双隆骨铺道蚁有效部位及其防治真菌感染的医药用途

双隆骨铺道蚁有效部位及其防治真菌感染的医药用途
【专利摘要】本发明涉及双隆骨铺道蚁有效部位及其防治真菌感染的医药用途。具体而言，本发明涉及一种具有防治真菌感染类疾病功能的中药蚂蚁双隆骨铺道有效部位及其制备方法和用于制备抗真菌药物的医药用途。本发明的双隆骨铺道蚁有效部位是药用蚂蚁双隆骨铺道蚁(Tetramorium?bicarinatum)经超滤分离技术富集、精制而得。具体而言，是将双隆骨铺道蚁虫体经醇冷浸、热提得到的提取物再经截留分子量为5KDa和30KDa的两种超滤膜进行超滤精制而成，该有效部位具有显著的抑制白色念珠菌生长活性，可制备成片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、涂剂、外用搽剂、膜剂、膏剂、喷剂、注射剂、透皮贴剂、气雾剂形式，用于制备预防和治疗真菌感染的药物、日化用品或医疗器械。
【专利说明】双隆骨铺道蚁有效部位及其防治真菌感染的医药用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体而言，本发明涉及一种具有抗真菌活性的双隆骨铺道蚁有效部位及其制备方法、含有该提取物的药物组合物及其在制备抗真菌感染药物中的用途。
【背景技术】
[0002]随着医学科学的发展，各种新药物和新技术如广谱抗生素、激素、各种导管插管技术、化疗、移植等医疗手段的广泛使用，以及HIV感染和肿瘤，造成人类免疫系统被逐渐破坏的病例逐年增多，从而导致深部真菌感染引起的真菌病的发病率愈来愈高；而另一方面，随着人类滥用抗生素和临床抗真菌药物的广泛使用，导致传统抗生素不能有效对抗某些严重真菌感染和细菌感染，真菌的耐药现象日益严重。传统抗生素的作用已经遭遇显著瓶颈，大多数细菌、真菌对常见的抗生素产生了显著的抗药性；艾滋病患者、重症患者、烧伤患者等并发真菌性感染更使病患危在旦夕。因此，寻找广谱、高效、低毒的抗真菌新药已成为药物研究的热点。
[0003]对耐药菌/顽固性真菌的研究迫在眉睫。真菌感染引起的疾病大体上可以分为以下四类:侵袭性真菌病与全身性真菌病(如曲霉病和念珠菌病等)、粘膜型真菌病(如“鹅口疮”等)、浅表型皮肤真菌病(如“香港脚”或“头皮癣”、“灰指甲”等)和过敏型真菌病(如哮喘与慢性炎症等)。在以上四类真菌病中，以第一类对人类危害最大，而后三类真菌病相对较轻一些。据来自国外的临床统计资料，在死于感染性疾病的人群中，有4%是死于全身性曲霉菌类真菌感染，大约2%的人死于全身性念珠菌感染。临床统计资料表明，病人一旦患上全身性曲霉病，其死亡率高达85%，如患血液性念珠菌病则其死亡率达到了 40%。利用现有抗真菌药物治疗全身性真菌病或血液感染型真菌病的效果至今仍无法令人满意。因此，药学界正在寻找可以抑制全身性真菌感染的新型药物。
[0004]目前，国内外已开发上市的抗真菌药物主要有四大类，即多烯类(如两性霉素B)、三唑类(如氟康唑、咪康唑、益康唑、依曲康唑和酮康唑等)、烷基胺类(如特比萘芬)和新开发上市的棘白菌素(echinocandins)类(如卡帕芬净和米卡民等)。前三大类抗真菌药均为20世纪开发上市的老药，而棘白霉素类则是21世纪初开发上市的新药。老品种的康唑类如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等通过抑制真菌麦角留醇生物合成中的羊毛留醇14去甲基化酶而起效，此类老牌康唑类抗真菌药物抗菌谱较窄而耐压性与日俱增。新品种抗真菌药物虽抗菌谱扩大但是代谢性质和理化特性不佳，水溶性低、生物利用度差；患者需要高脂饮食以利药物吸收，或服用高价的特种制剂形式方可起效；为增加水溶性而添加的环糊精等也给肾功能不全者带来较大威胁。
