对cars的抗肿瘤活性的毒性管理的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于治疗患者中的癌症的组合物和方法。在一个实施方式中，该方法包括第一线治疗，该第一线治疗包括给予对其有需要的患者表达CAR的遗传修饰的T细胞，其中CAR包括抗原结合域、跨膜结构域、共刺激信号传递区、和CD3ζ信号传导域，并且监测T细胞输注后患者中的细胞因子水平，以根据患者中CAR T细胞的存在的结果，确定适合治疗患者的第二线治疗的类型。
【专利说明】对CARS的抗肿瘤活性的毒性管理
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年7月13日提交的美国临时专利申请号61/671，482和2013年 3月14日提交的美国临时专利申请号61/782, 982的优先权，各案通过引用以其全文并入于 此。
[0003] 发明背景
[0004] 患有复发的并且化疗难治的急性淋巴细胞白血病（ALL)的患者具有不良的预 后，尽管使用了积极治疗，例如异源造血干细胞移植（Barrett (巴雷特）等人，N Engl J Med(新英格兰医学杂志）331:1253-8 ;Gokbuget (格克比盖特）等人，2012, Blood(血 液）120:2032-41)和双特异性CD19抗体片段（Bargou(巴戈）等人，2008, Science (科 学）321:974-7)。已经报道，在患有CLL和B细胞淋巴瘤的成年人中，靶向种系特异性抗原 CD19和CD20的嵌合抗原受体修饰的T细胞是有效的（Till (提尔）等人，2008, Blood (血 液）112:2261-71 ;Kochenderfer(考琴德佛）等人，2010, Blood(血液）116:4099-102 ; Brentjens (布伦蒂安斯）等人，2011，Blood(血液）118:4817-28 ;Porter (波特）等人， 2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine (科学转化医学）3:95ra73;Savoldo (萨沃尔托）等人，2011，J Clin Invest(临床研宄杂志）121:1822-5)。然而，仍未充分研宄，CAR T细胞对ALL母细 胞，一种具有更快速进展的更不成熟的白血病的作用。
[0005] 已经报道，肿瘤溶解综合征的延迟发作和细胞因子分泌，与有力的体内嵌合抗 原受体T细胞扩张组合（Porter (波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂 志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine(科学转 化医学）3:95ra73)。然而，仍未充分研宄，细胞因子分泌的作用和与体内嵌合抗原受体T细 胞扩张关联的失调。
[0006] 因此，在本领域中，对用于使用CAR治疗癌症并且解决CAR的毒性的组合物和方法 存在迫切需要。本发明解决了这一需要。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提供了治疗患有与提尚的肿瘤抗原表达关联的疾病、失调或病症的患者的 方法。在一个实施方式中，该方法包括给予对其有需要的患者第一线治疗和第二线治疗，其 中该第一线治疗包括给予患者有效量的遗传修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结 合域、跨膜结构域、和细胞内信号传导域。
[0009] 在一个实施方式中，在给予第一线治疗后，监测患者中的细胞因子水平，以确定待 给予至患者的第二线治疗的适当类型，并且给予对其有需要的患者适当的第二线治疗。
[0010] 在一个实施方式中，细胞因子水平的增加鉴定待给予至对其有需要的患者的细胞 因子抑制治疗的类型。
[0011] 在一个实施方式中，细胞因子选自 IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I 0、MCP-1、 TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-0、 ⑶40、⑶40L、铁蛋白、以及它们的任何组合。
[0012] 在一个实施方式中，细胞因子抑制治疗选自小干扰RNA(SiRNA)、微RNA、反义核 酸、核酶、编码反式显性负性突变体的表达载体、抗体、肽、小分子、细胞因子抑制药物、以及 它们的任何组合。
[0013] 在一个实施方式中，通过检测来自患者的生物样品中的细胞因子的蛋白水平来监 测细胞因子水平。
[0014] 在一个实施方式中，通过检测来自患者的生物样品中的细胞因子的核酸水平来监 测细胞因子水平。
[0015] 本发明提供了减少或避免与给予遗传修饰以表达CAR的细胞关联的不良作用的 方法，其中CAR包括抗原结合域、跨膜结构域、以及细胞内信号传导域，该方法包括监测患 者中细胞因子的水平以确定待给予至患者的细胞因子治疗的适当类型并且给予适当的细 胞因子治疗至患者。
[0016] 在一个实施方式中，细胞因子水平的增加鉴定待给予至患者的细胞因子抑制治疗 的类型。
[0017] 在一个实施方式中，细胞因子选自 IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、 IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I 0、MCP-1、 TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、FGF-0、 ⑶40、⑶40L、铁蛋白、以及它们的任何组合。
[0018] 在一个实施方式中，细胞因子抑制治疗选自小干扰RNA(SiRNA)、微RNA、反义核 酸、核酶、编码反式显性负性突变体的表达载体、细胞内抗体、肽、小分子、细胞因子抑制药 物、以及它们的任何组合。
[0019] 在一个实施方式中，通过检测来自患者的生物样品中的细胞因子的蛋白水平来监 测细胞因子水平。
[0020] 在一个实施方式中，通过检测来自患者的生物样品中的细胞因子的核酸水平来监 测细胞因子水平。
[0021] 附图简述
[0022] 当结合附图进行阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细说明。 出于说明本发明的目的，在附图中示出的是目前优选的实施方式。然而，应当理解的是，本 发明并不局限于附图中示出的实施方式的精确安排和机构。
[0023] 图1是证明四个不同患者中的血清细胞因子水平的图。所有的患者显示细胞因子 释放，包括IL-6。
[0024] 图2是描绘了代表性患者中标绘的的血清细胞因子的图。患者在第5至7天病危， 并且仅在塔西单抗给予之后开始改善。
[0025] 图3是如对T细胞活性标记（穿孔素和IFN- y )进行测量，证明抗体干预并不影 响CART 19细胞功能性的图。
[0026] 图4,包括图4A直至4C，是描绘了临床反应的一系列图。图4A示出了用CTL019 细胞治疗的、在第〇天输注的患有多次复发的化疗难治的CD19+B细胞前体急性成淋巴细 胞白血病的两个儿童。在CTL019输注后，血清乳酸脱氢酶（LDH)和体温的改变，其中用 圆圈区分每24小时时期的最高温度。给予CH0P-100,在第5天以2mg/kg/天开始甲泼 尼龙，在第12天之前逐渐变少至消失。在第7天早晨，给予依那西普0.8mg/kg x 1。在 第7天晚上6pm，给予塔西单抗8mg/kg X 1。在CHOP-IOO中，在第5天给予皮质激素下， 发生发热的短暂改善，其中在第8天，在给予由依那西普和塔西单抗组成的细胞因子定向 治疗后，发生发热的完全解决。图4B示出了在CTL019输注后，在频繁的时间点测量的 血清细胞因子和炎症标记。使用具有来自基线的倍数变化的半对数图示出了细胞因子 值。针对每个分析物的基线（输注之前的第0天）值（pg/ml血清）为（CH0P-100, CHOP- 101) :ILl-0 : (0. 9, 0. 2) ；IL-6: (4. 3, I. 9) ；TNF-a ： (I. 5, 0. 4) ；IL2Ra ： (418. 8, 205. 7)； IL-2: (0. 7,0. 4) ;IL-10(9. 9,2. 3) ;ILlRa : (43. 9,27. 9)。两个患者在多个细胞因子和细 胞因子受体--包括可溶白细胞介素 IA和2受体（IL-1RA和IL-2R)，白细胞介素2、6和 !?(〖!^、〖!^和几-⑴沁肿瘤坏死因子"汀即^沁和干扰素-丫丨預?-^--方面出现 显著升高。图4C示出了循环绝对中性粒细胞计数（ANC)、绝对淋巴细胞计数（ALC)和白细 胞（WBC)计数的改变。值得注意的是，ALC的增加主要由激活的CT019T淋巴细胞组成。
[0027] 图5,包括图5A直至5D，是描绘了在周围血液、骨髓和CSF中CTL019细胞的扩张 和可视化的一系列图。图5A示出了用抗体染色的周围血液的流式细胞术分析，以检测CD3 和抗-⑶19CAR。描绘的是在CH0P-100和CH0P-101中，表达CAR的⑶3细胞的百分比。图 5B示出了通过实时定量PCR，CTL019T细胞在周围血液、骨髓和CSF中的存在。从在CTL019 输注之前和之后连续时间点收集的全血、骨髓抽出物和CSF分离基因组DNA。图5C示出了 在从CH0P-100和CH0P-101收集的CSF中CTL019细胞的流式细胞检测。图示出了在周 围血液的Wright (赖特）染色涂片和CSF的细胞涂片中激活的大颗粒淋巴细胞的图。
