降低含油佐剂和含表面活性剂抗原之间的干扰的制作方法
【专利摘要】疫苗组合物中包含脂肪族佐剂会引起难以包含某些抗原性组分，特别是包含表面活性剂组分的抗原。制备含有抗原和脂肪族佐剂的免疫原性组合物的方法包括在不存在表面活性剂的情况下基本纯化抗原。不能避免采用表面活性剂时，混合以下组分：(i)含有表面活性剂的抗原组分和(ii)脂肪族佐剂组分，得到所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于1000:1的组合物。
【专利说明】降低含油佐剂和含表面活性剂抗原之间的干扰
[0001]本申请是国际申请PCT/IB2006/002581，国际申请日2006年8月2日，中国国家阶段申请号200680034084.4的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及生产含佐剂疫苗的领域。具体说，本发明涉及在生产基于含表面活性剂抗原的疫苗的过程中使用脂肪族佐剂。
【背景技术】
[0003]采用佐剂能提高对疫苗抗原的免疫应答是众所周知的(参见例如参考文献I和
2)。许多年以来，批准人用的唯一佐剂是铝盐，但许多国家已经批准了含有MF59佐剂和RC-529佐剂的疫苗，包括意大利(在希龙公司(Chiron)的FLUAD?产品中)和阿根廷(在伯纳生物科技公司(Berna Biotech)的SUPERVAX?产品中)。处于后期人用实验阶段的其它佐剂包括胆固醇和皂苷、ISC0M、MPL?、AS04、病毒颗粒、SBA4等的混合物。
[0004]一些铝盐替代物的共有特征是存在脂肪族组分。例如，MF59佐剂包含鲨烯(油)，MPL?包含带有多个脂肪酸链连接于二葡糖胺主链的脱酰基化形式的单磷酰基脂质A。
[0005]本发明涉及避免这些脂肪族佐剂和含有表面活性剂组分的抗原之间可能发生的干扰。
[0006]发明概述
[0007]本
【发明者】发现，疫苗组合物中的脂肪族佐剂可能与含有表面活性剂组分的抗原不相容。然而，在许多情况下，`仍然需要合并脂肪族佐剂和抗原/表面活性剂混合物，本发明的目的之一是提供避免这样做的过程中可能产生的困难的方式。另一目的是提供合并佐剂和抗原的方法，该方法可以避免不相容。
[0008]为了避免使用一般采用表面活性剂纯化的抗原时的这些不相容问题，本发明的第一个方面提供了一种制备免疫原性组合物的方法，其中:(a)该组合物含有抗原和脂肪族佐剂；和(b)在不存在表面活性剂的情况下基本纯化该抗原。采用避免使用表面活性剂的替代方法来纯化抗原，可解决对脂肪族佐剂的任何不相容性问题。
[0009]然而，出于临床、历史或法规原因，可能无法在不采用表面活性剂的情况下纯化抗原，或者完全去除疫苗中的表面活性剂。在这种情况下，本发明通过降低组合物中油与表面活性剂的比例避免了干扰。典型MF59/HBsAg疫苗所含的油量远高于表面活性剂，油与表面活性剂的比例超过4000:1 (重量比)。本发明的目标是最大程度减少组合物中脂肪族佐剂的含量，在第二方面，本发明采用的油量为至多重量过量1000倍。因此，本发明提供了一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括合并(i)含有表面活性剂的抗原组分和(ii)脂肪族佐剂组分的步骤，以得到所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于1000:1的组合物。相似地，本发明提供了免疫原性组合物，其中:(a)所述组合物含有抗原组分和脂肪族佐剂组分；(b)所述抗原组分含有表面活性剂；和(C)所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于1000:1。[0010]脂肪族佐剂
[0011]本发明的第一和第二方面都使用了脂肪族佐剂，即含有脂肪族分子的佐剂组分。典型的脂肪族佐剂含有可代谢油、脂肪酸和/或含有脂肪酸部分的分子。
[0012]两种优选脂肪族佐剂是称为’ MF59’和’ MPL’的佐剂。’ MF59’是脂肪族佐剂，因为其含有作为可代谢油的鲨烯。’MPL’是脂肪族佐剂，因为它含有用多个脂肪酸链取代的二糖。除MF59以外，还可采用其它水包油乳剂佐剂。
[0013]因此，本发明优选组合物包含:(a)水包油乳剂，如含有鲨烯和聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯(任选为山梨聚糖三油酸酯)的亚微米水包油乳剂；和/或(b)3-0-脱酰基化的单磷酰基脂质A。聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯也称为聚山梨酯80。
[0014]除’MF59’和’MPL’以外，可用于本发明的其它脂肪族佐剂包括但不限于:氨基葡萄糖苷磷酸酯衍生物；N-酰基-假二肽；来源于大肠杆菌(Escherichia coli)脂质A的可溶性佐剂’ 0M-174’ ；含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物；和无环合成脂质A类似物。
