一种兔门静脉血栓模型的制作方法
【专利摘要】本发明模型制备，尤其涉及一种兔门静脉血栓模型。其采用门静脉结扎置管法建立兔门静脉血栓模型；①实验动物：新西兰白兔；②实验过程：A、术前准备：术前实验兔禁食过夜，自由饮水；B、麻醉；C、手术方法：麻醉后进行施术区备皮、消毒等术前准备，逐层进腹，分离门静脉，置管法插入2Fr的颈内静脉导管，以导管为内支撑，结扎门静脉，缝合固定，并引出体外，牢固固定。本发明模型通过结扎门静脉，造成局部血液淤滞、血管内皮环形压迫损伤，同时置有导管刺激，启动内、外源性凝血过程，提高了血栓形成率，为后期局部收集血液标本、动态静脉造影、局部注药等提供通道，经门脉造影发现造模后PVT最早发生时间为30min左右，成模率为75%以上。
【专利说明】一种兔门静脉血栓模型
【技术领域】
[0001]本发明涉及模型制备，尤其涉及一种兔门静脉血栓模型。
【背景技术】[0002]门静脉血栓形成(portal vein thrombosis, PVT )是指发生于门静脉主干、肠系膜上静脉、肠系膜下静脉或脾静脉的血栓，是肝硬化门静脉高压症患者针对脾脏功能亢进及食管胃底静脉曲张破裂出血行脾脏切除(或联合血管断流)术后严重并发症之一 [I]。Okuda报道日本病理协会247728例患者的尸解结果，门静脉栓塞的发生率为0.55%，肝硬化患者门静脉栓塞率为6.59%，脾切除术后PVT发生率为37.5%~43.5%[2]。一旦PVT形成可导致肝脏血流灌注不足及胃肠淤血加重，若同时合并急性肠系膜静脉血栓形成则可致肠坏死；广泛的门脉血栓将严重影响后期肝移植成功率[3]。故如何防治手术后PVT是外科临床极为关注的问题。
[0003]CN101961465A(2011-2-2)公开了一种治疗门静脉血栓的中药，然而该中药需要服用的时间长，并且对预防门静脉血栓的作用甚微。
[0004]静脉血栓动物模型是研究体内静脉血栓形成发病机制和评价各种治疗方法疗效的重要条件。Reyers等在1980年通过结扎大鼠下腔静脉首先建立大鼠深静脉血栓形成模型。此方法是通过结扎深静脉，导致静脉血液回流障碍，局部血流淤滞、缺氧，血管内皮细胞损伤，启动凝血过程。何晓凡采用单纯下腔静脉结扎法建立深静脉血栓家兔模型。Knight等采用静脉异物法建立犬、兔动物模型。具体方法为暴露静脉后，于其近端和远端分别上血管夹，向近心端插入自制的螺旋铜丝，缝合血管，确定血管再通后，逐层缝合。此方法暂时阻断局部血管血流，然后插入异物(铜丝)，启动内、外源性凝血过程，促发静脉血栓形成。此外还有机械打击损伤法、电流损伤法、血栓诱导剂致血栓形成法、球囊损伤法等诸多方法。文献报道兔造模后静脉血栓形成时间为22.3±2.5 min,成模率为65%。综合文献报道，制备兔静脉血栓模型者远少于大鼠静脉血栓模型，而兔门静脉血栓模型的制作更加稀少，可能与其制作方法复杂、费用高、造模术后管理困难等有关。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种形成时间短、能够有效观察血栓形成大小的兔门静脉血栓模型。
[0006]本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的:
兔门静脉血栓模型，其采用门静脉结扎置管法建立兔门静脉血栓模型；
①实验动物:健康，雌雄不限，清洁级新西兰白兔50只，体重2-4kg；
②实验过程:
A、术前准备:术前实验兔禁食过夜，自由饮水；
B、麻醉方法:氯胺酮(2ml /支，100 mg)和咪唑安定(5 ml /支，5mg)各2ml等体积混合液后，再以生理盐水I倍稀释，经耳缘静脉注射，并观察兔反应，当发现其头部下垂时即停止注射，30 min后若发现兔有苏醒躁动征象，可在不超过安全用量(两种药物安全用量:氯胺酮50 mg / kg,咪唑安定5 mg / kg)情况下,追加上述药物；