[0005]三唑类抗真菌药物无论第一代还是第二代均对有丝真菌引起的全身性感染疗效不佳；而棘白霉素类抗真菌新药虽然对这类疾病有一定疗效，然而其面临的最大问题是:尚无口服剂型，只限于注射(且仅限于医院使用)，故病人使用颇为不便。其次，虽然棘白霉素对常见念珠菌病等真菌性感染疗效不错，但其价格昂贵，故而限制了它们在发达国家以外市场的销售量。据报道，在我国市场上，每支卡帕芬净注射剂(剂量为50毫克)的零售价为3，148元，而日本产的米卡民价格稍低一些，但每支(剂量为50毫克)也要650元。因此，我国医院临床目前最常用的全身性抗真菌药物仍为大扶康和特比萘芬。
[0006]综上所述，尽快寻找新型的抗真菌药物及活性物质来源，是今后数十年药物工作者们需要抓紧研制的当务之急。中药与天然药物因其在治疗中不良反应低不易产生耐药性等优点，受到广泛重视；由中药或天然产物制成的各种单方或复方制剂以及中西药配伍制剂，越来越多地应用于临床，显现出良好的效果。由于中药与天然药物具有资源丰富、毒副作用低等特点，国内的专家正将目光瞄准该领域，发掘中国医药学宝库，力图找到能有效抑制真菌感染引起的各种疾病的药物，而我们的前期研究已看到了希望。
[0007]地球上已经记载和命名的昆虫，其种类超过100万种，约占整个动物界种类的80%以上，其中我国约有15万种。在漫长的进化过程中，昆虫已成为地球上优势的动物物种。据估算，昆虫的总生物量超过地球上所有动物总生物量，是当今世界上有待开发的生物类群之一。而药用昆虫是中国中医药宝库中的组成部分，据记载，有药用价值的昆虫约有800余种，隶属于昆虫纲的14目35科以上。不少昆虫类中药因疗效确切而在临床上广泛应用。近年来，对昆虫源药用成分的挖掘以及药用昆虫在治疗某些疑难杂症方面的独到作用，弓丨起了广大医药工作者和昆虫学者的极大兴趣，药用昆虫的研究有了长足的进展。本发明人团队长期从事药用昆虫的开发利用研究，并已成功研制了以蟑螂为原料的“康复新液”、“肝龙胶囊”、“心脉龙注射液”等药品，主治:烧伤和烫伤等外伤创面、乙肝、急慢性心衰和室性早博等心脑缺血性疾病等。
[0008]为了探索开发出新型的抗真菌天然药物，本发明以药用昆虫蚂蚁为研究对象。蚂蚁又称“玄驹”、“蚍蜉”、“昆蜉”、“蚁”、“马蚁”、“状元子”，是一种社会性昆虫，蚂蚁隶属昆虫纲(Class Insecta)、膜翅目(Hymenoptera)、细腰亚目(Apocrita)、蚁总科(Formicoidea)Jj^A (Formicidae)。虫马蚁种类繁多，全世界共有260属，约有16，000多种，目前已定名的有8，800多种。我国估计达2，000种以上，其中已经定名的大约有600种。蚂蚁入药的最早记载为唐朝陈藏器所著《本草拾遗》，其中就有“独脚蚁主治疔肿疽毒，捣涂之”的记述；明朝李时珍《本草纲目》、清朝赵学敏《本草纲目拾遗》等也将蚂蚁作为中药收录，认为蚁幼虫 有“催乳汁、泽颜色”等功效，可合“壮药(即滋补药)”。目前我国临床应用的蚂蚁不到20种，其中已定名且常用入药的为包括丝光褐林蚁、拟黑多翅蚁、双隆骨铺道蚁等10种蚁科动物无毒蚂蚁的全体。主治肾虚头昏耳鸣，失眠多梦，阳痿遗精，风湿痹痛，中风偏瘫，手足麻木，红斑狼疮，硬皮病，皮肌炎，痈肿疔疮，毒蛇咬伤。近些年研究发现，蚂蚁具有抗炎、镇痛、提高免疫力，减少胃酸分泌、预防溃疡发生、抗癫痫、抗惊撅等功效；药用蚂蚁具有调节人体内分泌系统方面的药理作用，特别是对类风湿、糖尿病、癌症等均有良好的治疗效果(“我国药用蚂蚁的开发与利用概况”，赤峰学院学报(自然科学版)，2011，27(7):22-24)。
