工型I基因产物如神经纤维瘤蛋白2同工型I蛋白质用作生物标记，其中所述样品中不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白2同工型I蛋白质表明所述人适用于用FAK抑制剂治疗，其中所述FAK抑制剂为2-[(5-氯-2-{[3-甲基_1_(1_甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺，且其中所述癌症治疗是针对间皮瘤的。
[0032]Merlin 同工型 I
[0033]NF2基因的蛋白质基因产物常被称为merlin (UniProt N0.P35240)，也被称为神经纤维瘤蛋白_2。因此，本领域的技术人员能够认识merlin同工型I蛋白质与神经纤维瘤蛋白-2同工型I蛋白质和NF2同工型I蛋白质相同。本领域已知所述NF2的同工型I蛋白质基因产物，或merlin同工型I蛋白质具有肿瘤抑制功能。Merlin同工型I蛋白质可被简写为merlin ;而merlin指的是merlin同工型I或多种同工型根据上下文应当是清楚的。本文中，不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质的细胞(例如肿瘤细胞)被称为“merlin阴性”。本文中，如果在癌或肿瘤中，或至少在一部分癌细胞中，例如一部分从需要治疗癌症的人获得的作为样品的癌细胞中，不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质，则所述癌为“merlin阴性癌”。本文中，不存在可检测量的功能性merlin同工型I蛋白质的细胞(例如肿瘤细胞)同样被称为merlin阴性。本文中，如果在癌或肿瘤中，或在至少一部分癌细胞中，例如一部分从需要治疗癌症的人获得的作为样品的癌细胞中，不存在可检测量的功能性merlin同工型I蛋白质，则所述癌也为merlin阴性癌。
[0034]如上所述，可由NF2基因中的突变导致不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质。可由异常转录或翻译，或多种转录后或翻译后加工(正常的和异常的)导致不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质。可由启动子或merlin同工型ImRNA转录必需的其它调节序列中的突变导致不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质。此外，可由于多种表观遗传现象导致不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质；例如，可通过表观遗传机制抑制merlin同工型I蛋白质。不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质可能是遗传修饰的结果，所述遗传修饰包括但不限于，在一个或多个其它基因中的交替、突变、缺失、插入等，所述其它基因不是NF2基因但是merlin表达(例如，merlin同工型ImRNA或蛋白质表达)所需要的，包括但不限于转录、剪接、翻译或蛋白质稳定性所需要的因子。
[0035]在本发明的一些实施方案中，merlin同工型I蛋白质可以可检测量存在，但是所述merlin同工型I蛋白质不是功能性的。不存在可检测量的功能性merlin同工型I蛋白质可能由于多种原因如突变、异常转录或翻译、或异常的转录后或翻译后加工发生。具有功能缺失的merlin同工型I蛋白质的癌细胞将可能与具有不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质的癌细胞显不相同的表型；例如，与患有具有功能性merlin同工型I蛋白质的癌症的人相比，该表型将允许在具有所述癌细胞的人中使用本文公开的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐改善治疗。该表型也可包括升高水平的pFAK表达。
[0036]本领域的技术人员能够建立功能缺失的merlin同工型I蛋白质，包括但不限于通过merlin蛋白测量下游信号传导。下游信号传导的一种此类通路是涉及MST1/2和LATS1/2激酶的规范通路(canonical pathway),其调节转录因子YAP/TAZ。测量所述下游信号传导任选包括测定测定所述激酶(例如MST1/2和/或LAT1/2)的靶点的磷酸化状态和/或磷酸化水平。测量所述下游信号传导任选包括测量YAP/TAZ转录复合物的靶基因的表达水平。本领域的技术人员能够测量与merlin有关的激酶通路的下游信号传导。