C、手术方法:麻醉后进行施术区备皮、消毒等术前准备，逐层进腹，分离门静脉，经自制半套管式置管法插入2Fr的颈内静脉导管，以导管为内支撑，3-0线结扎门静脉，每间隔I分钟结扎2分钟，共3次，撤除结扎线，导管以6-0 Prolene线缝合固定，并引出体外，牢固固定。
[0007]兔门静脉血栓模型评估药物防治血栓作用的方法，其随机分组后分别于血栓形成前及溶栓过程中应用rPSLG-1g，并收集实验组与对照组血栓形成时间、成栓率、血栓大小、溶栓后血管再通率及各时间点P-sel等观察指标，以此评价rPSLG-1g在预防PVT形成及溶栓过程中作用；
①门静脉血栓数据的获取:
A、通过实验兔动态门静脉造影获取血栓形成时间、部位及血栓再通率:造模或局部溶栓治疗后各时点将术后门静脉血栓模型兔蒙眼后置于大小合适的纸板盒内，将动脉延长管排气后与导管连接，并引至盒外以备用，造影剂量为30%优维显5ml等量稀释I倍后缓慢注入，以55KV、63mA及160mS为血管造影条件射片，动态观察门静脉成栓时间、部位范围及局部溶栓后血管栓塞再通情况，从而评价其药物预防作用和溶栓疗效；
B、通过实验兔门静脉解剖获取血栓大小:经兔耳缘静脉注射麻醉后，解剖显露门静脉，白炽灯光源透视照射下观察，结合挤压试验判定门静脉系统血栓形成部位，完整切除门静脉并纵向剖开血管，取出门脉血栓标本，测量其大小；按大小分为4等级:0级为无血栓，I级为纵径长小于等于0.5cm, 2级为纵径长0.6-1.5cm, 3级为纵径长1.6-2.0cm, 4级为纵径长大于等于2.1cm ；
C、通过实验兔门静脉导管抽取血液检测P-选择素含量:按各时间点抽取造模后实验兔门静脉血2ml，保存在装有含柠檬酸钠109 nmol / L的溶液0.3ml的试管中，即送实验室离心后，取血浆0.5ml置入-70°C冰箱，检测方法为ELISA法，按照公司提供的试剂盒说明进行操作。
[0008]一种穿刺置管器具，包括穿刺针、套设于穿刺针内的软管及与软管套接并超出软管尾端的支撑管，支撑管与穿刺针之间设有两端分别与支撑管、穿刺针相抵触的弹簧。
[0009]弹簧未被压缩时，支撑管及软管超出穿刺针前端；在穿刺过程中，受到人体组织的阻力，弹簧被压缩，支撑管及软管缩向穿刺针内部，当穿刺针进入人体体腔(如胸腔、腹腔)阻力减小后，支撑管及软管即被弹簧弹出，以此表明穿刺针针头已达正确位置，解决了【背景技术】中的不足；软管与支撑管贴合，且两者之间应略有张力，软管与穿刺针内壁之间留有间隙，以方便支撑管及软管的伸缩动作。
[0010]作为本发明的优选，所述支撑管与软管尾端交接处设有凸缘；所述穿刺针包括针头及手柄，针头尾部设有针帽，手柄与针帽为可拆卸连接；手柄靠近支撑管一端为限位缘，所述弹簧设于凸缘与限位缘之间。
[0011]手柄与针帽之间为可拆卸连接的优选方式为手柄与针帽之间采用螺纹连接。
[0012]作为本发明的优选，所述穿刺针还包括与手柄固定连接的伸缩袋；所述支撑管尾端穿出手柄位于伸缩袋中。
[0013]伸缩袋也可为具有 伸缩功能的管状物体。[0014]作为优选，伸缩袋与手柄一体连接；当穿刺针到达正确位置后，捏压伸缩袋尾部直至捏住支撑管，后慢慢退出穿刺针直至退出人体外；为方便退出穿刺针，支撑管超出手柄的长度都应大于针头进入人体的长度。
[0015]作为本发明的优选，所述伸缩袋、手柄及针头三者之间密封相通连接；所述伸缩袋透明。
[0016]伸缩袋透明，使操作者能清楚的看到支撑管的伸缩动作，以确定穿刺针是否已达正确的位置。
[0017]作为本发明的优选，所述软管头部设有一个或多个细孔。