[0028] 图6是示出了在CH0P-101中，在基线和在复发时的⑶19表达的图。在CTL019输 注之前，以及在复发2个月以后，从CH0P-101获得骨髓样品。分离自骨髓的单核细胞被染 色⑶45、⑶34和⑶19,并且在Accuri C6流式细胞仪上进行分析。在活细胞上门控后，在 CD34+细胞上对母细胞门（blast gate) (CD45+SSC低）子门控（subgated)，并且对于CD19 表达产生频率曲线。分划线表示针对同种型对照上的相同门控的阈值。治疗前母细胞具有 一个范围的CD19分布，其中一小群非常暗的染色细胞被视为X轴上，在102,左侧频率曲线 的尾部。复发样品并不具有任何CD19阳性母细胞。处理前母细胞群体上CD19表达的分析揭 示，小群体的CD19暗或者是阴性细胞。这一小群体的细胞的平均荧光强度（MFI)为187 (左 侧小图），类似于抗-CD19-染色的复发的母细胞的MFI (201，右侧小图）。治疗前骨髓样品 是细胞减少的，具有10%母细胞，并且复发骨髓样品是正常细胞的，具有68%母细胞，导致 可供用于采样的事件中的差异。
[0029] 图7是示出在CTL019输注后，在第+23天，在CH0P-101中，骨髓中缓和的诱导的 图。在基线（顶部小图）和在第+23天（底部小图），对CH0P-101的临床免疫分型报道。细 胞染色⑶10、⑶19、⑶20、⑶34、⑶38和⑶58。在溶解红细胞后，进行流式细胞术。在第+23 天的报道表明白细胞由以下组成：42.0%淋巴细胞、6.0%单核细胞、50. 3%脊髓型、0. 17% 脊髓母细胞以及没有活的淋巴祖细胞。通过流式细胞术，不存在残余的前体B细胞淋巴性 白血病/淋巴瘤的令人信服的免疫表型证据。鉴定了基本上没有活的B细胞。
[0030] 图8是描绘在血液中CTL019细胞的体内扩张和持久性的图。针对CH0P-100和 CH0P-101，示出了血液中的白细胞（WBC)、CD3+T细胞、和CTL019细胞的个数。在一个半对 数图上示出了细胞个数。
[0031] 图9,包括图9A和9B，是证明了在CTL019输注1个月内，受试者在骨髓和血液中， 具有CD19阳性细胞的消除的一系列图。图9A示出了 CH0P-100中，持久性的B细胞发育不 全。顶部小图示出了在第+6天，在从表达⑶19和⑶20的CH0P-100抽出的骨髓中，白血病 母细胞的优势群体。在第+23和6个月，这一群体缺失。图9B示出在CH0P-101中，B细胞 发育不全和⑶19逃逸变体细胞的出现。用抽出自抗-⑶45、⑶34和⑶19染色的CH0P-101 的骨髓的流式细胞术分析。在底端行中，侧向散射的和CD45暗的阳性细胞用来鉴定在底线 表达可变量的⑶34和⑶19的白血病细胞。在第64天检测到仅有⑶19阴性母细胞。在顶 部小图中的数值表示每个象限中表示的总白细胞的分数。在下部小图中的数值表示来自在 CD45暗/SS低门中表示的总白细胞的百分数。
[0032] 图10是描绘了在接受CAR T细胞后，在患者中呈现的铁蛋白的水平的图。
[0033] 图11是描绘了在接受CAR T细胞后，在患者中呈现的肌红蛋白的水平的图。
[0034] 图12是描绘了在接受CAR T细胞后，在患者中呈现的纤溶酶原激活物抑制 剂-I(PAI-I)的水平的图。
[0035] 详细说明
[0036] 本发明涉及用于治疗癌症，包括但不局限于血液系统恶性肿瘤和实体瘤的组合物 和方法。本发明还涵盖了治疗和预防某些类型的癌症，包括原发性癌症和转移性癌症，连同 难治的或抗常规化疗的癌症的方法。这些方法包括给予对此类治疗和预防有需要的患者一 个治疗上或预防上有效量的T细胞，该T细胞被转导以表达嵌合抗原受体（CAR)。CAR是将 用于希望的抗原（例如肿瘤抗原）的基于抗体的特异性与T细胞受体激活细胞内结构域组 合，以产生显示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0037] 作为整体治疗方案的一部分，本发明涵盖通过评价在T细胞输注后的患者中的可 溶性因子谱（profile)，而管理某些癌症（例如预防或拖延它们的复发，或延长缓和的时 间）的方法。优选地，可溶性因子谱包括细胞因子谱的评价。当细胞因子谱表明与T细胞 输注前相比，T细胞输注后具体细胞因子的增加，则熟练的技术人员可以选择给予对此类管 理有需要的患者有效量的细胞因子抑制化合物或它的一种药学上可接受的盐、溶剂化物、 水合物、立体异构体、包合物、或前药，以管理T细胞输注后提高的水平的细胞因子。
[0038] 本发明部分基于以下发现：从基线的调制或在基线的现存水平的因子的独特组合 的鉴定可以帮助追踪CAR T细胞输注后的T细胞激活、靶活性、以及潜在有害副作用，以帮 助管理癌症的治疗。示例性因子包括但不局限于IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I 0、 MCP-I、TNF a、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、EGF、HGF、 FGF-0、CD40、CD40L、铁蛋白、等。
[0039] 本发明涉及转导的表达嵌合抗原受体（CAR)的T细胞的过继细胞转移与毒性管理 组合的策略，，其中产生来自T细胞输注后患者的可溶性因子谱，并且进行针对提高的可溶 性因子的治疗，以便治疗癌症。例如，产生实时可溶性因子谱允许用适当抑制剂干预提高的 可溶性因子，以便将水平下降至正常水平。
[0040] 在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有靶向希望的抗原的抗原识别域的胞外 域、跨膜结构域、和胞浆域。本发明并不局限于一个特定的CAR。而是，靶向希望的抗原的任 何CAR都可以用于本发明。在PCT/US11/64191中已经描述了制备CAR的组合物和方法，将 其通过引用以其全文并入于此。
[0041] 在任何以上方法的一些实施方式中，这些方法导致肿瘤尺寸或疾病或疾病进展的 证据的可测量的减少、完全反应、部分反应、稳定的疾病、无进展存活的增加或延长、总体存 活期的增加或延长、或毒性的减小。
[0042] 定义
[0043] 除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与在此描述的那些方法和材料类似或等效的任 何方法和材料均可以用于实施或测试本发明，但在此描述了优选的材料和方法。在描述和 要求本发明时，将使用以下术语。
[0044] 还应理解在此使用术语的目的仅在于描述【具体实施方式】，并不意味着限制。
[0045] 在此处使用的冠词"一个"和"一种"（"a"和"an"）是指一个或超过一个（即， 至少一个）该冠词的语法宾语。通过举例，"一个元素"是指一个元素或超过一个元素。
[0046] 如在此使用，当指一个可测量的值，例如一个量、一个时距等时，"约"是指涵盖从 指定值的±20%或±10%的变化，在一些实例中是±5%，在一些实例中是±1%，并且在 一些实例中是±0. 1%，只要此类变化适合进行披露的方法。
[0047] 如在此使用，"激活"是指已经充分刺激T细胞的状态，能诱导可检测的细胞增殖。 激活可以与诱导的细胞因子产生、和可检测的效应子功能关联。除其他事项之外，术语"激 活的T细胞"是指经历细胞分裂的T细胞。
[0048] 在此使用可溶性因子的"激活剂"或"激动剂"来指能够激活或增加可溶性因子的 水平的药剂的分子。激活剂是增加、促进、诱导激活，激活或上调可溶性因子的活性或表达 的化合物，例如激动剂。用于检测激活剂的测定包括例如在体外、在细胞中、或细胞膜中表 达可溶性因子，施用推定的激动剂化合物，并且然后确定对可溶性因子活性的功能效应，如 在本文的其他地方所描述。
[0049] 如在此使用，术语"抗体"是指特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是 源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性 部分。通常抗体是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以按多种形式存在，包括 例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2连同单链抗体和人源化抗体（Harlow(哈 洛）等人，1999,在以下中：Using Antibodies:A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手 册），Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社），纽约州；Harlow(哈 洛）等人，1989,在以下中：Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册），冷 泉港，纽约；Houston(休斯敦）等人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国科学院院 刊）85:5879-5883 ;Bird (伯德）等人，1988, Science (科学）242:423-426)。
[0050] 术语"抗体片段"是指完整抗体的一部分并且指完整抗体的抗原决定可变区。抗 体片段的示例包括但不局限于Fab、Fab'、F(ab'）2、和Fv片段、线性抗体；scFv抗体；以及 从抗体片段形成的多特异性抗体。
[0051] 如在此使用，术语"抗原"被定义为引起免疫反应的分子。这一免疫反应可以涉及 抗体产生、抑或特定免疫活性细胞的激活，或二者。熟练的技术人员将理解，任何大分子，几 乎包括所有蛋白或肽，可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组的或基因组的DNA。熟练的 技术人员将理解，如在此使用了那一术语，包括编码引起免疫反应的蛋白的核苷酸序列或 一部分核苷酸序列的任何任何DNA，因此编码了"抗原"。此外，本领域普通技术人员将理解， 并不唯一地由基因的全长核苷酸序列编码了抗原。容易明白的是，本发明包括但不局限于 多于一个基因的部分核苷酸序列的使用，以及按不同组合安排这些核苷酸序列，以引起希 望的免疫反应。此外，熟练的技术人员将理解，根本不需要由"基因"来编码抗原。容易明 白的是，可以合成而产生抗原，并且抗原可以源自生物样品。此类生物样品可以包括但不局 限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。