[0009]蚂蚁除了可入药，还可食用，其含有人体必需的70多种营养成分；其中蛋白质含量丰富，约占42%~67%，蚂蚁的成虫含蛋白质达55%，卵可达67% ;粗蛋白含量达42%以上；含有26种游离氨基酸，加上蛋白质水解的氨基酸共27种氨基酸，游离氨基酸的总量可达1，868毫克/100克，水解氨基酸达到3，994毫克/100克，其中有8种是人体必需的氨基酸；同时，蚂蚁体内还含有28种游离脂肪酸，其中油酸62.44%，棕榈酸21.14%，棕榈油酸11.03%。蚂蚁体内还含有多种激素、活性酶(蚂蚁体内含19种酶和辅酶，如FAD、SOD等，这些物质对机体的能量代谢、脑细胞的更新及改善脑缺氧状况有重要作用)、高能磷酸化合物及蚁醛(主要是草体蚁醛CltlH16O2，是萜烯类衍生物，具有良好的舒筋活血的功能，其滋补能力可与野山参相媲美)、蚁酸(甲酸，有的含量高达体重的20%，浓度达70%)。另外，蚂蚁体内还含有丰富的维生素，较为突出的有维生素A、C、D、E、B1、B2、B12，为人类健康提供了丰富的营养物质；除此之外，据测定，蚂蚁体内含28种微量元素，如:锰、锌、硒、镁、钙、磷、铬、铁、碘、钥、氟等，其中锌的含量最高，故抗风湿病疗效显著(“药用蚂蚁的研究进展”，食品与药品，2006，8 (OlA): 26-28)。[0010]如上述，由于蚂蚁的身体就是一个营养库与制药厂，因此其药用与食用价值极高。美国的科学家研究产于美洲的切叶蚁(Attini族，Apterostigma dentigerum),发现该种蚂蚁身体体表共生的放线菌Pseudonocardia spp.能产生可以抑制真菌Escovopsi ssp.和部分念珠菌菌株的一种环妝抗生素Dentigerumycin (^Dentigerumycin:a bacterialmediator of an ant-fungus symbiosis”，Nat Chem Biol.2009，5 (6): 391-393)。然而，切叶蚁Apterostigma dentigerum仅分布于美洲哥斯达黎加等部分地区,而与其共生的放线菌Pseudonocardia spp.在其它地方也没有发现，因此Dentigerumycin无法大量制备以进一步开发。澳大利亚的科学家则在产于澳大利亚的斗牛犬蚁(Bulldog ant)Myrmecianigriscapa的后胸侧板腺(metapleural gland)的分泌物中发现能够抑制细菌、真菌生长白勺后胸侧板腺素(metapleurins) (“Ants and antibiotics”，EC0S, 1989，61:27-28)。然而，斗牛犬蚁(Myrmecia nigriscapa及相似种)为澳大利亚特种昆虫,其他国家和地区并未分布；且metapleurins的收集为刺激活体斗牛犬蚁，使其后胸侧板腺分泌出类抗生素的活性物质，因此，难以满足进一步研发所需的大量样品。
[0011]双隆骨铺道蚁(Tetramoriumbicarinatum(Mylanaer)),是指蚁科(Formicidae)铺道蚁属(Tetramorium Mayr,又名路舍蚁属)昆虫,在中国分布于云南、四川、福建、广东、海南、台湾；除非洲外全世界有分布。双隆骨铺道蚁为我国中医药临床上应用的近20种“蚂蚁”中的一种，工蚁体长3.6-4.5毫米，触角12节；头部、并腹胸和腹柄节黄褐色，腹部黄褐色至黑褐色，胸背板具有网状刻纹。本发明人对中国入药蚂蚁的大量研究发现，双隆骨铺道蚁具有抗真菌活性，本发明人又根据大量文献调查及相关实验，设计了具有抑制真菌生长功效的双隆骨铺道蚁有效部位的制备工艺。经本发明人查新发现，以往均无与本发明相同的双隆骨铺道蚁有效部位提取物作为主药进行配制的药物制剂的相关报道或专利，更无运用上述制剂用于防治真菌性感染疾病的文献报道。抗真菌试验结果发现，双隆骨铺道蚁有效部位具有显著的抗真菌活性，由此完成本发明。

【发明内容】

[0012]本发明的目的是提供一种具有抗真菌活性的双隆骨铺道蚁有效部位提取物。
[0013]本发明还提供了双隆骨铺道蚁有效部位的制备方法，其特征是采用超滤膜分离技术法富集、精制了双隆骨铺道蚁中具有抗真菌活性的部位，具体采用以下步骤制备得到:
[0014]a)用重量比为30-300倍量的有机溶剂室温浸泡提取双隆骨铺道蚁虫体，浸泡提取时间为2-24小时，减压浓缩回收溶剂，得到双隆骨铺道蚁粗提物I ;浸提后的虫体自然晾干；[0015]b)将经步骤a浸泡提取后晾干的虫体用组织匀浆机磨碎、匀浆，用重量比为30-300倍量的有机溶剂室温浸泡提取虫体浆，浸泡提取时间为2-24小时，减压浓缩回收溶剂，得到双隆骨铺道蚁提取部位II ;浸提后的虫体浆残渣自然晾干；