[0018]研究发现PSGL-1是P-sel高亲和力配体，其主要表达于中性粒细胞和单核细胞。P-sel通过与PSGL-1结合，导致中性粒细胞β 2-整合素活化，活化后的β 2-整合素可与细胞间黏附分子-1结合，促进中性粒细胞酪氨酸磷酸化，诱导单核细胞释放单核细胞趋化蛋白-1及肿瘤坏死因子_α及淋巴细胞上迟现抗原-4及⑶Ilb的表达，最终导致血栓形成。而 PSGL-1 免疫球蛋白重组体(recombinant PSGL-1 immunoglobulin, rPSLG-1g)作为PSGL-1抗体，能通过竞争P-sel的天然配体的PSGL-1，以达到拮抗P_sel作用，从而抑制损伤动脉表面循环中血小板的活化，并能抑制活化血小板与中性粒细胞结合。通过阻断P-sel与其配体的相互作用对相关疾病的治疗具有重要意义。
[0019]体内血栓形成的凝血反应均起始于血小板活化，而血小板活化标志物是P选择素(P-selectin, P_sel)，其存在于血管内皮细胞的WeibelPalade小体膜上及血小板A颗粒膜上，可通过介导血小板、内皮细胞黏附及与白细胞的相互作用，参与启动血栓形成的病理生理起始过程，是血栓形成的重要介质和靶分子。动物实验证实采用P-sel或P-选择素糖蛋白配体-1 (PSGL-1)基因剔除技术后纤维蛋白形成和血栓块可明显减少。
[0020]此方法通过结扎门静脉，造成局部血液淤滞、血管内皮环形压迫损伤，同时置有导管刺激，启动内、外源性凝血过程，提高了血栓形成率，为后期局部收集血液标本、动态静脉造影、局部注药等提供通道。我们在原有模型基础上做了进一步改进，并经门脉造影发现造模后PVT最早发生时间为30 min左右，成模率为75%以上。
[0021]
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是rPSLG-1g在预防PVT形成中作用研究路线图；
图2是rPSLG-1g在PVT溶栓过程中作用研究路线图；
图3是实施例1结构剖示图；
图4是图1中A部放大图；
图5是实施例1中记忆性弯曲软管的结构示意图；
图6是实施例2中软管示意图。
[0023]图中，1、穿刺针，2、软管，3、支撑管，4、弹簧，31、凸缘，11、针头，111、针帽，12、手柄，121、限位缘，13、伸缩袋，21、细孔，32、通孔，22、接口，23、槽孔，33、密封塞。
【具体实施方式】
[0024]以下结合附图对本发明作进一步详细说明。[0025]本实验旨在通过门静脉置管结扎法建立稳定的门静脉血栓动物模型，通过随机对照实验方法，研究全身使用rPSLG-1g在PVT形成中预防作用，并采用局部给药观察其在PVT溶栓过程中作用及疗效，为rPSLG-1g防治PVT提供动物实验基础。
[0026]1、工作基础条件
(O人员组合及配备:本实验组人员配备及分工合理，共组建以下四小组:手术组、检验组、数据收集统计组及影像组。
[0027](2)科研项目工作条件:本院是地区专病中心，肝胆胰外科是省重点扶植学科。资金配套方面，医院以1:1配套。院中心实验室是本地区重点实验室，曾承担过多项省、部级及国家级科研项目，有着丰富的科研基础，已取得多项科研成果。现已具备本实验的所需的仪器设备、器械及动物试验条件，SAS9.1及SPSS17统计软件已就绪，可保证实验的顺利完成。
[0028](3)既往门静脉血栓相关的研究:本实验组既往承担过与本实验相关的市科技局科研项目:监测P-sel、TpP、D-D对门脉高压脾切后PVT早期预测研究(2010YSB08)，研究通过连续观察手术前及术后各时间点P-sel的变化，建立依时协变量COX风险模型，提示P-sel可作为门脉高压症脾切术后门脉血栓早期预测敏感指标，可指导早期药物预防。对于P-sel在脾切除术后PVT形成过程中表达规律及相关机理有了深入的研究，为进一步药物防治研究奠定了基础。