[0052] 根据本发明，术语"自身抗原"是指由免疫系统识别的任何自体抗原，就像它是外 源的一样。自身抗原包括但不局限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖 蛋白，包括细胞表面受体。
[0053] 如在此使用，术语"自身免疫性疾病"被定义为由自身免疫反应引起的失调。自 身免疫性疾病是由于对自体抗原的不适当的并且过度的反应。除了别的之外，自身免疫性 疾病的示例包括但不局限于：阿狄森氏病、严重脱发、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身 免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病（I型）、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾 炎、格雷夫斯氏病、格-巴综合征、桥本氏病、溶血性贫血、系统性红斑性狼疮、多重峰硬化、 重症肌无力、寻常型天疱疮、银肩病、风湿热、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合 症、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎。
[0054] 如在此使用，术语"自体同源的"是指源自与它稍后要重新引入的个体相同的个体 的任何材料。
[0055] "异源的"是指源自同一物种的不同动物的移植物。
[0056] "异种异体移植"是指源自不同物种的动物的移植物。
[0057] 如在此使用，术语"癌症"被定义为特征在于异常细胞的迅速并且失控的生长的疾 病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统而扩展至身体的其他部分。不同癌症的示例 包括但不局限于乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、 脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
[0058] 如在此使用，"联合治疗"是指结合其他药剂给予第一药剂。"结合"是指除了另一 治疗方式，给予一种治疗方式。像这样，"结合"是指在递送其他治疗方式至个体之前、之中、 或之后给予一种治疗方式。此类联合可以被认为是单个治疗方案或制度的一部分。
[0059] 如在此使用，术语"并行给予"是指在联合治疗中，第一治疗的给予和第二治疗的 给予彼此重叠。
[0060] 作为术语在此使用，"共刺激配体"包括特异性结合T细胞上的同类共刺激分子 的抗原递呈细胞（APC、树突细胞、B细胞、等）上的分子，由此提供除了通过以下而提供的 原始信号的信号，例如TCR/CD3复合物与加载有肽的MHC分子的结合，介导了 T细胞反应， 包括但局限于增殖、激活、分化、等。共刺激配体可以包括但不局限于⑶7、B7-l(⑶80)、 B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、0X40L、可诱导共刺激配体（ICOS-L)、细胞间黏附分子 (ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴细胞毒素 0 受体、3/TR6、 ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体、以及特异性结合B7-H3的配体。在 其他事物之外，共刺激配体还涵盖特异性结合T细胞上存在的共刺激分子--例如，但不局 限于 CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-I、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-I (LFA-I)、 ⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3--的抗体，以及特异性结合⑶83的配体。
[0061] "共刺激分子"是指特异性结合共刺激配体的T细胞上的同源结合配偶体，由此介 导通过T细胞的共刺激反应，例如但不局限于增殖。共刺激分子包括但不局限于MHC I类 分子、BTLA和Toll配体受体。
[0062] 如在此使用，"共刺激信号"是指与原始信号组合的信号，例如TCR/CD3配接，导致 T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
[0063] "疾病"是指其中动物不能维持内环境稳定的动物的健康状态，并且如果疾病不能 改善，则动物的健康就继续恶化。相比之下，"失调"是其中动物不能维持内环境稳定的健康 状态，但是其中与它将没有该失调相比，动物的健康状态是更不可取的。保持不治疗的话， 失调并不一定引起动物的健康状态中的另外的疾病。
[0064] 如在此使用，"有效量"是指提供治疗的或预防的益处的量。
[0065] 如在此使用，"内源的"是指来自，或产生在有机体、细胞、组织或系统内的任何材 料。
[0066] 如在此使用，术语"外源的"是指产生在有机体、细胞、组织或系统外的被引入有机 体、细胞、组织或系统中的任何材料。
[0067] 如在此使用，术语"表达"被定义为由启动子驱动的具体核苷酸序列的转录和/或 翻译。
[0068] "表达载体"是指包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括可操作地连接至 待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括用于表达的充足的顺式作用元件；用 于表达的其他元件可以由宿主细胞供应或存在于体外体外表达系统中。表达载体包括本领 域已知的那些的，例如合并了重组多核苷酸的粘粒、质粒（例如裸露的或包含在脂质体内） 和病毒（例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、和腺病毒伴随病毒）。
[0069] "同源的"是指两个多肽之间的或两个核酸分子之间的序列相似性或序列一致性。 当全部两个比较的序列中的一个位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如两个DNA 分子的每一个中的一个位置都被腺嘌呤占据，则这些分子在那一位置是同源的。两个序列 之间的同源性的百分比是由两个序列共享的匹配位置数或同源位置数除以比较的位置数X 100的一个函数。例如，如果两个序列中的位置中10个有6个是匹配的或同源的，则两个序 列是60%同源的。通过举例，DNA序列ATTGCC和TATGGC共享50%同源性。一般而言，当 两个序列对齐时做出比较，以给出最大同源性。
[0070] 如在此使用，术语"免疫球蛋白"或"Ig"被定义为发挥抗体的作用的一类蛋白。B 细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体）或抗原受体。包括在这一类蛋白中的五个成 员是IgA、IgG、IgM、IgD、和IgE。IgA是身体分泌物（例如唾液、眼泪、母乳、胃肠分泌物和 呼吸道和生殖泌尿道的黏液分泌物）中存在的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM 是在多数受试者体内，在初次免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合、和 其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且在针对细菌和病毒的防御中是重要的。IgD是不 具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但是可以用作抗原受体。IgE是当暴露于变应原时，通过 引起介质从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
[0071] 如在此使用，术语"免疫反应"包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫反应。 示例性免疫反应包括T细胞反应，例如细胞因子产生和细胞的细胞毒性。此外，术语免疫反 应包括通过T细胞激活而间接发挥作用的免疫反应，例如抗体产生（体液反应）和细胞因 子应答细胞（例如巨噬细胞）的激活。在免疫反应中涉及的免疫细胞包括淋巴细胞，例如 B细胞和T细胞（CD4+、⑶8+、Thl和Th2细胞）；抗原呈递细胞（例如专职性抗原提呈细胞 (例如树突细巨噬细胞、B淋巴细胞、朗格汉斯细胞），和非专职性抗原提呈细胞，例如角化 细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞）；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例 如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、和粒细胞。
[0072] 在此使用可溶性因子的"抑制剂"或"拮抗剂"来指能够抑制、灭活或减少可溶性因 子的水平的药剂的分子。抑制剂是例如结合、部分或完全阻断活性、降低、防止、延迟激活、 灭活、脱敏、或下调可溶性因子的活性或表达的化合物，例如拮抗剂。抑制剂包括多肽抑制 剂（例如抗体、可溶性受体等），连同核酸抑制剂（例如siRNA或反义RNA)，可溶性因子的遗 传修饰的版本，例如具有改变的活性的版本，连同天然发生的和合成的可溶性因子拮抗剂， 小化学分子等。用于检测抑制剂的测定包括例如在体外、在细胞中、或细胞膜中表达可溶性 因子，施用推定的拮抗剂化合物，并且然后确定对可溶性因子活性的功能效应，如在本文的 其他地方所描述。