[0015]采用如MF59等水包油乳剂佐剂时，一般加入等体积的水性抗原组合物，以使该乳剂占组合物总体积的50%。采用3D-MPL佐剂时，剂量一般为25 μ g/ml-200 μ g/ml,如50-150 μ g/ml,75-125 μ g/ml,90-110 μ g/ml 或约 100 μ g/ml。通常每个剂量施用 25-75 μ g的3D-MPL，如45-55 μ g,或每剂量约50 μ g3D_MPL。如MF59等乳剂佐剂一般与抗原分开，在独立的容器中提供，在使用时临时混合；或者可以与抗原混合的状态提供乳剂佐剂。3D-MPL佐剂一般在销售给最终使用者之前就已经与抗原混合。
[0016]MF59
[0017]’Mp59’佐剂是由S烯、吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和Span85(山梨聚糖三油酸酯)形成的水包油乳剂。使该乳剂微流化，以得到具有亚微米液滴尺寸的乳剂。MF59的制备最初报道于参考文献3，希龙公司生产和出售该产品。其它细节可参见参考文献2的第10章、参考文献I的第12章和参考文献4-6。MF59的体积组成为:5%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.5%Span85。以重量计，这些比值变为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%Span85。在本发明第二个方面，计算油:表面活性剂的比例时不计入MF59自身的表面活性剂含量，因为该比值基于抗原的表面活性剂含量。
[0018]MP59乳剂宜含有柠檬酸根离子，如IOmM柠檬酸钠缓冲液。
[0019]其它水包油乳剂
[0020]作为MF59佐剂的替代物，可采用其它水包油乳剂。佐剂乳剂一般含有至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中油滴的直径通常小于5 μ m，一般为亚微米直径。可采用微流化床实现小液滴尺寸，以提供稳定的乳剂。优选小于2 20nm的液滴，因为可对它们进行过滤除菌。
[0021]乳剂可包括油，如来自动物(如鱼)或植物的油，而非矿物油。植物油的来源包括坚果、种子和谷粒。坚果油中，最常见的例子是花生油、大豆油、椰油和橄榄油。例如，也可采用获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种子油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油最常见，但也可采用其它谷粒如小麦、燕麦、大麦、水稻、画眉草、黑小麦等的油。虽然天然情况下种子油中不存在甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，但能以坚果油和种子油为原料，通过对其中适当的物质进行水解、分离和酯化来制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯净的油所必需的分离、纯化、皂化和其它步骤是本领域众所周知的。大多数鱼含有易于回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡等鲸油是可用于本发明的几种鱼油。以5-碳异戊二烯单元生化合成许多支链油，它们总称为类萜。鲨鱼肝油含有支链不饱和类萜，称为鲨烯、2,6, 10, 15，19，23-六甲基-2，6，10, 14，18，22-二十四己烯，它是本文尤其优选的类萜。鲨烯的饱和类似物鲨烷也是优选油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷，可购自商业来源，或者通过本领域已知方法获得。其它优选油是生育酚(见下)。可采用油的混合物。[0022]可通过’ HLB’ (亲水/亲脂平衡)对表面活性剂进行分类。本发明优选表面活性剂的HLB为至少10、优选至少15、更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于:聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂(通常称作吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80;环氧乙烷(E0)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，商品名为D0WFAX?，如直链Ε0/Ρ0嵌段共聚物；辛苯聚糖，其中重复的乙氧基(氧-1，2-乙烷二基)数量可以变化，特别感兴趣的是辛苯聚糖-9 (Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);如磷脂酰胆碱(卵磷脂)等磷脂；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(Brij30);和山梨聚糖酯(通常称作SPAN)，如山梨聚糖三油酸酯(Span85)和山梨聚糖单月桂酸酯。乳剂中包含的表面活性剂优选为吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)、Span85(山梨聚糖三油酸酯)、卵磷脂和Triton X-100。表面活性剂混合物可采用(例如)吐温80/Span85混合物，或吐温80/Triton_X100混合物。