[0029](4)实验前期预实验:门静脉结扎置管法建立兔门静脉血栓模型的研制:我们已熟练掌握兔门静脉血栓模型的成模方法。按标书要求购得8只新西兰兔(实验动物许可证号:SCXK (浙)2009-0039)，成功造模6只，成模率为75%，造模后经门脉造影发现门静脉血栓最早时间为30min左右，解剖兔门静脉可正确评估血栓大小及范围，有利于评估药物的作用。
[0030]2、研究方法
(I)采用门静脉结扎置管法建立兔门静脉血栓模型。
[0031]①实验动物:健康，雌雄不限，清洁级新西兰白兔50只，体重2_4kg。
[0032]②实验过程:
A、术前准备:术前实验兔禁食过夜，自由饮水。
[0033]B、麻醉方法:氯胺酮(2 ml /支，100 mg)和咪唑安定(5 ml /支，5mg)各2ml等体积混合液后，再以生理盐水I倍稀释，经耳缘静脉注射，并观察兔反应，当发现其头部下垂时即停止注射，30 min后若发现兔有苏醒躁动征象，可在不超过安全用量(两种药物安全用量:氯胺酮50 mg / kg,咪唑安定5 mg / kg)情况下,追加上述药物。
[0034]C、手术方法:麻醉后进行施术区备皮、消毒等术前准备，逐层进腹，分离门静脉，经自制半套管式置管法插入2Fr的颈内静脉导管，以导管为内支撑，3-0线结扎门静脉，每间隔I分钟结扎2分钟，共3次，撤除结扎线，导管以6-0 Prolene线缝合固定，并引出体外，牢固固定。
[0035](2)研究数据收集:
随机分组后分别于血栓形成前及溶栓过程中应用rPSLG-1g，并收集实验组与对照组血栓形成时间、成栓率、血栓大小、溶栓后血管再通率及各时间点P-sel等观察指标，以此评价rPSLG-1g在预防PVT形成及溶栓过程中作用。[0036]②门静脉血栓数据的获取:
A、通过实验兔动态门静脉造影获取血栓形成时间、部位及血栓再通率:造模或局部溶栓治疗后各时点将术后门静脉血栓模型兔蒙眼后置于大小合适的纸板盒内，将动脉延长管排气后与导管连接，并引至盒外以备用，造影剂量为30%优维显5ml等量稀释I倍后缓慢注入，以55KV、63mA及160mS为血管造影条件射片，动态观察门静脉成栓时间、部位范围及局部溶栓后血管栓塞再通情况，从而评价其药物预防作用和溶栓疗效。
[0037]B、通过实验兔门静脉解剖获取血栓大小:经兔耳缘静脉注射麻醉后，解剖显露门静脉，白炽灯光源透视照射下观察，结合挤压试验判定门静脉系统血栓形成部位，完整切除门静脉并纵向剖开血管，取出门脉血栓标本，测量其大小。按大小分为4等级:0级为无血栓，I级为纵径长小于等于0.5cm, 2级为纵径长0.6-1.5cm, 3级为纵径长1.6-2.0cm, 4级为纵径长大于等于2.1cm0
[0038]C、通过实验兔门静脉导管抽取血液检测P-选择素含量:按各时间点抽取造模后实验兔门静脉血2ml，保存在装有含柠檬酸钠109 nmol / L的溶液0.3ml的试管中，即送实验室离心后，取血浆0.5ml置人-70°C冰箱，检测方法为ELISA法，按照公司提供的试剂盒说明进行操作。
[0039](3)技术路线图
①rPSLG-1g在预防PVT形成中作用研究(实验一)
具体实验路线见图1。
[0040]③rPSLG-1g在PVT溶栓过程中作用研究(实验二)
具体实验路线见图2。
[0041](4)统计分析，得出实验结论。
[0042]采用SAS9.1及SPSS17.0统计软件，分别对全身预防性用药(实验一)与局部溶栓性用药(实验二)建立如下的统计模型，进行相关的统计分析:
