专利名称：一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2及其编码序列的基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学领域,尤其是一种务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2及及编码序列的基因与应用。
背景技术：
自由基指任何包含一个未成对电子的原子或原子团。生物体与外界接触和自身产生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、脂质过氧自由基、二氧化氮、一氧化氮自由基、单线态氧和臭氧。在较高浓度下，活性氧自由基对生物细胞的细胞结构、核酸、脂类和蛋白质造成损伤。造成DNA损伤，进一步引起复制错误、基因组不稳定、转录意外起始或终止，从而导致生物体变异或疾病发生；引起细胞膜流动性和通透性改变，导致细胞结构和功能改变；引起蛋白质氧化，导致蛋白质变性和失活。目前发现，活性氧自由基与多种人类疾病有关,如癌症、心脑血管疾病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和衰老等。为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中生物体形成多种不同的自由基清除系统，包括非基因编码的小分子物质，如尿酸、维生素C、维生素E、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶Q等；基因编码的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白酶系统和谷胱甘肽酶系统；基因编码的小分子抗氧化肽类，如从两栖类蛙科动物皮肤中发现的各种小分子抗氧化多肽。各种不同类型的自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力，如维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。抗氧物目前在国内外应用广泛，需求量逐渐增多，现在被用于预防治疗多种疾病，如心血管疾病、肿瘤、关节炎、肾功能损伤、糖尿病、自 身免疫性疾病等。此外，抗氧化物近年在化妆品领域的应用兴起，尤其是天然抗氧化物。由于皮肤的光老化作用是由于紫外线诱导皮肤细胞产生大量的氧自由基堆积而造成的。现在许多护肤品中加入抗氧化剂，有减少雀斑、防辐射、延缓衰老、调节免疫和提高皮肤自我保护的作用。务川臭娃fracAwafleflsis)属于两栖纲无尾目娃科臭娃属，为中国特有种，仅分布于贵州省务川仡佬族苗族自治县。目前关于务川臭蛙来源抗氧化多肽的研究还没有报道。
发明内容
技术要求
本发明所要解决的技术问题是提供一种务)11臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2。本发明还要解决的技术问题是提供上述蛋白片段的编码序列。本发明还要解决的技术问题是提供上述基因片段在制备抗氧化药物或化妆品添加剂的应用。本发明是这样实现的:一种务川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2,它是具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质。所述的务川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；该务川臭蛙抗氧化肽wuChuanin-B2是直链多肽，含有16个氨基酸残基，分子量为1833.17 Da，等电点为 11.26。务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的编码基因，它是下列核苷酸之一:
(1)序列表中SEQID NO:1所不的核昔酸序列；
(2)编码序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸；
(3)在高严谨条件下可与序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的编码基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin_B2在制备抗氧化药物或化妆品添加剂的应用。有益效果
通过基因工程的方法将本发明提供的务川臭蛙抗氧化肽wuChuanin-B2具有极强的抗氧化活性、分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单的特点，将其应用在抗氧化药物或化妆品添加剂中，可以提高药物或化妆品添加剂的抗氧化效果。由于该基因是务川臭蛙本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响其安全性，可广泛应用于药物或化妆品添加剂生产中。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明的实施例1:务川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2基因克隆。I)务川臭蛙皮肤总RNA提取:
①取300 mg务川臭蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入I ml总RNA提取缓冲液(Trizol,美国Invitrogen公司产品)，充分混勻，而后于4°C,12000 rpm 离心 10 min。②离心取上清，加入0.2 ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4°C，12000 rpm离心10分钟，弃除沉淀。③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4°C，12000 rpm离心10分钟，收集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为务川臭蛙皮肤总RNA。2)务川臭蛙皮肤cDNA文库构建:采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(l)cDNA第一链合成(mRNA反转录):
①经DEPC处理(DEPC处理是在含0.1% (V/V)DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干)的离心管中加入I μ I务川臭蛙皮肤总RNA、1 μ I 3’端一链合成引物(3’In-Fusion SMARTerCDS Primer)和2.5 μ I DEPC处理的水(DEPC处理的水是含0.1% DEPC (V/V)的水，放置过夜，高压灭菌)使总体积达到4.5 μ 1，混匀后短暂离心(2000 rpm, 30 S)，离心后于72°C保温3分钟；保温后再将离心管在42°C孵育2分钟。 ②在上述离心管中加入以下试剂(均为CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备)，2.0 μ I 5 X第一链缓冲液、0.25 μ I 100 mM DTTU.0 μ I 10 mM dNTP Mix、1.0 μ I SMARTer
VOligonucleotide、。.25 μ I RNase Inhibitor 和 1.0 μ I SMARTScribe ReverseTranscriptase反转录酶,混合离心管中试剂并短暂离心(2000 rpm, 30 s),在42°C保温90 min，然后68°C保温10 min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2 μ I所合成的cDNA第一链备用。(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD- PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建库试剂盒中配备)
①将 2 μ I cDNA 第一链(mRNA 反转录)、80 μ I 去离子水、10 μ I IOXAdvantage 2PCR 缓冲液、2 μ I 50XdNTP 混合物、2 μ I 5’PCR 引物、2 μ I CDS ΠΙ/3’ PCR 引物以