[0037]本发明的一项实施方案为在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括测定从所述人获得的肿瘤样品中存在或不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质或其功能性片段，并且如果未检测到merlin同工型I蛋白质或其功能性片段，则向所述人给药有效量的2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1Η-吡唑-5-基]氨基}_4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
[0038]另一实施方案为治疗在有需要的人中merlin阴性癌症的方法，其包括向所述人给药治疗有效量的FAK抑制剂。在另一项治疗人中merlin阴性癌症的方法的实施方案中，所述FAK抑制剂为2- [ (5-氯-2- {[3-甲基-1- (1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基} -4-吡啶基)氨基]-N_(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
[0039]在另一实施方案中，在从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质或其功能性片段用作生物标记，其中所述样品中不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质或其功能性片段表明所述人适用于用FAK抑制剂治疗。在另一项实施方案中，在从需要治疗癌症的人获得的样品中存在或不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质或其功能性片段用作生物标记，其中所述样品中不存在可检测量的merlin同工型I蛋白质或其功能性片段表明所述人适用于用FAK抑制剂治疗，其中所述FAK抑制剂为2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1Η-吡唑-5-基]氨基}_4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺，且其中所述癌症治疗是针对间皮瘤的。
[0040]pFAK
[0041]磷酸化的FAK或pFAK，可在具有一个或多个NF2突变的细胞，例如肿瘤细胞中过表达。例如，PFAK在一些具有NF2基因突变的肿瘤细胞中过表达，其中所述NF2基因突变导致NF2基因的同工型I蛋白质基因产物的表达不足。因此，在一些实施方案中，pFAK以更高的量存在于肿瘤细胞中，其中不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白2同工型I蛋白质或merlin同工型I蛋白质。(如本领域已知和本文所述，神经纤维瘤蛋白2同工型I蛋白质与merlin同工型I蛋白质有相同的氨基酸序列，而且各自还可被称为其它名称，如NF2同工型I蛋白质)。
[0042]在本文治疗癌症的方法的一个实施方案中，所述方法包括测定从有需要的人获得的样品中PFAK的水平，并且与对照样品相比，如果测定的pFAK水平升高，则向所述人给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，所述对照样品是从正常患者组织中制得的。在另一实施方案中，所述对照样品是从包含野生型NF2基因的细胞中制得的。在另一实施方案中，使用多个对照样品。
[0043]在本文另一治疗癌症的方法的实施方案中，测定不存在或存在可检测量的NF2同工型I并测定PFAK的水平。在另一实施方案中，如果观察到pFAK升高且未观察到可检测量的NF2同工型1，则给药FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。在另一治疗癌症的方法的实施方案中，所述方法包括测定PFAK水平，所述癌症为间皮瘤，且如果给药，则所述FAK抑制剂为式I的FAK抑制剂，优选化合物A。
[0044]存在或不存在可检测量的基因产物
[0045]检测存在或不存在NF2的基因产物(例如同工型I)意味着建立可能在样品中表达的基因产物(例如NF2同工型I蛋白质、神经纤维瘤蛋白-2同工型I蛋白质，或merlin同工型I蛋白质)，并且例如，其可在用于检测的任何特定分析的背景噪音之上的水平检测到。本领域的技术人员通晓从低信号或背景信号区分表明基因产物表达或存在的正信号。可实施阳性对照和阴性对照以确立与正信号区别的背景或噪音。例如，“减除(cutoff) ”可通过在不表达感兴趣的基因产物的阴性对照中测定背景噪音如染色或其它测量信号的水平来确立。因此，存在基因产物意味着在组织中例如一个或多个细胞中或组织内的部分细胞中，所述基因产物在背景水平之上可检测到。相反，不存在基因产物意味着在组织中例如一个或多个细胞中或组织内的部分细胞中，所述基因产物在背景水平之上不可测量。
[0046]不存在或存在可检测量的基因产物(其中所述基因产物为蛋白质)，可通过多种本领域公知的任何方法完成检测。这些方法包括但不限于以下的一种或多种:质谱、2D、电泳、HPLC、蛋白质测序和多种免疫学检测方法。所述免疫学检测方法包括但不限于免疫亲和性分析、免疫沉淀分 析、免疫细胞化学分析、ELISA、固相夹心分析、免疫印迹、高通量免疫印迹、免疫组织化学，或这些技术的组合。