①针对实验一中PVT形成时间和实验二中溶栓时间的观测值，建立上述两种情形下实验组和对照组时间曲线的Kaplan-Meier估计，并利用1grank检验比较其分布曲线的差
异；
②针对实验一和实验二，分别建立实验组与对照组样本的P- s el随时间变化的均值-方差模型与非参数模型，体现不同情形下P-sel分布及变化的规律与特征；
③在②的基础上，分别以血栓形成率和血管再通率为响应变量，以P-sel、实验组与对照组为协变量，建立两个实验不同时间的logistic模型，定量描述rPSLG-1g使用对预防PVT形成和促使溶栓的整体效果；
④对实验一，在③的基础上，进一步建立有序多分类的logistic模型，研究rPSLG-1g使用对形成血栓大小等级的影响；对实验二，可以分别通过溶栓时间曲线和优势比(OddsRatio)来比较单独使用rPSLG-1g、尿激酶在PVT溶栓中的影响。
[0043]实施例一
一种穿刺置管器具，如图3至5所示，包括穿刺针1，穿刺针1内套设有软管2，穿刺针1与软管2之间略有间隙，软管2套接有支撑管3，软管2头端与支撑管3头端相贴，支撑管3尾端超出软管2尾端。
[0044]支撑管3与软管2尾端交接处设有凸缘31 ;穿刺针I包括针头11，针头11尾部设有针帽111，针帽111螺纹连接有手柄12,手柄12靠近支撑管3 —端为限位缘121,凸缘31与限位缘121之间设有弹簧4，在弹出支撑管3时，应只能够将支撑管3及软管2的头端略超出针头11的针尖；限位缘121上设有三个卡扣，卡扣固定连接弹簧4，卡扣在图中未示出。
[0045]手柄12 —体连接有伸缩袋13 ;支撑管3尾端穿过弹簧4且穿出手柄12伸入伸缩袋13中，针头11到达正确位置后，针头11进入人体的长度应短于支撑管3超出手柄12的长度。
[0046]伸缩袋13、手柄12及针头11三者之间密封相通连接。
[0047]伸缩袋13透明，操作者可从伸缩袋13外清楚地看见支撑管3的伸缩动作以确定针头11是否已达正确的位置。
[0048]软管2尾部为一接口 22,接口 22为与软管2软质部分一体的硬管,硬管外壁设有螺纹，通过接口 22可将软管22与其它医疗工具连接。
[0049]软管2为记忆性弯曲软管，记忆性弯曲软管可定义为由一定柔韧性材料制成的呈向内卷曲状的弯曲管，当该管子套在支撑管3外时弯曲的管子被支撑管3管体支撑成直管，但当支撑管3脱离该管子后，该管子自动恢复成原来的向内卷曲状，即为所述的记忆性弯曲软管。
[0050]软管2头部设有多个细孔21。
[0051]支撑管3头部设有多个通孔32，支撑管3头端与软管2头端相贴时，软管2上的部分细孔21与通孔32相通，通孔3`2的孔径大于细孔21的孔径。
[0052]支撑管3尾端设有密封塞33密封，当针头11到达正确位置时，一些积液会经过细孔21及通孔32进入支撑管3内，支撑管3透明设置，由于伸缩袋13也透明，操作者可在伸缩袋13外看到上述情况。
[0053]在穿刺过程中，操作者若看到支撑管3向人体内弹出，则表明针头11已达正确位置；若不慎没看见支撑管3的伸缩动作，但看见支撑管3内流入了积液，则也表明针头11已达正确位置；此时停止穿刺，一手捏压伸缩袋13直至捏住支撑管3，另一手捏住手柄12，将针头11退出人体外，后捏住软管2向外慢慢退支撑管3，当支撑管3头端退出人体外但仍位于软管2内时，用夹子夹住软管2位于支撑管3头端与人体之间的一段，再慢慢退出支撑管3直至脱离软管2，此时再将其它医疗工具与接口 22连接，以抽出患者体内积液(气)或注入药物治疗。
[0054]实施例2:与实施例1的不同之处在于，如图6所示，所述软管2为一直管，直管头部侧面开有多个槽孔23。
[0055]本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