[0073] 如在此使用，"指导材料"包括可以用于与本发明的组合物和方法的有用性进行交 流的出版物、记录、图表、或任何其他表达介质。例如，本发明的试剂盒的指导材料可以被附 加至包含本发明的核酸、肽、和/或组合物的容器上，或者与包含核酸、肽、和/或组合物的 容器一起发货。可选地，指导材料可以有意与容器分开发货，这样由接收者协作性地使用指 导材料和化合物。
[0074] "隔离的"是指从天然状态加以改变或远离天然状态。例如，天然存在于活的动物 中的核酸或肽并不是"隔离的"，但是从其天然状态的共存材料部分地或完全地分离的相同 和酸或肽是"隔离的"。隔离的核酸或蛋白可以按基本上纯化的形式存在，或可以存在于非 天然环境中，例如像存在于宿主细胞中。
[0075] 如在此使用，"慢病毒"是指逆转录病毒科的一个属。在逆转录病毒中，慢病毒是独 特的，在于能够感染非分裂细胞；它们可以递送显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA中， 所以它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的示例。源自慢 病毒的载体提供了用来达到体内显著水平的基因转移的工具。
[0076] 如在此使用，生物样品中，短语"可溶性因子的水平"典型地是指在生物样品中存 在的可溶性因子的蛋白的、蛋白片段的或肽的水平的量。"可溶性因子的水平"不需要量化， 而是可以简单地检测，例如由一个人主观视觉检测，与或不与来自对照样品的的水平，或对 照样品的预期水平进行比较。
[0077] 如在此使用，术语"调制"是指与未经治疗或未使用化合物的受试者中的反应水平 相比，和/或与在其他方面相同但是未治疗的受试者中的反应水平相比，介导受试者中反 应水平中的可检测增加或降低。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或反应，由此介导受 试者（优选是人）中的有益治疗反应。
[0078] 免疫原性组合物的"非消化道"给药包括例如皮下（s.c.)、静脉内（i.v.)、肌内 (i. m.)、或胸骨内注射或输注技术。
[0079] 在此可互换地使用术语"患者"、"受试者"、"个体"，并且是指无论体外还是原位， 都服从在此描述的方法的任何动物、或它们的细胞。在某些非限制性实施方式中，患者、受 试者或个体是人。
[0080] 如在此使用，术语"同时给药"是指以不超过约15分钟的时间间隔，例如不超过约 10、5、或1分钟里的任何时间，给予联合治疗中的第一治疗和第二治疗。当同时给予第一和 第二治疗时，第一和第二治疗可以包含在同一组合物中（例如包含第一和第二治疗这二者 的组合物）或在分开的组合物中（例如第一治疗在一个组合物中，并且第二治疗包含在另 一组合物中）。
[0081] 如在此使用，术语"同时给药"是指以不超过约15分钟的时间间隔，例如不超过约 10、5、或1分钟里的任何时间，给予联合治疗中的第一治疗和第二治疗。当同时给予第一和 第二治疗时，第一和第二治疗可以包含在同一组合物中（例如包含第一和第二治疗这二者 的组合物）或在分开的组合物中（例如第一治疗在一个组合物中，并且第二治疗包含在另 一组合物中）。
[0082] 如在此使用，关于一种抗体，术语"特异性结合"是指识别特异性抗原、但是基本上 不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体还 可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是此类种间交叉反应性自身并不改变作为特异性 的抗体的分类。在另一个示例中，特异性结合抗原的抗体还可以结合抗原的不同等位基因 形式。然而，此类交叉反应性自身并不改变作为特异性的抗体的分类。在一些实例中，术语 "特异性结合"（specific binding或specifically binding)可以关于抗体、蛋白或肽与 第二化学物种的相互作用进行使用，是指该相互作用取决于化学物种上的具体结构（例如 抗原决定簇或表位）的存在；例如，抗体识别并且结合特定蛋白结构，而不是一般地结合蛋 白。如果抗体特异性针对表位"A"，则在包含标记的"A"和抗体的反应中，包含表位A (或游 离的、未标记的A)的分子的存在将减少结合至抗体的标记的A的量。
[0083] 术语"刺激"是指由刺激分子（例如TCR/CD3复合物）与它的同源配体结合而诱导 的初次反应，由此介导信号转导事件，例如但不局限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺 激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-0的下调，和/或细胞骨架结构的识别，等。
[0084] 作为术语在此使用，"刺激分子"是指与抗原递呈细胞上存在的同源刺激配体特异 性结合的T细胞上的分子。
[0085] 如在此使用，"刺激配体"是指当存在于抗原递呈细胞（例如APC、树突细胞、B细 胞、等）上时，配体可以与T细胞上的同源结合配偶体（在此称为"刺激分子"）特异性结合， 由此介导通过T细胞的初次反应，包括但不局限于激活、免疫反应的引发、增殖、等。刺激配 体是本领域熟知的，并且在其他事物之外，涵盖加载有肽、抗-CD3抗体、超激动剂抗CD-28 抗体、和超激动剂抗-CD2抗体的MHC I类分子。
[0086] 术语"受试者"旨在包括其中可以引起免疫反应的活的有机体（例如哺乳动物）。 受试者的示例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、和它们的转基因物种。
[0087] 如在此使用，"基本上纯化的"细胞是本质上不含有其他细胞类型的细胞。基本上 纯化的细胞是指已经从在其天然发生的状态下与其正常关联的其他细胞类型分离的细胞。 在一些实例中，一群基本上纯化的细胞是指一个同源的群的细胞。在其他实例中，这一术语 简单地是指已经从在它们的天然状态下与其正常关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式 中，在体外培养这些细胞。在其他实施方式中，不在体外培养这些细胞。
[0088] 如在此使用，术语"治疗的"是指治疗和/或预防。通过抑制、缓和、或根除疾病状 态，获得治疗效果。
[0089] 术语"治疗有效量"是指将引起研宄者、兽医、医师或其他临床医生正寻找的组织、 系统、或受试者的生物学或医学反应的受试者化合物的量。术语"治疗有效量"包括当给予 时，足够预防所治疗的失调或疾病的一种或多种病征或症状的发展或在一定程度上缓解该 病征或疾病的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物，疾病和它的严重程度以及待治疗 的受试者的年龄、体重、等而变化。
[0090] 如在此使用，术语"移植物"是指引入个体的细胞、组织、或器官。移植材料的来源 可以是培养的细胞、来自另一个体的细胞、或来自同一个体的细胞（例如在体外培养这些 细胞后）。示例性器官移植物是肾脏、肝脏、心脏、肺、和胰脏。
[0091] 作为术语在此使用，"治疗"疾病是指减少受试者经历的疾病或失调的至少一个病 征或症状的频率或严重程度。
[0092] 如在此使用，术语"转染的"或"转化的"或"转导的"是指一个过程，通过该过程， 外源核酸被移入或引入宿主细胞。"转染的"或"转化的"或"转导的"细胞是已经转染了、 转化了或转导了外源核酸的细胞。该细胞包括原代受试者细胞和它的后代。
[0093] 范围：贯穿本披露，可以按一个范围格式呈现本发明的不同方面。应当理解的是， 处于范围格式的说明仅为了方便和简洁，不应被解释为对本发明的范围的不变的限制。因 此，范围的说明应被认为是已经确切地披露了所有可能的子范围连同该范围内的单独数 值。例如，一个范围的说明，例如从1至6,应被认为是已经确切披露了多个子范围，例如从 1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，连同该范围内的单独数字，例如 1、2、2. 7、3、4、5、5. 3、和6。这一应用无论该范围的宽度如何。
[0094]
[0095] 本发明提供了用于治疗患者中的癌症的组合物和方法。在一个实施方式中，该治 疗方法包括一线的治疗，该一线的治疗包括给予本发明的CAR至患者中，用来诱导抗肿瘤 免疫反应并且监测T细胞输注后患者中的可溶性因子的水平，以便根据第一线的治疗的结 果，确定适合治疗该患者的第二线的治疗的类型。
[0096] 在一个实施方式中，该第二线的治疗包括在接受适当的CAR T的输注后（在本文 的其他地方称为"T细胞输注后"），评价患者中的可溶性因子谱，其中当该可溶性因子谱表 明与T细胞输注前相比，T细胞输注后具体的可溶性因子中的增加时，熟练的技术人员可以 选择给予有需要的患者有效量的可溶性因子抑制化合物，以管理T细胞输注后，提高的水 平的可溶性因子。因此，在一个实施方式中，第二线的治疗包括给予一个类型的可溶性因子 抑制治疗，以管理提高的水平的生成自使用CAR T细胞的第一线的治疗的某一可溶性因子。
[0097] 仍在另一个实施方式中，涉及给予可溶性因子抑制化合物至患者的第二线的治疗 可以与用于治疗、预防或管理与不希望的血管生成关联的或特征在于不希望的血管生成的 疾病或失调的其他常规治疗组合。此类常规治疗的示例包括但不局限于外科手术、化疗、放 射治疗、激素治疗、生物治疗和免疫治疗。
[0098] 在一个实施方式中，可以将本发明的CAR工程化，以包括具有靶向融合至T细胞抗 原受体复合物G链（例如CD3 〇的细胞内信号传导域的肿瘤抗原的抗原结合域的胞外 域。示例性肿瘤抗原B细胞抗原是CD19,因为在恶性B细胞上表达这一抗原。然而，本发 明并不局限于靶向CD19。而是，本发明包括任何肿瘤抗原结合部分。抗原结合部分优选与 来自一个或多个共刺激分子和一个G链的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合部分与 选自下组的一个或多个细胞内结构域融合，该组由以下各项组成：CD137(4-1BB)信号传导 域、⑶28信号传导域、⑶3 G信号域、和它们的任何组合。