[0016]c)用重量比为30-300倍量的有机溶剂加热提取步骤b中浸泡提取后晾干的虫体浆残渣，提取时间为0.5-12小时，减压浓缩回收溶剂，得到双隆骨铺道蚁提取部位III ;浸提后的虫体浆残渣自然晾干；
[0017]d)将步骤c得到的双隆骨铺道蚁提取部位III用溶剂溶解后，用截留分子量(MWCO)为5千道尔顿(5KDa)的超滤膜进行超滤，收集透过超滤膜的膜透过液，减压浓缩后干燥，得到双隆骨铺道蚁提取部位IV ;收集截留于超滤膜上的截留物；
[0018]e)将步骤d中的截留物用溶剂溶解后，用MWCO为30千道尔顿(30KDa)的超滤膜进行超滤，收集透过超滤膜的膜透过液，减压浓缩后干燥，粉碎得产品。
[0019]其中，有机溶剂是指以碳原子小于5的低级醇的水溶液，优选50%_98%的乙醇或甲醇溶液；步骤c中加热提取的温度为60°C -80°C ;干燥方法优选真空减压干燥或冷冻干燥。
[0020]本发明的又一个目的是提供双隆骨铺道蚁有效部位在制备预防和治疗抗真菌的药物中的应用；优选在制备预防和治疗念珠菌感染疾病的药物中的应用。
[0021]本发明的另 一个目的是提供含有双隆骨铺道蚁有效部位与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成药物组合物，所制备的药物组合物还可以含有其他抗细菌和/或抗真菌药物。所述的药物可按本领域已知方法制成多种剂型，包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、涂剂、外用搽剂、膜剂、膏剂、喷剂、注射剂、透皮贴剂、气雾剂、控释或缓释剂，及纳米制剂。
[0022]经本发明人详细的文献查阅，到目前为止，尚无有关双隆骨铺道蚁有效部位用于制备抗真菌药物的报道。双隆骨铺道蚁有效部位对于真菌生长的强效抑制属于意想不到的发现，有着确切的原创性，据此完成本发明。
[0023]本发明有益之处在于:首次发现双隆骨铺道蚁有效部位具有抑制真菌生长、制备抗真菌感染方面的成药潜力，为开发成为治疗真菌感染创新药物提供了新的物质基础。具有潜在巨大的社会效益和经济效益。本发明再一特点为:本发明之药用昆虫资源丰富，提取制备方法简单易行、原料来源方便易得、成本低、污染小，利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景十分明确。
[0024]实施例1:双隆骨铺道蚁有效部位(Ia)的制备
[0025]1.1双隆骨铺道蚁提取物的制备
[0026]本实施例所用生药购自云南省临沧市本地中药材市场，经云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为双隆骨铺道蚁干品。
[0027]1.1.1取400.0毫克的干燥双隆骨铺道蚁，室温下浸泡于40毫升的70%乙醇溶液中10小时，滤出浸泡液，减压浓缩、回收溶剂，得双隆骨铺道蚁粗提物I (a) 38.1毫克。浸提后的虫体自然晾干。
[0028]1.1.2将1.1.1项下浸泡提取后晾干的虫体用组织匀浆机磨碎、匀浆，并用60毫升的80%乙醇溶液室温浸泡提取虫体浆，提取时间为8小时；滤出溶液，经减压浓缩回收溶剂，得双隆骨铺道蚁提取部位II (a) 26.2毫克；浸提后的虫体浆残渣自然晾干。
[0029]1.1.3用30毫升的60%甲醇溶液加热提取1.1.2项下浸泡提取后晾干的虫体浆残渣，提取时间为6小时、提取温度为70°C，减压浓缩回收溶剂，得到双隆骨铺道蚁提取部位Ill (a) 37.7 毫克。
[0030]1.2双隆骨铺道蚁有效部位的制备
[0031]1.2.1取30.0毫克由实施例1的1.1.3制备得到的双隆骨铺道蚁提取部位III (a)，用80%的甲醇水溶液震荡溶解后，用MWCO为5KDa的超滤膜过滤，收集透过超滤膜的膜透过液，减压浓缩后冷冻干燥，得双隆骨铺道蚁提取部位IV(a)3.6毫克。收集截留于超滤膜上的截留物。
