一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术的制作方法
【专利摘要】一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，包括以下步骤：(1)从红斑狼疮患者的非发病期采集外周静脉血；(2)通过密度梯度分离法，从血液中分离得到单个核细胞；(3)将单个核细胞用培养液在培养容器中培养2h后将上清液倒入新的培养容器中，原培养容器中贴壁细胞用来分化为DC，新容器中的悬浮细胞分化为Treg细胞；(4)在DC分化的培养液中加入特异抗原，进行DC功能化处理；(5)DC和Treg细胞混合培养扩增；(6)扩增后的细胞用生理盐水清洗后进行静脉滴注回输治疗红斑狼疮。本发明通过细胞免疫技术恢复免疫系统正常状态，而且DC和Treg细胞属于人体细胞，能在体内长时间驻留体内，达到长期治疗效果。
【专利说明】一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学领域，具体为一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术。
【背景技术】
[0002]红斑狼疮为全身性、慢性进行性反复发作和缓解的典型自身免疫性结缔组织病之一。女性发病多，可侵犯全身多脏器，免疫学技术的发展使早期轻型和不典型的病例能及时诊治，因此除少数重症或重要器官受损者外，有些病例可自行缓解，有些只呈一次性发作，经数月或短暂病程后，症状完全消失。治疗上由于合理应用皮质类固醇激素、免疫调节剂、血浆交换疗法、中西医结合等，红斑狼疮患者的十年存活率已达85%。近年有人认为本病为病谱性疾病，其两极为局限性盘状红斑狼疮和系统性红斑狼疮，中间为亚急性皮肤型红斑狼疮和深部红斑狼疮，二者均可向两端演变。
[0003]本病目前尚无根治的方法。普遍的西药治疗主要有:1，非甾体类抗炎药:如消炎痛、阿斯匹林、萘普生、芬必得等，这类药主要用于发热、关节痛、肌痛、乏力等症状而无明显脏器损害的患者，但因其对肝、肾易造成损害，故对狼疮性肾炎患者使用时应特别小心；2，抗疟药:并不是所有的抗疟药都可以治疗红斑狼疮，这里主要指氯喹，羟基氯喹等。该类药具有抗炎，免疫抑制作用，对人体具有光保护作用，可以缓解红斑狼疮患者的皮肤损害，对控制皮疹，关节症状，光敏感有一定效果。是治疗盘状红斑狼疮的主药；3，糖皮质激素类(简称:激素类)药:尽管糖皮质激素长期应用有不少副作用，但对大多数红斑狼疮患者来说，选择此类药物 仍是最重要的治疗方法，尤其对急性或暴发性狼疮或有肾、心、脑、肺等主要脏器损害者更应适时，足量应用，其用药原则是早期，足量，并持续用药，早期用量大，随病情好转应逐渐减量。减量速度应根据病情恢复程度而定，多数患者一年以后能以5-15mg以下剂量维持；4，免疫抑制剂:此类药常与糖皮质激素联合应用，也可单独使用，主要适用于狼疮性肾炎、狼疮肺、中枢神经系统受累的患者，对于撤减激素后疾病易复发，激素有效但用量过大出现毒性作用者也较为适宜。这类药毒副作用较大，特别是引起骨髓抑制及肝、肾功能损害，应用期间应定期检查血常规及肝肾功能指标。此类药目前常用的疗效可靠的是环磷酰胺(CTX)，其主要副作用是骨髓抑制，性腺萎缩，致畸胎等。目前尚有用其他免疫调节剂治疗红斑狼疮的，如胸腺肽，转移因子等，也有使用肝素治疗狼疮肾炎的报道；5，其它疗法:在用上述方法无效时，患者多脏器严重受损者，可采用血浆置换法、脏器移植法，严重的肾脏损害出现肾功衰竭者可采用透析疗法或肾移植术。
[0004]综合分析，红斑狼疮的治疗主要针对自身免疫系统和综合性组织器官疾病进行治疗，针对自身免疫的治疗主要使用肾上腺皮质激素和免疫抑制剂两类药物。
[0005]这些治疗存在着各自的缺陷:
[0006]1、综合性组织器官疾病的治疗为红斑狼疮引起的，对它们的治疗只能起到缓解症状，治标不治本，长期治疗会形成药物依赖和抗性。
[0007]2、肾上腺皮质激素会造成人体身体功能失调，机能紊乱。
[0008]3、免疫抑制剂在治疗的冋时,造成人体免疫能力下降，患者各易感染其他疾病。[0009]4、同时，药物的长期使用使身体长期处于药物导致的亚健康状态，药费和医疗费用闻昂。
【发明内容】
[0010]本发明所解决的技术问题在于提供一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0011]本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:
[0012]一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，包括以下步骤:
[0013](I)从红斑狼疮患者的非发病期采集100ml外周静脉血；
[0014](2)通过密度梯度分离法，从血液中分离得到单个核细胞；
[0015](3)将单个核细胞用培养液在培养容器中培养2h，之后将上清液倒入新的培养容器中，原培养容器中贴壁的细胞用来分化为DC，新容器中的悬浮细胞分化为Treg细胞；
[0016](4)在DC分化的培养液中加入特异抗原，进行DC功能化处理；
[0017]向步骤(3)中的原培养容器中加入DC培养基和三种特异抗原⑶20、BLyS/BAFF、CD40的混合液，然后对步骤(3)中的原培养容器中的细胞用DC培养基和三种特异抗原CD20、BLyS/BAFF、CD40的混合液进行半量换液，同时，对步骤(3)中的原培养容器中补加培养液；