[0099] 在一个实施方式中，本发明的CAR包括⑶137 (4-1BB)信号传导域。这是因为本发 明部分基于以下发现：可以用添加共刺激域进一步增强CAR-介导的T-细胞反应。例如，与 未工程化以表达⑶137 (4-1BB)的其他方面相同的CAR T细胞相比，包含⑶137 (4-1BB)信号 传导域显著增加了 CAR介导的活性和CAR T细胞的体外持久性。然而，本发明并不局限于 一个特定的CAR。而是，靶向肿瘤抗原的任何CAR都可以用于本发明。在PCT/US11/64191 中已经描述了制作和使用CAR的组合物和方法，将其通过引用以其全文并入于此。
[0100] 方法
[0101] 本发明的治疗方案导致肿瘤尺寸或疾病或疾病进展的证据的可测量的减少、完全 反应、部分反应、稳定的疾病、无进展存活的增加或延长、总体存活期的增加或延长、或毒性 的减小。
[0102] 作为完整治疗方案的一部分，本发明涵盖第一线治疗和第二线治疗，其中第一线 治疗包括给予本发明的CAR T细胞至对其有需要的患者。本发明的治疗方案允许通过评 价T细胞输注后，患者中的可溶性因子谱，而管理癌症和它的治疗。适当的第二线治疗包括 给予适当的可溶性因子抑制剂至患者，以减少提高的水平的生成自第一线治疗的可溶性因 子。在一些实例中，适当的第二线治疗包括给予适当的可溶性因子激活剂至患者，以增加抑 制的水平的生成自第一线治疗的可溶性因子。
[0103] 在一个实施方式中，适当的第二线治疗包括给予适当的细胞因子抑制剂至患者， 以减少提高的水平的生成自第一线治疗的细胞因子。在一些实例中，适当的第二线治疗 包括给予适当的细胞因子激活剂至患者，以增加抑制的水平的生成自第一线治疗的细胞因 子。
[0104] 在一个实施方式中，差示水平是与正常的或对照的细胞、给定的患者群体的表达 水平，或与内参相比，过表达（高表达）或表达不足（低表达）。在一些实例中，水平是在患 者和正常个体之间、T细胞输注后的患者和T细胞输注前的患者之间、或在第一时间点的T 细胞输注后的患者和第二时间点的T细胞输注后的患者之间进行比较。
[0105] 在一个实施方式中，本发明包括评价一个或多个细胞因子的差示水平，以产生T 细胞输注后的患者中的细胞因子谱，以便出于将细胞因子水平调回正常水平的目的，确定 待施用至患者的细胞因子治疗的类型。因此，可以施用本发明，以鉴定由于在患者中本发明 的CAR T细胞的存在而提高的细胞因子水平，这允许用细胞因子抑制剂的患者的专门化治 疗，以降低提高的水平的细胞因子。在另一个实施方式中，可以施用本发明，以鉴定由于在 患者中本发明的CAR T细胞的存在而降低的细胞因子水平，这允许用细胞因子激动剂的患 者的专门化治疗，以增加减弱的水平的细胞因子。
[0106] 在一个实施方式中，由于接受CAR T细胞输注而提高的细胞因子水平包括但不局 限于 IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、 IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I0、MCP-I、TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCLlO、 〇父〇?因子、￥￡6?、狀阶^53(7^乂預、￡6?、邢？、？6?-0、〇〇4〇、〇)4〇1、铁蛋白、等。然而，本发 明不应局限于这些列出的细胞因子。而是，本发明包括被鉴定为由于接受CAR T细胞输注， 在患者中提高的任何细胞因子。
[0107] 在一个实施方式中，由于接受CAR T细胞输注而降低的细胞因子水平包括但不局 限于 IL-I 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、 IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-I a、MIP-I0、MCP-I、TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCLlO、 〇父〇?因子、￥￡6?、狀阶^53(7^乂預、￡6?、邢？、？6?-0、〇〇4〇、〇)4〇1、铁蛋白、等。然而，本发 明不应局限于这些列出的细胞因子。而是，本发明包括被鉴定为由于接受CAR T细胞输注， 在患者中降低的任何细胞因子。
[0108] 检测细朐闵子和灾的治疗
[0109] 虽然这一部分描述了作为第二线治疗的一部分的细胞因子检测和它的治疗，但是 本发明涵盖了作为第二线治疗的一部分的任何可溶性因子的检测和它的治疗。因此，在上 下文中，"细胞因子"的描述可以同样适合"可溶性因子"。
[0110] 在一个实施方式中，作为第二线治疗的一部分，本发明包括检测已接受本发明的 CAR T细胞的输注的患者中的细胞因子水平。在一些实施方式中，细胞因子的存在或水平可 以用来选择候选治疗。在一些其他实施方式中，细胞因子的存在或水平可以用来确定在第 一线治疗、第二线治疗或第一线治疗和第二线治疗者二者的过程期间或之后的成功。
[0111] 其中可以检测到细胞因子的生物样品包括例如血清。在一些实施方式中，生物样 品包括可以具有或可以不具有液体组分的组织活检。
[0112] 免疫测定可以用来定性地或定量地分析生物样品中的细胞因子水平。可以在 多个容易地可获得的手册中发现可应用技术的总体概述，这些手册例如是Harlow(哈 洛）&Lane(莱恩），Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社），Using Antibodies:A Laboratory Manual (使用抗体：实验室手册）（1999)。
[0113] 除了使用免疫测定来检测来自患者的生物样品中的细胞因子水平之外，可以基于 具体细胞因子的基因表达水平作出细胞因子表达和水平的评定。用于确定mRNA表达的存 在和/或水平的RNA杂交技术是本领域普通技术人员熟知的，并且可以用来评定感兴趣的 细胞因子的基因表达的存在或水平。
[0114] 在一些实施方式中，本发明的方法利用细胞因子的选择性结合配偶体来鉴定生物 样品中细胞因子的存在或确定细胞因子的水平。可以与本发明的方法和试剂盒一起使用的 选择性结合配偶体可以例如是抗体。在一些方面，可以使用针对具体细胞因子的单克隆抗 体。在一些其他方面，针对具体细胞因子的多克隆抗体可以用来实践这些方法并且在本发 明的试剂盒中。
[0115] 针对细胞因子的商业抗体是可获得的，并且可以与本发明的方法和试剂盒一起使 用。本领域普通技术人员熟知的是，鉴于其中使用抗体的测定，待使用的抗体的类型、来源 和其他方面是要加以考虑的。在一些实例中，在蛋白印迹法上将识别其抗原靶的抗体可能 适用于ELISA、ELISpot测定，并且反之亦然。
[0116] 在一些实施方式中，可以使用用于生产本领域熟知的单克隆抗体或多克隆抗 体的技术来生产要用于本发明的测定的抗体（参见例如Coligan (科利根），Current Protocols in Immunology (免疫学实验室指南）（1991) ;Harlow(哈洛）&Lane(莱恩）， 同上；Goding(戈丁），Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(单克隆抗体： 原理和实践）（第二版，1986);以及Kohler (科勒）&Milstein(米尔斯坦），Nature(自 然）256:495-497 (1975)。此类技术包括通过在噬菌体或类似载体中，从重组抗体文库选择 抗体的抗体制备，连同通过使兔或小鼠免疫的多克隆抗体和单克隆抗体的制备（参见例如 Huse (休斯）等人，Science (科学）2祕：1275_1281 (I989) ;Ward (沃德）等人，Nature (自 然）341:544-546 (1989))。此类抗体可以用于治疗应用和诊断应用，例如在治疗和/或检测 与在此描述的疾病或病症关联的任何特定细胞因子。
[0117] 采用免疫测定的任何检测方法都特别适合在患者护理点的实践。此类方法允许患 者的即时诊断和/或预测评价。护理点诊断系统描述于例如美国专利号6, 267, 722中，将 其通过引用结合于此。其他免疫测定方式也是可供使用的，这样使得可以进行生物样品的 评价而不必需发送样品至用于评价的实验室。典型地，这些测定被格式化为固体测定，其中 使用一种试剂，例如抗体来检测细胞因子。描述了适合与免疫测定（例如本发明的测定） 一起使用的示例性测试装置，例如在美国专利号7, 189, 522 ;6, 818, 455和6, 656, 745中。
[0118] 在一些方面，本发明提供了用于检测编码生物样品中的细胞因子的多核苷酸序列 的方法。如以上指出，"生物样品"是指来自患者的一个细胞或一群细胞或一定量的组织或 流体。最通常的，已经从患者取出样品，但是术语"生物样品"还是可以指在体内分析的细 胞或组织，即未从该患者取出。典型地，"生物样品"将包含来自患者的细胞，但是该术语还 可以指非细胞的生物材料。
[0119] 在一个实施方式中，基于扩增的测定被用来测量希望的细胞因子的水平。在这样 一个测定中，希望的细胞因子的核酸序列充当扩增反应（例如聚合酶链式反应，或PCR)中 的模板。在定量扩增中，扩增产物的量将与原始样品中的模板的量成比例。与适当的对照的 比较提供了细胞因子关联基因的拷贝数的量度。定量扩增的多种方法是本领域普通技术人 员熟知的。提供了用于定量PCR的详细实验方案，例如在Innis (英尼斯）等人（1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR 实验方案，方法和应用的向导）， Academic Press, Inc.(学术出版社）纽约州）。RT-PCR是普通技术人员熟知的（参见例 如Ausubel (奥苏贝尔）等人，同上）。在一些实施方式中，使用定量RT-PCR，例如TaqMan? 测定，由此允许样品中的mRNA水平与对照样品或值进行比较。用于希望的细胞因子的已 知核酸序列足以使一个技术人员能够例行地选择引物，来扩增基因的任何部分。可以使用 本领域熟知的原理来设计用于扩增特定序列的适合引物（参见例如Dieffenfach(迪芬巴 赫）&Dveksler (德维克斯勒），PCR Primer:A Laboratory Manual (PCR 引物：实验室手册） (1995))〇