及 2 μ I 50 XAdvantage 2 Polymerase Mix 在 95°C预热的 PCR 管中进行混合。②在PCR仪中按以下程序扩增:95°C，1 min ; 18个循环:95°C，15 sec，65°C，30sec,68°C,6 min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链一 80°C保存。(3)务川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2基因克隆筛选:
根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5， -CCAAAGATGTTC ACCTTGAAG-3’， PCR 另一扩增引物为 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列为S’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-S'PCR反应在如下条件下进行:94 °C 4 min,94 °C 30 sec,57°C 30 sec和72 V I min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到PMD19-T载体(Takara，大连)，转化进CaCl2-MgCl2法制备好的DH5ci感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落,摇菌提取质粒,使用Applied BiosystemsDNA sequencer, model ABI PRISM 377 进行核苷酸测序。测定结果:
编码务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的基因自5’端至3’端序列SEQ ID N0.1所示:务川臭蛙抗氧化肽wuChuanin-B2基因核苷酸的序列表为:序列长度为336个碱基，序列类型:核酸，链数:单链，拓扑学:直链状，序列种类:cDNA，来源:务川臭蛙皮肤。
本发明的实施例2:务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的化学合成:
1、务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2的化学合成方法:根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通过HPLC反相柱层析脱盐。I1、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-T0F)。II1、纯化的务川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-T0F)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。务川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2是务川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2基因编码的一种直连多肽，含有十六个氨基酸残基，分子量1833.17Da，等电点11.26。务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2全序列如SEQ ID N0.2所示。本发明的实施例3:务川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2的药理实验:
1、wuchuanin-B2抗氧化活性测定:
ABTS (3-ethyIbezothiazoIine-6-sulfonic acid) (3_ 乙基苯并噻唑啉 _6_ 横酸)用PBS缓冲液(pH7.4)配成2 mM的ABTS储存液。将ABTS储存液和70 mM过硫酸钾(K2S2O8)水溶液按体积比250:1混合，于室温避光放置15-16 h。试验开始前，将ABTS.+释至734nm波长处的吸光值为0.80±0.03。将4 μ 不同浓度的上述wuchuanin_B2抗氧化肽样品和96 μ 上述校正过的ABTS.+溶液混合，室温放置10 min后，于734 nm波长处检测反应液的吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行(表I)。ABTS.+清除率 I(%)= (Ab — Aa)/ Ab XlOO (AB:空白对照组吸光值；AA:样品组吸光值)。表1.wuchuanin_B2 抗氧化活性
权利要求
1.一种务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2,其特征在于:它是具有序列表中SEQ ID NO:I所示的氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ IDNO:2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2,其特征在于:所述的务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；该务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2是直链多肽，含有16个氨基酸残基，分子量为1833.17 Da，等电点为11.26。
3.—种如权利要求1所述的务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的编码基因，其特征在于:它是下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQID NO:I所不的核昔酸序列； (2)编码序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸； (3)在高严谨条件下可与序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的编码基因,其特征在于:务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的编码基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.—种如权利要求3所述的务川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2在制备抗氧化药物或化妆品添加 剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2，它是具有序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQIDNO2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQIDNO2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNO2衍生的蛋白质。本发明提供的务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2具有极强的抗氧化活性、分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单的特点，将其应用在抗氧化药物或化妆品添加剂中，可以提高药物或化妆品添加剂的抗氧化效果。由于该基因是务川臭蛙本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响其安全性，可广泛应用于药物或化妆品添加剂生产中。
文档编号A61K38/10GK103193866SQ20131013131
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月16日 优先权日2013年4月16日
发明者周江, 凌桂英, 高久香, 李莉, 王义鹏 申请人:贵州师范大学