[0032]1.2.2将1.2.1项下的超滤膜截留物用80%的甲醇水溶液震荡溶解后，用MWCO为30KDa的超滤膜过滤，收集透过超滤膜的膜透过液，减压浓缩后冷冻干燥，粉碎后称重，得双隆骨铺道蚁有效部位(Ia) 2.1毫克。
[0033]实施例2:双隆骨铺道蚁有效部位(Ib)的制备
[0034]2.1双隆骨铺道蚁提取物的制备
[0035]本实施例所用生药购自云南省临沧市本地中药材市场，经云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为双隆骨铺道蚁干品。
[0036]2.1.1取400.0毫克的干燥双隆骨铺道蚁,室温下浸泡于120毫升的75%甲醇溶液中18小时，滤出浸泡液，减压浓缩、回收溶剂，得双隆骨铺道蚁粗提物1(b)49.3毫克。浸提后的虫体自然晾干。
[0037]2.1.2将2.1.1项下浸泡提取后晾干的虫体用组织匀浆机磨碎、匀浆，并用80毫升的90%甲醇溶液室温浸泡提取虫体浆，提取时间为12小时；滤出溶液，经减压浓缩回收溶剂，得双隆骨铺道蚁提取部位II (b)38.9毫克；浸提后的虫体浆残渣自然晾干。
[0038]2.1.3用60毫升的50%甲醇溶液加热提取2.1.2项下浸泡提取后晾干的虫体浆残渣，提取时间为2小时、提取温度为80°C，减压浓缩回收溶剂，得到双隆骨铺道蚁提取部位III (b) 41.1 晕克。
[0039]2.2双隆骨铺道蚁有效部位的制备
[0040]2.2.1取30.0毫克由实施例2的2.1.3制备得到的双隆骨铺道蚁提取部位III (b)，用65%的乙醇溶液震荡溶解后，用MWCO为5KDa的超滤膜过滤，收集透过超滤膜的膜透过液，减压浓缩后冷冻干燥，得双隆骨铺道蚁提取部位IV(b)4.0毫克。收集截留于超滤膜上的截留物。
[0041]2.2.2将2.2.1项下的超滤膜截留物用65%的乙醇溶液震荡溶解后，用MWCO为30KDa的超滤膜过滤，收集透过超滤膜的膜透过液，减压浓缩后冷冻干燥，粉碎后称重，得双隆骨铺道蚁有效部位(Ib) 2.9毫克。
[0042]实施例3:双隆骨铺道蚁有效部位抑制真菌活性检测
[0043]参照美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)提出的标准化抗真菌敏感性试验方法，测试实施例1、2制备得到的双隆骨铺道蚁各提取部位的体外抗真菌活性。
[0044]3.1真菌标准株:
[0045]白色念珠菌ATCC76615 (CS3):解放军第二医科大学提供。
[0046]白色念珠菌ATCC90029 (5_FC耐药菌株):北京医院卫生部临床检验中心提供。
[0047]白色念珠菌ATCC10231:重庆市疾控中心提供。
[0048]白色念珠菌98001:武汉菌种保藏中心提供。
[0049]白色念珠囷Y0119:上海市长征医院提供。[0050]白色念珠囷Y0109:上海市长征医院提供。
[0051]3.2 试剂:
[0052]3.2.1沙氏琼脂培养基(sabouraud dextrose agar):广东凯微生物科技有限公司
女口
广叩O
[0053]3.2.2酵母抽提物(yeast extract):海生工生物工程技术服务有限公司分装。
[0054]3.2.3 三氮吗啡啉丙横酸(3-N-morpholinopropanesulfonicacid, MOPS)
[0055]3.2.4标准抗真菌注射液:氟康唑(Fluconazole, FCZ),扬子江药业集团公司。配置成不同浓度梯度的倍比稀释液。
[0056]3.2.5 二甲基亚讽(dimethylsulfoxide, DMSO)及二甲基甲酸胺(dimethylformamide, DMF):上海生工生物工程技术服务有限公司分装产品。
[0057]3.3 仪器:
[0058]3.3.1电子天平JA1203N (AB204-5，METTLER TOLEDO):上海精密科学仪器公司产 品。
[0059]3.3.2SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台:苏州净化设备有限公司产品。
[0060]3.3.3隔水式恒温培养箱(GSP-9160MBE):上海一恒科学仪器有限公司产品。
[0061]3.3.4电热恒温培养箱(HZQ-F160A):上海一恒科学仪器有限公司产品。
[0062]3.3.5美菱电冰箱(B⑶-221CHC):合肥美菱股份有限公司产品。
[0063]3.3.6 微量移液器(Proline Pipette, DragonMed Pipette):芬兰雷勃公司产品。
[0064]3.3.7细胞计数板(96well cell culture cluster):上海求精仪器公司产品。
[0065]3.3.8普通光学显微镜(Olympus ):日本奥林巴斯光学仪器株式会社产品。
[0066]3.3.9干烤箱(101A-2):上海崇明实验仪器公司产品。
[0067]3.3.10立式高压蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50S II ):上海博讯实业有限公司产品。
[0068]3.3.11磁力加热搅拌器(ARE):意大利VELP公司产品。
[0069]3.3.12滤膜、滤器(0.22 u m, SART0RIUS):德国赛多利斯公司产品。
[0070]3.3.13酸度计(PHSJ-4A):上海精科雷磁公司产品。
[0071]3.3.14试管振荡器(MS2):广州仪科实验室技术公司产品。
[0072]3.3.15恒温振荡培养箱(THZ-18AB):上海一恒科学仪器公司产品。
[0073]3.3.16低温冰箱(_20°C，科龙B⑶-219WAK):广东科龙电器有限责任公司产品。
[0074]3.3.1796孔平底微量培养板:美国Corning Incorporated产品。
[0075]3.4实验方法:
[0076]3.4.1实验步骤:
[0077]3.4.1.1RPM1-1640液的配制:取10.4克RPM1-1640粉(含L谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，GIBC0)溶于900毫升无菌水中，加入34.53克三氮吗啡啉丙磺酸(MOPS)至其终点浓度为0.165摩尔/升，室温下用磁力搅拌器混匀2-3小时，使其充分溶解，用氢氧化钠(I摩尔/升)调节PH值至7.0 (25°C )，用灭菌水定容至I升，滤过除菌，分装后_20°C保存备用。
[0078]3.4.1.2储备液的制备:储备液浓度应为应用液的10倍，5-FC(5-氟尿嘧啶)和FCZ(氟康唑)为1，280微克/毫升，Amb (两性霉素B)和KETO (酮康唑)为320微克/毫升，用电子天平分别称取5-FC、FCZ、KETO和Amb各10毫克，5-FC用I毫升双蒸水溶解，FCZ用I毫升二甲基甲酰胺(DMF)溶解，Amb和KETO分别用二甲亚砜(DMSO)溶解，之后用RPM1-1640稀释至储存液浓度，分装后_70°C保存备用。
[0079]3.4.1.3应用液的制备:用RPM1-1640液将储备液作1:10稀释后再作倍比稀，FCZ、5-FC和Amb为128微克/毫升-0.25微克/毫升作10个系列的浓度，KETO为32微克/毫升-0.06微克/毫升10个系列浓度，均为2倍终浓度。
[0080]3.4.1.4微量药敏培养板的制备:使用一次性的96孔板，第1-10列分别加入10个浓度梯度的测试药物的应用液，从高浓度到低浓度。第11列加入RPM1-1640，每孔100微升，第12列作为空白对照，放入_20°C冰箱备用，使用时经_4°C、4°C和室温各I小时。