[0120] 在一些实施方式中，基于杂交的测定可以用于检测生物样品的细胞中希望的细胞 因子的量。此类测定包括RNA的斑点印迹分析连同其他测定，例如在包含细胞的样品上进 行的荧光原位杂交。其他杂交测定是本领域容易地可获得的。
[0121] 在本发明的多个实施方式中，将在生物样品中检测细胞因子多核苷酸或多肽的水 平和/或存在，由此检测细胞因子的差示表达，用来与对照生物样品相比，从源自输注了本 发明的CAR T细胞的患者的生物样品产生细胞因子谱。
[0122] 在生物样品中检测到的细胞因子多核苷酸或多肽的量表明了细胞因子的存在，用 来出于将患者分类，以便适当的细胞因子治疗的目的，产生细胞因子谱。例如，当细胞因子 谱表明与对照（例如T细胞输注前）相比，T细胞输注后具体细胞因子增加时，则熟练的技 术人员可以选择给予对此类管理有需要的患者有效量的细胞因子抑制化合物。可选地，当 细胞因子谱表明与对照（例如T细胞输注前）相比，T细胞输注后具体细胞因子降低时，则 熟练的技术人员可以选择给予对此类管理有需要的患者有效量的细胞因子激动剂化合物。
[0123] 在一些实施方式中，T细胞输注后样品和对照样品之间的细胞因子水平中的差异 在约 0? 5、1. 0、1. 5、2、5、10、100、200、500、1000 倍。
[0124] 本发明的方法还可以用于评定疗程的功效。例如，在包含提高的量的细胞因子 IL-6的T细胞输注后患者中，可以通过随时间监测IL-6,来评定抗-IL-6治疗的功效。例 如，与取自在治疗之前或在治疗早期的哺乳动物的样品中的水平相比，在取自治疗后的患 者的生物样品中IL-6多核苷酸或多肽水平中的减少表明了有效的治疗。
[0125] 在一个实施方式中，治疗方案可以基于中和提高的细胞因子。例如可以选择细胞 因子的拮抗剂用于治疗。抗体是适合的拮抗剂的示例并且包括小鼠抗体、嵌合抗体、人源化 抗体、和人抗体或它们的片段。嵌合抗体是已经典型地通过基因工程，从属于不同物种的免 疫球蛋白基因区段构建了它的轻链和重链基因的抗体，（参见例如Boyce(博伊斯）等人， Annals of Oncology(肿瘤学年报）14:520-535(2003))。例如，来自小鼠单克隆抗体的基 因的可变⑴区段可以连接至人恒定（C)区段。因此，典型的嵌合抗体是由来自小鼠抗体 的V或抗原结合域和来自人抗体的C或效应子区域组成的杂蛋白。
[0126] 人源化抗体具有基本上来自人抗体（称为受体抗体）的可变区框架残基和基本 上来自小鼠抗体（称为供体免疫球蛋白）的互补决定区。参见Queen(昆）等人Proc. NatL. Acad. Sci. USA (美国科学院院刊）86:10029-10033 (1989)和 TO90/07861、美国专利 号5, 693, 762、美国专利号5, 693, 761、美国专利号5, 585, 089、美国专利号5, 530, 101以及 Winter (温特），美国专利号5, 225, 539。如果存在，这一个或多个恒定区还基本上或完全 来自人免疫球蛋白。除了其他来源，可以使用具有人免疫系统的转基因小鼠（Lonberg(朗 伯格）等人，WO 93/12227 (1993))，通过常规杂交瘤方法、噬菌体展示（参见例如Dower (道 尔）等人，WO 91/17271和McCafferty (麦卡弗蒂）等人，WO 92/01047)获得抗体。编码免 疫球蛋白链的核酸可以获得自产生抗体的杂交瘤或细胞系，或基于公开的文献中的免疫球 蛋白核酸或氨基酸序列。
[0127] 希望的细胞因子的其他拮抗剂还可以用于治疗目标。例如，可以用于本发明的目 标的一类拮抗剂是细胞因子受体的可溶形式。仅出于说明性目的，IL-6拮抗剂是特异性结 合IL-6的抗-IL-6抗体。特异性抗体具有全身地抑制或对抗IL-6的作用的能力。在一些 实施方式中，抗体结合IL-6并且防止它与它的受体（例如IL-6Ra或IL-6R0 )相互作用 或激活这些受体。在一些实施方式中，可以通过使用针对白介素-6受体（IL-6R)的拮抗剂 来对抗IL-6的活性。美国申请号2006251653描述了用于治疗白介素-6相关疾病的方法 并且披露了多个白介素-6拮抗剂，包括例如人源化抗-IL-6R抗体和嵌合抗-IL-6R抗体。 在一些实施方式中，IL-6或IL-6R衍生物可以用于阻断并且对抗IL-6/IL-6R之间的相互 作用。
[0128] 本发明并不局限于在此描述的这些细胞因子和它们的对应的激动剂和抑制剂。而 是，本发明包括使用任何用于本领域的细胞因子激动剂和/或抑制剂，以调制细胞因子。这 是因为本发明基于在接受本发明的CAR T细胞输注的患者中管理癌症治疗，其中输注的CAR T细胞导致增加和降低水平的不同细胞因子。本领域普通技术人员基于在此呈现的披露内 容：与对照样品相比，T细胞输注后样品中细胞因子的差示表达水平可以被靶向用于治疗， 以便使细胞因子水平增加或降低至正常水平。
[0129] 治疗应用
[0130] 本发明涵盖转导了慢病毒载体（LV)的细胞（例如T细胞）。例如，LV编码组合特 异性抗体的抗原识别域与CD3- G、CD28、4-1BB或它们的任何组合的细胞内结构域的CAR。 因此，在一些实例中，转导的T细胞可以引起CAR介导的T-细胞反应。
[0131] 本发明提供了 CAR用来将初始T细胞的特异性重新定向至肿瘤抗原的用途。因此， 本发明还提供了用于刺激T细胞-介导的免疫反应，用来在哺乳动物中靶向细胞群体或组 织的方法，该方法包括将表达CAR的T细胞给予至哺乳动物的步骤，其中CAR包括与预先确 定的靶特异性相互作用的结合部分、包括例如人CD3G的细胞内结构域的G链部分、和共 刺激信号传递区。
[0132] 在一个实施方式中，本发明包括一个类型的细胞治疗，其中遗传修饰T细胞，以表 达CAR，并且将CAR T细胞输注到对其有需要的接受者中。输注的细胞能够杀死接受者中的 肿瘤细胞。不像抗体治疗，CAR T细胞能够在体内复制，导致长期的持久性，该持久性导致 持续的肿瘤控制。
[0133] 在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可以经历在体内强大的T细胞表达，并且 可以持续延长量的时间。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞演化为特异性记忆T 细胞，这些特异性记忆T细胞可以再激活，以抑制任何额外的肿瘤形成或生长。例如，出乎 意料的是，本发明的CART19细胞可以经历体内强大的T细胞扩张，并且在血液和骨髓中以 高水平持续延长量的时间，并且形成特异性记忆T细胞。不希望受任何具体理论约束，当遇 到并且随后消除表达替代抗原的靶细胞时，CAR T细胞可以在体内分化为中心记忆样状态。
[0134] 不希望受任何具体理论约束，由CAR-修饰的T细胞引起的抗肿瘤免疫反应可以 是主动的或被动的免疫反应。此外，CAR介导的免疫反应可以是过继性免疫治疗方法，其中 CAR-修饰的T细胞诱导特异性针对CAR中的抗原结合部分的免疫反应。例如，CART19细胞 引起特异性针对表达CD19的细胞的免疫反应。
[0135] 尽管在此披露的数据确切地披露了包含源自FMC63鼠单克隆抗体的 抗-^198(^￥、人^8€[铰链和跨膜结构域、以及人4-188和^3 6信号传导域的慢病毒载 体，但是本发明不应被解释为包括针对如在本文的其他地方描述的构建体的多个组分的每 一个的任何数量的变化。即，本发明包括使用CAR中任何抗原结合部分，以产生特异性针对 该抗原结合部分的CAR-介导的T-细胞反应。例如，出于治疗癌症的目的，本发明的CAR中 的抗原结合部分可以靶向肿瘤抗原。
[0136] 可以治疗的癌症包括未血管化的、或基本上仍未血管化的肿瘤，连同血管化的肿 瘤。癌症可以包括非实体瘤（例如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤）或可以包括实体瘤。 要用本发明的CAR治疗的癌症的类型包括但不局限于恶性肿瘤（carcinoma)、母细胞瘤、和 肉瘤，以及某些白血病或淋巴的恶性肿瘤（malignancies)，良性的和恶性的肿瘤，以及恶性 肿瘤（malignancies)，例如肉瘤、恶性肿瘤（carcinomas)和黑色素瘤。还包括成体肿瘤/ 癌症和幼体肿瘤/癌症。
[0137] 血液学癌症是血液或骨髓的癌症。血液学的（或血源性的）癌症包括白血病，白 血病包括急性白血病（例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血 病和成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、粒-单核细胞型白血病、单核细胞性白血病以及 红白血病），慢性白血病（例如慢性髓细胞性（粒细胞的）白血病、慢性骨髓性白血病、和慢 性淋巴细胞白血病），真性红细胞增多症，淋巴瘤，霍奇金氏病，非何杰金氏淋巴瘤（顽固并 且高级的形式），多发性骨髓瘤，沃尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症，重链病，骨髓增生异常综合 症，多毛细胞白血病以及骨髓增生异常。