[0047]免疫组织化学
[0048]优选地，在本文一项实施方案中，存在或不存在可检测量的NF2基因的同工型I基因产物通过检测蛋白质测定。在另一项其中蛋白质被检测的实施方案中，所述蛋白质为神经纤维瘤蛋白-2同工型I。在另一项治疗癌症的实施方案中，其中蛋白质被检测，不存在或存在可检测量的神经纤维瘤蛋白-2同工型I蛋白质通过免疫组织化学(IHC)测定。
[0049]IHC是使用一种或多种对蛋白质特异性的抗体检测组织样品如肿瘤活检样品中的所述蛋白质的方法。(在这种意义上，抗体特定检测的蛋白质常被称作抗原)。所述抗体与所述蛋白质的结合通过染色和显微术分辨。IHC是本领域所公知的。
[0050]通常，获得的组织样品必须迅速保存以避免细胞蛋白质和组织结构的分解。常常，在保存前，所述组织经血液灌注或冲洗。用于IHC的组织样品的制备方法也是本领域所公知的，其包括但不限于，石蜡包埋、快速冷冻、福尔马林固定和甲醛固定。
[0051]制备的组织，如石蜡包埋的组织，通常使用切片机切成4-5^厚度的薄片。然后将这些切片固定在涂布有粘合剂的玻片上。这些粘合剂通常通过表面经3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)或聚-L-赖氨酸处理的玻片添加。玻片可另外地经其它适宜的粘合剂包括明胶、卵白蛋白或市场上可得的胶水涂布。固定后，干燥所述切片。石蜡包埋的玻片可在烘箱或微波炉中干燥以去石腊化。
[0052]冷冻切片可使用预冷却的恒冷切片机制备并固定在粘性的玻片上。这些切片通常在室温干燥过夜并通过浸没在预冷却的(_20°C )丙酮中固定，尽管基于待检测的组织和蛋白质，所述干燥步骤可根据本领域的技术人员决定而省略。
[0053]在染色和检测样品中蛋白质存在或不存在前，所述组织样品是“暴露的”，以使抗体接触所述蛋白质。该过程常称为抗原修复，且可通过本领域已知的多种手段如加热或酶促手段(包括使用胰蛋白酶、胃蛋白酶，或其它蛋白酶)完成。
[0054]所述抗体与样品中蛋白质的结合可通过与所述抗体在多种本领域公知的溶液或缓冲液中温育完成。缓冲液可含有阻断剂，其阻断所述抗体对组织的非特异性结合；阻断可在组织样品玻片和抗体温育前或温育过程中完成。所述方法中使用的抗体的量可影响随后通过显微术分辨的信号的水平，而且本领域的技术人员知晓例如通过测试所述抗体的稀释液来测定和优化用于特定IHC分析中的抗体的量。
[0055]通常，IHC中使用的抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。在检测神经纤维瘤蛋白-2同工型I的情况中，所述抗体必须能够检测其它同工型可能存在的组织中存在或不存在同工型I蛋白质。所以，必须使用神经纤维瘤蛋白-2同工型I特异性抗体。所述特异性抗体经常为单克隆抗体；然而，本领域的技术人员能够识别适于检测样品中存在或不存在NF2同工型I的多克隆抗体制剂。优选地，在本文的一项实施方案中，存在或不存在NF2基因的同工型I蛋白质基因产物的检测包括:使样品接触针对神经纤维瘤蛋白-2同工型I的单克隆抗体，其中该抗体能够可检测地结合神经纤维瘤蛋白-2同工型1，并且不会可检测地结合其他神经纤维瘤蛋白-2同工型。在另一项实施方案中，所述抗神经纤维瘤蛋白-2同工型I单克隆抗体不会可检测地结合NF2的同工型2蛋白质基因产物。在另一项实施方案中，所述抗体为多克隆抗体制剂，其中所述多克隆抗体能够结合神经纤维瘤蛋白-2同工型I蛋白质，而不结合神经纤维瘤蛋白-2同工型2蛋白质。在其他实施方案中，其中所述单克隆抗体或所述多克隆抗体可检测地结合神经纤维瘤蛋白-2同工型I但不会可检测地结合神经纤维瘤蛋白-2同工型2，所述单克隆抗体或所述多克隆抗体也不会可检测地结合除同工型I外的其它同工型。
[0056]抗体结合蛋白质的检测可通过本领域公知的多种方法完成，所述方法如标记有荧光团(fluorofore)的抗体的免疫荧光检测或与免疫过氧化物酶结合的抗体的免疫过氧化物酶染色。本领域公知的其它检测方法包括显色检测、放射性、化学发光，以及其它生物的和酶的标记或标签。也可使用间接检测，且可具有优点，如基于生物素/抗生物素蛋白的系统和其它在本领域的知识和技能内的二次检测系统(secondary detection systems)。
[0057]本领域的技术人员也可使用对比染色以使细胞或细胞区室，如细胞核可视化。
[0058]基因检测
[0059]NF2基因突变也可在基因水平上，单独测定或与测定存在或不存在基因产物如蛋白质组合测定。这样的基因测试可通过本领域公知的多种手段完成，所述手段包括但不限于，测序、RT-PCR，和原位杂交，如基于荧光的原位杂交(FISH)。