[0081 ] 3.4.1.5念珠菌的激活与稀释:将待测的菌株在YPD琼脂培养基(1%酵母抽提物，1%蛋白胨，2%葡萄糖)上激活两次后，取直径大于I毫米的菌落少许于3毫升无菌生理盐水中混匀制成菌悬液，取少许，用血细胞技术板计数四个大方格中的菌细胞数，取平均值X，此时菌细胞数为XX IO4CFU/毫升，用RPM1-1640液调整浓度为3X IO4CFU/毫升(两倍终浓度)。
[0082]3.4.1.6加样:在上述制备好的含有测试药物的培养板上加入念珠菌悬液,每孔100微升空白对照不加，震荡混匀后放入湿盒(防止微量板中的液体挥发而影响药物的浓度)35°C孵育24-48小时后观察结果。
[0083]3.4.1.7肉眼 判断结果:以生长对照空白为依据，以80%抑制(即MIC80)为观察终点，菌种生长明显减少，液体轻微混浊；同时阳性生长中生长良好，空白对照清亮，无细菌生长。质控菌株之MIC值在美国临床微生物实验室标准CLSI M27-A2方案规定的范围内，显示实验结果是有效的。
[0084]3.5实验结果:
[0085]3.5.1质控株对抗真菌药物的敏感性:四种阳性药物对质控菌株ATCC90029和98001标准株药敏结果符合CLSM27-A2方案对于质控株标准株的要求。即:重复3次以上进行AmB、5-FC、FCZ和KETO的MIC值变化不超过2个浓度梯度。
[0086]3.5.2测试样品(含双隆骨铺道蚁各提取部位和阳性对照)的抗真菌活性结果见表
1
[0087]表1测试样品对白色念珠菌各菌株的抑制作用
[0088]
【权利要求】
1.一种双隆骨铺道蚁有效部位，其特征为该有效部位是中药蚂蚁中的双隆骨铺道蚁虫体经有机溶剂提取后再经超滤膜分离技术法富集、精制而得，其中超滤膜超滤时分别采用截留分子量为5KDa和30KDa两种规格的超滤膜进行。
2.权利要求1所述之双隆骨铺道蚁抗真菌有效部位在制备防治真菌感染药物中的应用。
3.一种具有抗真菌感染的药物组合物，其特征是:该药物组合物含有治疗有效量的根据权利要求1的双隆骨铺道蚁抗真菌有效部位、药用辅料和药用载体。
4.根据权利要求3的药物组合物，其制剂形式是片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、涂剂、外用搽剂、膜剂、膏剂、喷剂、注射剂、透皮贴剂或气雾剂。
5.一种制备权利要求1所述双隆骨铺道蚁有效部位的方法，其特征是: a)用重量比为30-300倍量的有机溶剂室温浸泡提取双隆骨铺道蚁虫体，浸泡提取时间为2-24小时，减压浓缩回收溶剂，得到双隆骨铺道蚁粗提物I ;浸提后的虫体自然晾干； b)将经步骤a浸泡提取后晾干的虫体用组织匀浆机磨碎、匀浆，用重量比为30-300倍量的有机溶剂室温浸泡提取虫体浆，浸泡提取时间为2-24小时，减压浓缩回收溶剂，得到双隆骨铺道蚁提取部位II ;浸提后的虫体浆残渣自然晾干； c)用重量比为30-300倍量的有机溶剂加热提取步骤b中浸泡提取后晾干的虫体浆残渣，提取时间为0.5-12小时，减压浓缩回收溶剂，得到双隆骨铺道蚁提取部位III ； d)将步骤c得到的双隆骨铺 道蚁提取部位III用溶剂溶解后，用截留分子量为5KDa的超滤膜进行超滤，收集透过超滤膜的膜透过液，减压浓缩后干燥，得到双隆骨铺道蚁提取部位IV ;收集截留于超滤膜上的截留物，减压浓缩回收溶剂； e)将步骤d中的截留物用溶剂溶解后，用截留分子量为30KDa的超滤膜进行超滤，收集透过超滤膜的膜透过液，减压浓缩后干燥，粉碎得产品； 其中，有机溶剂是指以碳原子小于5的低级醇的水溶液。
6.根据权利要求5的方法，其特征是:所述有机溶剂是指50%-98%的乙醇或甲醇溶液；减压浓缩时的温度不超过80°C ;加热提取的温度为60°C -80°C ;干燥是指真空减压干燥或冷冻干燥。
【文档编号】A61K35/64GK103638056SQ201310606124
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】李辉, 薛志革, 巫秀美, 张成桂, 赵昱 申请人:大理学院