[0023]用于本发明的水包油乳剂佐剂包括但不限于:
[0024]?鲨烯、生育酚和吐温80的乳剂。该乳剂可包含磷酸盐缓冲盐水。它还可包含Span85 (如1%)和/或卵磷脂。这些乳剂可含有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐温80，鲨烯与生育酚的重量比优选≤1，因为这能提供更稳定的乳剂。可将吐温80溶解于PBS得到2%溶液，然后将90ml这种溶液与(5g DL- α -生育酚和5ml鲨烯)的混合物混合，然后微流化该混合物，从而制备一种这类乳剂。得到的乳剂可含有亚微米油滴，例如平均直径为100-250nm，优选约180nm的油滴。
[0025].S烯、生育酹和Triton去污剂(如Triton X-100)的乳剂。
[0026]?鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401 (〃普朗尼克? L121")的乳剂。可用磷酸盐缓冲盐水，PH7.4配制该乳剂。这种乳剂是可用于胞壁酰二肽的递送载体，已经在〃SAF-1〃佐剂[7] (0.05-l%Thr-MDP、5%鲨烷、2.5%普朗尼克L121和0.2%聚山梨酯80)中与苏氨酰基-MDP联用。还可采用不含Thr-MDP的佐剂，如〃AF〃佐剂[8] (5%鲨烷，1.25%普朗尼克L121和0.2%聚山梨酯80)。优选微流化。
[0027]?含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳剂。如参考文献9所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。
[0028].不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或Span80)的亚微米水包油乳剂。可包含添加剂，如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂肪族胺加到脱酰基皂苷上产生的GP1-0100，参见参考文献10)、二甲基二 (十八烷基)溴化铵和/或N，N-二 (十八烷基)-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。[0029].皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)联结成螺旋胶束的乳剂[11]。
[0030]优选在临用前、递送时混合乳剂与抗原。因此，在包装或销售的疫苗中，一般将佐剂和抗原分开保存，在使用时配制成最终制剂。该抗原通常为水性形式，以便通过混合两种液体最终制备该疫苗。用于混合的两种液体的体积比可变(如5:1-1:5)，但通常约为1:1。
[0031]当组合物含有生育酚时，可采用α、β、Υ、δ、ε或ξ生育酚中的任一种，但优选α-生育酚。生育酚可以取数种形式，如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。优选的α -生育酚是DL-α-生育酚，此生育酚的优选盐是琥珀酸盐。
[0032]3D-MPL
[0033]3-0-脱酰基化的单磷酰基脂质A (3D-MPL ；也被称为3脱_0_酰基化的单磷酰基脂质A或3-0-脱酰基-4’ -单磷酰基脂质Α)，它是已知佐剂。该名称表明，单磷酰基脂质A中的还原端葡糖胺的3位被脱酰基化。3D-MPL可由明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体制备，在化学上类似于脂质A，但缺少对酸敏感的磷酰基和对碱敏感的酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞系的细胞，并刺激释放几种细胞因子，包括IL-1、IL-12、TNF-α和GM-CSF。最初在参考文献12中描述了 3D-MPL的制备，该产品由科雷萨公司(Corixa Corporation)以商品名MPL生产并出售。其它详情可参见参考文献13-16。
[0034]3D-MPL可以取酰基化不同的相关分子(如具有3、4、5或6个酰基链，它们的长度可以不同)的混合物的形式。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖在其2-位(即2和2’位)碳上N-酰基化，3’位上也有O-酰基化。连接于碳2的基团化学式为:-NH-CO-CH2-CR1Ri'。连接于碳2’的基团化学式为:-NH-CO-CH2-CR2R2'。连接于碳3’的基团化学式为:-O-CO-CH2-CR3R3'。代表性结构是:
[0035]
【权利要求】