[0060]根据本发明的一项实施方案，在有需要的人中治疗癌症的方法包括检测在从所述人获得的样品中NF2基因中的突变，测定所述NF2基因中的突变是否导致NF2同工型I的表达不足，并且如果所述突变导致NF2同工型I的表达不足，则向所述人给药治疗有效量的FAK抑制剂，如本文的化合物A，或其药学上可接受的盐。在另一项实施方案中，测定所述NF2基因中的突变是否导致NF2同工型I的表达不足包括进行选自以下的方法:测序、RT-PCR和FISH。在另一项实施方案中，测定所述NF2基因中的突变是否导致NF2同工型I的表达不足包括进行选自以下的方法:测序、RT-PCR和FISH。测序、RT-PCR和FISH允许本领域的技术人员建立NF2基因中的染色体丢失或其它缺失，所述染色体丢失或其它缺失会导致NF2基因产物(尤其是同工型I蛋白质)的表达不足。测序和RT-PCR允许本领域的技术人员建立点突变、插入或缺失，所述点突变、插入或缺失会导致未成熟终止密码子和导致NF2基因产物(尤其是同工型I蛋白质)的表达不足。
[0061]根据本发明的其它实施方案中，测定患者是否在给定基因处具有会响应FAK抑制剂的具体突变包括:
[0062]a.在从受治疗者肿瘤获得的生物学样品上进行基因分型技术以测定所述患者是否具有携带至少一个NF2同工型突变体的肿瘤。
[0063]b.使所述突变的检测与以下的可能性增加相关(与如果所述突变未检测的可能性相比):当给药FAK抑制剂，任选式I的FAK抑制剂，任选化合物A时，经历一个或多个增加的响应率、更长的无进展生存期或更长的总生存期的一种或多种。
[0064]FAK抑制剂
[0065]在本文任何治疗癌症例如merlin阴性癌症或检测不到神经纤维瘤蛋白_2同工型I蛋白质的癌症的方法中，FAK抑制剂可为式(I)的化合物或其盐:
【权利要求】
1.在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括测定所述人的样品中存在或不存在可检测量的神经纤维瘤蛋白-2(NF2)基因的基因产物，并且如果未检测到基因产物或同工型I基因产物，则向所述人给药有效量的粘着斑激酶(FAK)抑制剂或其药学上可接受的盐。
2.权利要求1的方法,其还包括检测磷酸化的FAK(p-FAK)。
3.权利要求1或2的方法，其还包括如果NF2基因的同工型I基因产物存在，则检测NF2的同工型I基因产物的功能的缺失。
4.权利要求3的方法，其还包括如果可检测量的NF2基因的同工型I基因产物存在且检测到NF2基因的同工型I基因产物的功能缺失，则向所述人给药有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中使用免疫组织化学(IHC)测定存在或不存在NF2基因的基因产物或同工型I基因产物。
6.权利要求5的方法，其中IHC包括使用结合NF2基因的同工型I基因产物但不结合NF2基因的其它同工型基因产物的抗体。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述使用FAK抑制剂的治疗导致无进展生存(PFS)时间增加。
8.权利要求7的方法，其中所述PFS时间的增加是有临床意义的。
9.权利要求7或8的方法，其中所述PFS时间的增加是统计学显著的。
10.权利要求1-10任一项的方法，其中所述样品包含一个或多个肿瘤细胞。
11.权利要求1-11任一项的方法，其中所述NF2基因的基因产物为蛋白质或其功能性片段。
12.在有需要的人中治疗癌症的方法，其包括括测定所述人的肿瘤样品中存在或不存在可检测量的merlin或其功能性片段，并且如果未检测到merlin或其功能性片段，则向所述人给药有效量的2-[(5-氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4_吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
13.在有需要的人中治疗merlin阴性癌症的方法，其包括向所述人给药治疗有效量的FAK抑制剂或其药学上可接受的盐。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述FAK抑制剂为2-[(5_氯-2-{[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-吡唑-5-基]氨基}-4-吡啶基)氨基]-N-(甲基氧基)苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述癌症选自神经鞘瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、皮肤癌、胃癌、骨癌、肾癌、乳腺癌和肠癌。
16.权利要求17的方法，其中所述癌症为间皮瘤。
【文档编号】A61K38/00GK103930114SQ201280042271
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年6月28日 优先权日:2011年6月28日
【发明者】K.R.奥格, M.M.达, R.A.弗莱明 申请人:葛兰素史密斯克莱知识产权（第2号）有限公司