[0018](5)将DC和Treg细胞混合培养扩增；
[0019]向步骤(3)中的新培养容器中加入TNF-α，同时，将新培养容器中的Treg细胞转入培养袋中培养，补加培养液，然后，用细胞刮刀刮下原培养容器中的DC细胞，加入到新培养容器中的Treg细胞中，并补加培养液进行混合扩增培养；
[0020](6)扩增后的细胞用生理盐水清洗，最后进行静脉滴注回输治疗红斑狼疮
[0021]将所有的DC和CIK细胞离心后，用生理盐水离心清洗两次，然后，加入到注射用生理盐水中，补加10 %人血白蛋白后进行静脉滴注回输治疗红斑狼疮。
[0022]所述外周静脉血的供血者为红斑狼疮患者本人在非发病期从患者手臂等体表静脉中抽取的血液，采集量根据患者血液质量，可以具有少量的变动。
[0023]所述密度梯度分离法为借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的分离细胞目的的技术，密度梯度分离法中的密度值是1.077g/ml。
[0024]所述单个核细胞为经过密度梯度离心分离后得到的白膜层的细胞。
[0025]所述DC细胞由白膜层中贴壁细胞分化而来，而Treg则由未贴壁的悬浮细胞分化而来，贴壁细胞经过了两步分化为成熟的DC细胞，第一步是分化为未成熟DC细胞，第二步是未成熟DC分化为成熟的功能DC细胞，贴壁的单个核细胞经过的第一步分化的诱导因子是GM-CSF和IL-4，第二步分化的诱导因子是GM-CSF和IL-4和TNF- α，所述进行DC功能化是在DC的未成熟期进行，也就是第一步期间。
[0026]所述特异性抗原⑶20、BLyS/3AFF、⑶40的抗原为人源性抗原，其中抗原⑶20、BLyS/BAFF和CD40属于红斑狼疮治疗相关特异抗原，如果应用于其他疾病治疗，可以改用相应特异性抗原。
[0027]所述离心清洗的离心速度为200g_300g。
[0028]有益效果[0029]本发明通过细胞免疫技术，DC和Treg细胞调理体内免疫系统平衡，恢复免疫系统正常状态，防止自身免疫发生，而且DC和Treg细胞属于人体细胞，能在体内长时间驻留体内，达到长期治疗效果，同时DC和Treg的细胞免疫治疗一次治疗，根据细胞在体内驻留的时间，治疗效果最长超过半年，治疗后，人体免疫系统正常，身体健康。
【具体实施方式】
[0030]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0031]实施例1
[0032]一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，包括以下步骤:
[0033](I)从红斑狼疮患者的非发病期采集100ml外周静脉血；
[0034](2)通过密度梯度分离法，从血液中分离得到单个核细胞；
[0035]分离步骤如下:
[0036]I)取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到四个50ml无菌离心管中；
[0037]2)300g离心lOmin，离心后，将所有的上层血浆转移到两个新的无菌离心管中，56°C水浴灭活30min，再于 400g离心IOmin后，收集上层黄色液体即低血小板血浆(PoorPlatelet Plasma, PPP), 4°C储存备用；
[0038]3)向该四个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml混合液，用移液器混匀；
[0039]4)再取四支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层；
[0040]5) 400g 离心 2O 分钟；
[0041]6)离心后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中；
[0042]7)用注射用生理盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，清洗单核细胞；
[0043]8)重新加入注射用生理盐水45ml，混匀后离心清洗单核细胞；
[0044](3)将单个核细胞用培养液在培养容器中培养2h，之后将上清液倒入新的培养容器中，原培养容器中贴壁的细胞用来分化为DC，新容器中的悬浮细胞分化为Treg细胞；
[0045](4)在DC分化的培养液中加入特异抗原，进行DC功能化处理；
[0046]步骤如下:
[0047]I)向步骤(3)中的原培养容器中加入DC培养基和三种终浓度为25ng/ml的特异抗原 CD20、BLyS/BAFF、CD40 的混合液；
[0048]2)对步骤(3)中的原培养容器中的细胞用DC培养基和三种终浓度为25ng/ml的特异抗原CD20、BLyS/BAFF、CD40的混合液，进行半量换液，同时，对步骤(3)中的原培养容器中补加培养液到100ml ；
[0049](5)将DC和Treg细胞混合培养扩增；
[0050]I)向步骤(3)中的新培养容器中加入终浓度为20ng/ml TNF-α，同时，将新培养容器中的Treg细胞转入培养袋中培养，补加培养液到300ml ；[0051]2)用细胞刮刀刮下原培养容器中的DC细胞，加入到新培养容器中的Treg细胞中，并将培养液补加到500ml，进行混合扩增培养；
[0052](6)扩增后的细胞用生理盐水清洗，最后进行静脉滴注回输治疗红斑狼疮