1.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括混合以下所述组分α)和(ii)的步骤: (i)含有表面活性剂的病毒表面抗原组分；和 (?)脂肪族佐剂组分，所述脂肪族佐剂 (a)包含可代谢油，或或者 (b)是3-脱氧酰基化的单磷酰基脂质A，所需为3D-MPL； 所得组合物中，所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于1000:1。
2.如权利要求1所述的方法，所述脂肪族佐剂包含可代谢油。
3.如权利要求2所述的方法，所述脂肪族佐剂包含鲨烯和聚山梨酯80的亚微米水包油乳剂。
4.如权利要求1所述的方法，所述脂肪族佐剂是吸附于磷酸铝上的3D-MPL。
5.如权利要求4所述的方法，所述3D-MPL是不同酰基化分子的混合物。
6.如权利要求4或5所述的方法，所述脂肪族佐剂包括:
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7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，所述3D-MPL是颗粒形式。
8.如权利要求7所述的方法，所述颗粒可过滤除菌。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述表面活性剂是聚氧乙烯山梨聚糖酯。
10.如权利要求9所述的方法，所述酯是聚山梨酯20。
11.如权利要求9或10所述的方法，所述表面活性剂的浓度不高于50μ g/ml。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述病毒表面抗原是在表面活性剂存在下纯化的颗粒乙型肝炎表面抗原HBsAg。
13.如权利要求12所述的方法，所述HBsAg是在酵母细胞中表达的。
14.如权利要求13所述的方法，所述酵母是酿酒酵母。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，所述HBsAg是非糖基化的，并且/或者包括磷脂酰肌醇。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法,所述HBsAg来自乙型肝炎病毒的adw2亚型。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述抗原是包含病毒表面抗原和异源抗原的杂交蛋白。
18.如权利要求17所述的方法，所述病毒表面抗原是HBsAg，所述异源抗原是疟疾抗原。
19.如权利要求18所述的方法，所述杂交蛋白包含HBsAg和恶性疟原虫的环孢子体蛋白的片段。
20.如权利要求19所述的方法，所述杂交蛋白包含恶性疟原虫环孢子体蛋白的C端部分、环孢子体蛋白优势免疫区的四个或多个串联重复序列和HBsAg。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于500:1。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述脂肪族佐剂与所述表面活性剂的重量比小于50:1。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述脂肪族佐剂是吸附于磷酸铝上的3D-MPL，所述脂肪族佐剂 与所述表面活性剂的重量比为2.5:1-25:1。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述组合物的渗透压为200m0sm/kg_400m0sm/kg。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述组合物包含磷酸盐缓冲液。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述组合物的pH为6.0-7.0。
27.以下物质在生产施用于患者的药物中的应用: (i)包含表面活性剂的病毒表面抗原组分，和 (?)脂肪族佐剂，该佐剂 (a)包含可代谢油，或 (b)是吸附于磷酸铝的3D-MPL； 其中，所述脂肪族佐剂(ii)与所述表面活性剂(i)的重量比小于1000:1。
28.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括混合(i)含有聚山梨酯20的HBsAg组分和(ii)佐剂组分的步骤，其中，所述佐剂组分包含吸附于磷酸铝的3D-MPL，所得组合物中3D-MPL与聚山梨酯20的重量比小于1000:1。
29.一种免疫原性组合物，其中:(a)所述组合物含有HBsAg、聚山梨酯20、和吸附于磷酸铝的3D-MPL，其中，聚山梨酯20在纯化期间掺入HBsAg ;和(b) 3D-MPL与聚山梨酯20的重量比小于1000:1 ;并且(C)HBsAg的浓度为40 μ g/ml。
【文档编号】A61P31/12GK103690945SQ201310726997
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2006年8月2日 优先权日:2005年8月2日
【发明者】M·肯托尼 申请人:诺华疫苗和诊断有限公司