[0138] 实体瘤是通常并不包含囊肿或液体区域的组织的异常包块。实体瘤可以是良性 的或恶性的。针对形成它们的细胞类型，命名了不同类型的实体瘤（例如肉瘤、恶性肿瘤 (carcinomas)、和淋巴瘤）。实体瘤（例如肉瘤和恶性肿瘤（carcinomas))的示例包括纤维 肉瘤，含有粘液瘤组织的肉瘤，脂肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤 因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳癌，肺癌，卵巢癌，前列 腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌， 嗜铬细胞瘤，皮脂腺癌，乳头状癌，睾丸网乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌， 胆管癌，绒毛膜癌，维尔姆斯氏肿瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤，以 及CNS肿瘤（例如神经胶质瘤（例如脑干胶质瘤和混合型胶质瘤），成神经胶质细胞瘤（也 称为多形性成胶质细胞瘤）星形胶质细胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖细胞瘤，成神经管细胞瘤， 神经鞘瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，髓膜 瘤，成神经细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移）。
[0139] 在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分的部分被设计为用来治疗具体 的癌症。例如，被设计为革G向CD19的CAR可以用来治疗癌症和失调，这些癌症和失调包括 但不局限于前体B ALL (幼体适应症）、成体ALL、套细胞淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、抢 救后异基因骨髓移植、等。
[0140] 在另一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向CD22,以治疗弥散性大B细胞淋巴 瘤。
[0141] 在一个实施方式中，癌症和失调包括但不局限于前体-B ALL(幼体适应症）、成 体ALL、套细胞淋巴瘤、弥散性大B-细胞淋巴瘤、抢救后异基因骨髓移、等，可以使用靶向 ⑶19、⑶20、⑶22的CAR和RORl的组合对它们进行治疗。
[0142] 在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向间皮素，以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢 癌、等。
[0143] 在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向⑶33/IL3Ra，以治疗急性骨髓性白血 病等。
[0144] 在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向c-Met，以治疗三阴性乳癌、非小细胞 肺癌、等。
[0145] 在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向PSMA，以治疗前列腺癌等。
[0146] 在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向糖脂F77,以治疗前列腺癌等。
[0147] 在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向EGFRvIII，以治疗成胶质细胞瘤等。
[0148] 在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向⑶-2,以治疗成神经细胞瘤、黑色素 瘤、等。
[0149] 在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向NY-ES0-1TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑 色素瘤、等。
[0150] 在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向MAGE A3TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑色 素瘤、等。
[0151] 然而，本发明不应被解释为仅局限于在此披露的抗原靶和疾病。而是，本发明应被 解释为包括与一种疾病关联的任何抗原性靶，其中CAR可以被用来治疗该疾病。
[0152] 本发明的CAR介导的T细胞还可以用作一个类型的疫苗，用于哺乳动物中的先体 外后体内免疫和/或体内治疗。优选地，该哺乳动物是人。
[0153] 关于离体免疫，在给予细胞进入哺乳动物之前，在体外发生以下项中的至少一个： i)这些细胞的扩张，ii)将编码CAR的核酸引入这些细胞，和/或iii)这些细胞的冷冻保 存。
[0154] 离体程序是本领域熟知的，并且将在以下更充分地讨论。简要地，从哺乳动物（优 选是人）分离细胞，并且用表达在此披露的CAR的载体进行遗传修饰（即体外转导或转 染）。可以将CAR-修饰的细胞给予至哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者 可以是人，并且CAR-修饰的细胞可以相对于该接受者是自体的。可选地，这些细胞相对于 该接受者是异源的、同系的或异种的。
[0155] 用于造血干细胞和祖细胞的离体扩张的程序描述于美国专利号5, 199, 942中，通 过引用将其结合于此，可以适用于本发明的细胞。其他适合的方法是本领域已知的，并且因 此本发明并不局限于细胞的离体扩张的任何具体方法。简要地，T细胞的离体培养和扩张 包括：（1)从哺乳动物，从周围血液收集物或骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞； 以及（2)离体扩张此类细胞。除了美国专利号5, 199, 942中描述的细胞生长因子，其他因 子，例如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体可以被用于培养和扩张这些细胞。
[0156] 除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗，本发明还提供了用于体内免疫的组合 物和方法，以引起针对患者中的抗原的免疫反应。
[0157] 一般而言，如在此所述激活并且扩张的细胞可以用于治疗和预防免疫受损的个体 中出现的疾病。具体地，本发明的CAR-修饰的T细胞被用于治疗CCL。在某些实施方式中， 本发明的细胞被用于治疗具有发展CCL的风险的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预 防CCL的方法，该方法包括对其有需要的受试者一个治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T 细胞。
[0158] 可以单独给予本发明的CAR-修饰的T细胞，或与稀释剂和/或与其他组分，例如 IL-2或其他细胞因子或细胞群体组合，作为药物组合物给予本发明的CAR-修饰的T细胞。 简要地，本发明的药物组合物可以包括如在此所述的靶细胞群体，与一种或多种药学上或 生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包括缓冲液，例如中性缓 冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋 白；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；辅助剂（例如氢 氧化铝）；以及防腐剂。优选配制本发明的组合物用于静脉给予。
[0159] 可以按适合待治疗的（或待预防的）疾病的方式，给予本发明的药物组合物。给 予的量和频率将由以下因素决定，例如患者的病症、患者的疾病的类型和严重程度，虽然可 以通过临床试验确定适当的剂量。
[0160] 当表明"免疫有效量"、"抗肿瘤有效量"、"肿瘤抑制有效量"、或"治疗量"时，可以 由医师考虑患者（受试者）的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移的程度、和病症的个体差 异，确定待给予的本发明的组合物的明确的量。可以大体上阐明的是，可以按以下剂量：1〇4至IO9个细胞/kg体重、优选10 5至10 6个细胞/kg体重（包括那些范围内的整数值），给 予包含在此所述的T细胞的药物组合物。还可以按这些剂量，多次给予T细胞组合物。可 以通过使用免疫治疗中通常已知的输注技术，可以这些细胞（参见例如Rosenberg (罗森伯 格）等人，New Eng. J. of Med.(新英格兰医学杂志）319:1676,1988)。可以通过监测患者 的疾病病征并且因此调整治疗，由医药领域的普通技术人员容易地确定用于具体患者的最 佳剂量和治疗方案。
[0161] 在某些实施方式中，可能希望给予激活的T细胞至受试者，并且随后重新抽血（或 进行血液成分分离），根据本发明激活其中的T细胞，并且用这些激活并且扩张的T细胞 重新输注患者。可以每数个星期，进行这一过程多次。在某些实施方式中，可以从IOcc至 400cc的抽取血液中激活T细胞。在某些实施方式中，可以从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、 70(^、80(^、90(^、或100(^的抽取血液中激活1'细胞。不受理论约束，使用这一多次抽血/ 多次重新输注实验方案可以用于选择出某些群体的T细胞。
[0162] 可以按任何方便的方式进行受试者组合物的给予，包括通过喷雾、注射、摄食、输 液、植入或移植。可以将在此描述的组合物皮下地、皮内地、瘤内地、结内地、髓内地、肌内 地、通过静脉内（i.v.)注射、或腹膜内地给予至患者。在一个实施方式中，通过皮内注射或 皮下注射，将本发明的T细胞组合物给予至患者。在另一个实施方式中，优选通过i.v.注 射，给予本发明的T细胞组合物。可以将T细胞组合物直接注射进肿瘤、淋巴结、或感染部 位。