[0053]将所有的DC和CIK细胞离心后，用生理盐水离心清洗两次，然后，加入到注射用生理盐水中，补加10 %人血白蛋白后进行静脉滴注回输治疗红斑狼疮。
[0054]所述外周静脉血的供血者为红斑狼疮患者本人在非发病期从患者手臂等体表静脉中抽取的血液，采集量根据患者血液质量，可以具有少量的变动。
[0055]所述密度梯度分离法为借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的分离细胞目的的技术，密度梯度分离法中的密度值是1.077g/ml。
[0056]所述单个核细胞为经过密度梯度离心分离后得到的白膜层的细胞。
[0057]所述DC细胞由白膜层中贴壁细胞分化而来，而Treg则由未贴壁的悬浮细胞分化而来，贴壁细胞经过了两步分化为成熟的DC细胞，第一步是分化为未成熟D细胞C，第二步是未成熟DC分化为成熟的功能DC细胞，贴壁的单个核细胞经过的第一步分化的诱导因子是GM-CSF和IL-4，第二步分化的诱导因子是GM-CSF和IL-4和TNF- α，进行DC功能化是在DC的未成熟期进行，也就是第一步期间。
[0058]所述特异性抗原⑶20、BLyS/BAFF、⑶40的抗原为人源性抗原，其中抗原⑶20、BLyS/BAFF和CD40属于红斑狼疮治疗相关特异抗原，如果应用于其他疾病治疗，可以改用相应特异性抗原。
[0059]所述离心清洗的离心速度为200g_300g。
[0060]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0061]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【权利要求】
1.一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，其特征是，包括以下步骤: (1)从红斑狼疮患者的非发病期采集100ml外周静脉血； (2)通过密度梯度分离法，从血液中分离得到单个核细胞； (3)将单个核细胞用培养液在培养容器中培养2h，之后将上清液倒入新的培养容器中，原培养容器中贴壁的细胞用来分化为DC，新容器中的悬浮细胞分化为Treg细胞； (4)在DC分化的培养液中加入特异抗原，进行DC功能化处理； 向步骤⑶中的原培养容器中加入DC培养基和三种特异抗原⑶20、BLyS/BAFF、⑶40的混合液，然后对步骤(3)中的原培养容器中的细胞用DC培养基和三种特异抗原CD20、BLyS/BAFF、CD40的混合液进行半量换液，同时，对步骤(3)中的原培养容器中补加培养液； (5)将DC和Treg细胞混合培养扩增； 向步骤(3)中的新培养容器中加入TNF-α，同时，将新培养容器中的Treg细胞转入培养袋中培养，补加培养液，然后，用细胞刮刀刮下原培养容器中的DC细胞，加入到新培养容器中的Treg细胞中，并补加培养液进行混合扩增培养； (6)扩增后的细胞用生理盐水清洗，最后进行静脉滴注回输治疗红斑狼疮 将所有的DC和CIK细胞离心后，用生理盐水离心清洗两次，然后，加入到注射用生理盐水中，补加10 %人血白蛋白后进行静脉滴注回输治疗红斑狼疮。
2.根据权利要求1所述`的一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，其特征是，所述外周静脉血的供血者为红斑狼疮患者本人在非发病期从患者手臂等体表静脉中抽取的血液。
3.根据权利要求1所述的一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，其特征是，所述密度梯度分离法为借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的分离细胞目的的技术，密度梯度分离法中的密度值是1.077g/ml。
4.根据权利要求1所述的一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，其特征是，所述单个核细胞为经过密度梯度离心分离后得到的白膜层的细胞。
5.根据权利要求1或4所述的一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，其特征是，所述DC细胞由白膜层中贴壁细胞分化而来，而Treg则由未贴壁的悬浮细胞分化而来，贴壁细胞经过了两步分化为成熟的DC细胞，第一步是分化为未成熟D细胞C，第二步是未成熟DC分化为成熟的功能DC细胞，贴壁的单个核细胞经过的第一步分化的诱导因子是GM-CSF和IL-4，第二步分化的诱导因子是GM-CSF和IL-4和TNF- α，进行DC功能化是在DC的未成熟期进行。
6.根据权利要求1所述的一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，其特征是，所述特异性抗原⑶20、BLyS/BAFF、⑶40的抗原为人源性抗原，其中抗原⑶20、BLyS/BAFF和⑶40属于红斑狼疮治疗相关特异抗原。
7.根据权利要求1所述的一项DC和Treg细胞治疗红斑狼疮的技术，其特征是，所述离心清洗的离心速度为200g-300g。
【文档编号】A61K35/14GK103720719SQ201310491515
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】易银沙, 张万明, 朱海强, 邹义洲, 许澎, 李娜, 刘彩云, 袁炳秋, 吴小宁 申请人:长沙赢润生物技术有限公司