【权利要求】
1.一种兔门静脉血栓模型，其特征在于:采用门静脉结扎置管法建立兔门静脉血栓模型； ①实验动物:健康，雌雄不限，清洁级新西兰白兔50只，体重2-4kg； ②实验过程: A、术前准备:术前实验兔禁食过夜，自由饮水； B、麻醉方法:氯胺酮(2ml /支，100 mg)和咪唑安定(5 ml /支，5mg)各2ml等体积混合液后，再以生理盐水I倍稀释，经耳缘静脉注射，并观察兔反应，当发现其头部下垂时即停止注射，30 min后若发现兔有苏醒躁动征象，可在不超过安全用量(两种药物安全用量:氯胺酮50 mg / kg,咪唑安定5 mg / kg)情况下,追加上述药物； C、手术方法:麻醉后进行施术区备皮、消毒等术前准备，逐层进腹，分离门静脉，经自制半套管式置管法插入2Fr的颈内静脉导管，以导管为内支撑，3-0线结扎门静脉，每间隔I分钟结扎2分钟，共3次，撤除结扎线，导管以6-0 Prolene线缝合固定，并引出体外，牢固固定。
2.一种利用权利要求1所述兔门静脉血栓模型评估药物防治血栓作用的方法，其特征在于:随机分组后分别于血栓形成前及溶栓过程中应用rPSLG-1g，并收集实验组与对照组血栓形成时间、成栓率、血栓大小、溶栓后血管再通率及各时间点P-sel等观察指标，以此评价rPSLG-1g在预防PVT形成及溶栓过程中作用； 门静脉血栓数据的获取: A、通过实验兔动态门静脉造影获取血栓形成时间、部位及血栓再通率:造模或局部溶栓治疗后各时点将术后门静脉血栓模型兔蒙眼后置于大小合适的纸板盒内，将动脉延长管排气后与导管连接，并引至盒外以备用，造影剂量为30%优维显5ml等量稀释I倍后缓慢注入，以55KV、63mA及160mS为血管造影条件射片，动态观察门静脉成栓时间、部位范围及局部溶栓后血管栓塞再通情况，从而评价其药物预防作用和溶栓疗效； B、通过实验兔门静脉解剖获取血栓大小:经兔耳缘静脉注射麻醉后，解剖显露门静脉，白炽灯光源透视照射下观察，结合挤压试验判定门静脉系统血栓形成部位，完整切除门静脉并纵向剖开血管，取出门脉血栓标本，测量其大小；按大小分为4等级:0级为无血栓，I级为纵径长小于等于0.5cm, 2级为纵径长0.6-1.5cm, 3级为纵径长1.6-2.0cm, 4级为纵径长大于等于2.1cm ； C、通过实验兔门静脉导管抽取血液检测P-选择素含量:按各时间点抽取造模后实验兔门静脉血2ml，保存在装有含柠檬酸钠109 nmol / L的溶液0.3ml的试管中，即送实验室离心后，取血浆0.5ml置入-70°C冰箱，检测方法为ELISA法，按照公司提供的试剂盒说明进行操作。
3.一种用于制备权利要求1所述兔门静脉血栓模型的一种穿刺置管器具，其特征在于，包括穿刺针(I)、套设于穿刺针(I)内的软管(2)及与软管(2)套接并超出软管(2)尾端的支撑管(3)，支撑管(3)与穿刺针(I)之间设有两端分别与支撑管(3)、穿刺针(I)相抵触的弹黃(4)。
4.根据权利要求3所述的一种穿刺置管器具，其特征在于，所述支撑管(3)与软管(2)尾端交接处设有凸缘(31);所述穿刺针(I)包括针头(11)及手柄(12)，针头(11)尾部设有针帽(111),手柄(12 )与针帽(111)为可拆卸连接；手柄(12 )靠近支撑管(3 ) 一端为限位缘. (121)，所述弹簧(4)设于凸缘(31)与限位缘(121)之间。
【文档编号】A61K49/00GK103637854SQ201310707588
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】魏云海, 张国雷, 戴利成, 慎华平, 吴万波, 徐杰伟 申请人:魏云海