[0163] 在本发明的某些实施方式中，使用在此描述的方法，或本领域已知的其他方法激 活和扩张细胞，其中扩张 T细胞至治疗水平，并且结合（例如在之前、同时或之后）任何 数量的相关治疗方式给予至患者，这些相关治疗方式包括但不局限于用药剂治疗，例如抗 病毒治疗、西多福韦和白介素-2、阿糖胞苷（也称为ARA-C)或用于MS患者的那他珠单抗 治疗或用于银肩病患者的依法珠单抗治疗或用于PML患者的其他治疗。在另外的实施方 式中，可以与化疗，放射，免疫抑制剂（例如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和 FK506)，抗体或其他免疫消融药剂（例如CAM PATH、抗-CD3抗体或其他抗体治疗），细胞 毒素，氟达拉滨，环孢霉素，FK506,拉珀霉素，霉酚酸，留类，FR901228,细胞因子，以及辐射 组合，使用本发明的T细胞。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶calCineurin(钙调神经磷酸 酶）（环孢霉素和FK506)，抑或抑制对于生长因子诱导的信号传递而言重要的p70S6激酶 (拉珀霉素）（1^11(刘）等人，〇611(细胞）66:807-815，1991;他11(16^〇11(亨德森）等人， Immun.(免疫学）73:316-321，1991 ;Bierer (比勒）等人，Curr. Opin. Immun.(免疫学新观 点）5:763-773,1993)。在另外的实施方式中，结合（例如在之前、同时或之后）骨髓移植、 使用任一化疗剂（例如氟达拉滨）的T细胞消融治疗、外束放射治疗（XRT)、环磷酰胺、或 抗体（例如0KT3或CAMPATH)，将本发明的细胞组合物给予至患者。在另一个实施方式中， 在B-细胞消融治疗，例如与CD20反应的药剂，例如美罗华之后，给予本发明的细胞组合物。 例如，在一个实施方式中，受试者可以经历标准治疗，其中高剂量化疗之后是外周血干细胞 移植。在某些实施方式中，在移植后，受试者接受本发明的扩张的免疫细胞的输注。在一个 额外的实施方式中，在外科手术之前或之后给予扩张的细胞。
[0164] 待给予至患者的以上治疗的剂量将随正治疗的病症的明确性质和治疗的接受者 而变化。可以根据本领域习惯做法进行用于人类给予的剂量的缩放。例如对于成体患者， CAMPATH的剂量一般在1至约IOOmg的范围内，通常每天给予，持续1和30天之间的一个时 期。优选的每天剂量是每天1至l〇mg，虽然在一些实例中，可以使用高达40mg每天的更大 剂量（描述于美国专利号6, 120, 766中）。
[0165] 细朐闵子释放综合征（CRS)的治疗
[0166] 本发明部分基于以下发现：CART19细胞的体内增殖和与其关联的强力抗肿瘤活 性还与导致嗜血细胞性淋巴组织增生症（HLH)(也称为巨噬细胞活化综合征（MAS))的CRS 关联。不希望受任何具体理论约束，认为MAS/HLH是与CART19强力抗肿瘤活性关联的并且 可能是该活性所需的独特生物标记。
[0167] 因此，本发明提供了包括给予本发明的CAR进入患者的第一线的治疗，和包括给 予一个类型的治疗的第二线的治疗，以管理生成自使用CAR T细胞的第一线的治疗的提高 的水平的某些可溶性因子。
[0168] 在一个实施方式中，第二线的治疗包括用于治疗CRS的组合物和方法。CRS的症状 包括高烧、恶心、暂时的低血压、低氧、等。本发明基于以下观察：CART19细胞诱导患者中提 高水平的可溶性因子，包括但不局限于IFN-y、TNFa、IL-2和IL-6。因此，第二线的治疗 包括针对生成自给予CART19细胞的提高的细胞因子，用于中和这些作用的化合物和方法。 在一个实施方式中，中和剂能够抵消细胞因子表达/活性的不希望的一致爆发，并且因此 对预防、改善和治疗与CART19治疗关联的CRS是有用的。
[0169] 在一个实施方式中，在CART19细胞输注后约第10-12天进行CRS的治疗。
[0170] 在一个实施方式中，第二线的治疗包括给予一种留体至患者。在另一个实施方式 中，第二线的治疗包括给予更多的甾体、TNFa的抑制剂、和IL-6的抑制剂中的一种或多 种。TNFa抑制剂的示例是依那西普。IL-6抑制剂的示例是塔西单抗（toe)。
[0171] 实验实施例
[0172] 进一步参考以下实验实施例来详细描述本发明。仅出于说明的目的提供这些实施 例，并不旨在是限制性的，除非另外说明。因此，本发明绝不应理解为局限于以下实施例，而 是应解释为涵盖由于在此提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。
[0173] 不做进一步描述，认为本领域普通技术人员可以使用以上描述和以下说明性实施 例，制造并且利用本发明的化合物并且实践所要求的方法。因此，以下工作实施例确切地指 出了本发明的优选实施方式，并且不被解释为以任何方式限制本披露的剩余部分。
[0174] 实施例1 :与CAR T细朐输注组合的细朐闵子治疗
[0175] 在此呈现的结果证明，在输注CAR T细胞后，患者显示出差示表达水平的不同细胞 因子。在一些实例中，提高水平的一些细胞因子是由于输注的CAR T细胞的毒性（图1)。 观察到塔西单抗（抗-IL6)可以改善多个CAR的毒性，并且表面上地保护了 2个患者中全 部2人中的抗肿瘤作用（图2)。不希望受任何具体理论约束，认为阿那白滞素和阻断IL-I 的其他试剂在这方面也可以是有用的。在此呈现的数据还证明IL-I在患者中提高，并且这 会导致稍后IL-6升高。阿那白滞素是与ILl受体结合的并且阻断IL-Ia和0信号传递 这二者的IL-IRa重组蛋白。阿那白滞素具有短的1/2寿命。有利的是使用阿那白滞素来 开始治疗患者，因为IL-Ia和0都会被阻断，并且还减轻了细胞因子风暴，并且保持抗肿 瘤作用。
[0176] 还观察到，如通过穿孔素和IFN-y测量，抗体干预并不赋予CART19细胞功能性 (图 3)。
[0177] 实施例2 :CD19_重宙向的嵌合抗原#体T(CART19)细朐诱导细朐闵子释放综合征 (CRS)以及可以由IL-6桔抗剂塔西单抗（toe)管理的可治疗的巨噬细朐活化综合征（MAS) 的诱导
[0178] CART19细胞的输注导致体内100至100, OOOx的增殖，肿瘤溶解综合征，随后是持 久的抗肿瘤活性，以及在患有B细胞肿瘤的患者中的延长的持久性。在此呈现的这些结果 证明，CART19细胞的体内增殖和由此而来的强力抗肿瘤活性与导致嗜血细胞性淋巴组织增 生症（HLH)(也称为MAS)的CRS关联。不希望受任何具体理论约束，认为MAS/HLH是与强 力抗肿瘤活性关联的并且可能是该活性所需的独特生物标记。
[0179] 将由抗⑶19scFv/4_lBB/⑶3-G组成的CAR用慢病毒转导自体的T细胞，将这些T 细胞用抗-CD3/抗CD28珠粒离体激活/扩张，并且然后在2-8次先前治疗后，用这些T细 胞输注进患有持久的疾病的ALL或CLL患者。还在具有高水平的人ALL/人T细胞移植的 异种移植小鼠模型中将CART19抗ALL活性建模，并且使用2色生物发光成像同时检测CAR T细胞和ALL。
[0180] 在此呈现的结果提供了接受CART19细胞的10个患者的更新结果，这10个患者包 括9个患有CLL的患者和患有复发难治的ALL的1个幼体患者。6/9的可评价患者具有完 全恢复（CR)或部分恢复（PR)，包括4个持续的CR。尽管不存在急性输注毒性，但是所有响 应的患者还是发展了 CRS。都患有高烧，连同3或4级的低血压/低氧。CRS之后是CART19 细胞的峰值血液表达，并且然后是强度增加，直至CART19细胞峰值（输注后D10-31)。ALL 患者经历了最显著的毒性，具有4级低血压和呼吸衰竭。在D6的留体治疗并未导致改善。 在D9，TNFa和IL-6的值得注意的高水平（基线上方的峰值增加：IFNy在6040x ;IL-6在 988x ; IL-2R在56x，IL-2在163x和TNF a在17x)，给予TNF a和IL-6拮抗剂（依那西普 和toe)。这导致在12hr内发烧和低血压的解决，以及从呼吸机支持迅速切断至房间空气。 这些干预对CART19细胞表达或功效：发生在Dll上的CAR T峰值（2539个CAR+细胞/uL ; 通过流动77%的CD3细胞）没有明显影响，并且与示出65 %母细胞的她的初始研宄骨髓相 比，D23骨髓示出具有阴性最小残留疾病（MRD)的CR。虽然她没有CNS ALL病史，但是脊液 示出可检测的CART19细胞（21个淋巴细胞/mcL ;78% CAR+)。在输注后4mo,这一患者仍 然在CR中，其中在血液中是17个CART19细胞/uL，并且在骨髓中是31 % CAR+⑶3细胞。
[0181] 随后的响应患者的临床评定不出都具有MAS/HLH的证据，包括铁蛋白的提尚和 HLH的组织学证据。峰值铁蛋白水平范围是从44, 00至605, 000,之后并且继续是峰值T细 胞增殖。其他一致的发现包括与疾病和中度DIC无关的迅速发作的肝脾肿大。
[0182] 随后地，3个CLL患者还已经用toe治疗，还快速并且惊人地解决了高烧、低血压 和低氧。一个患者在DlO接受了 toc，并且伴随CART19扩张，达到了 CR。另一个患者在第 9天的toe给予后，迅速解决了 CRS，并且对反应的随访太短。第三个CLL患者在D3接受了 toc，针对早期发烧，并且不具有CART-19增殖，也没有反应。
[0183] 为了给细胞因子的阻断的时间测量建模，建立了使用生物发光原发性幼体ALL的 异种移植物，并且然后用来自临床制造的另外的细胞进行治疗。CART19细胞增殖并且导 致延长的存活。在T细胞输注前，用toe进行了细胞因子阻断，和/或依那西普用输注的 CART19细胞的更少体内增殖消除了疾病对照，证实了在给予早期toe (D3)的一个患者中看 到的结果。
[0184] CART19T细胞可以产生大量体内扩张、长期持久性、以及抗肿瘤功效，但是还诱导 了具有暗示迅速响应细胞因子阻断的MAS/HLH的特征的显著CRS。在显著CART19增殖的启 动前给予，TNFa和/或IL-6的阻断可以干扰增殖和效应子功能，但是如果在细胞增殖进 行中的一个点给予，则toe可以改善已经观察到与强大的临床反应关联的症状。
[0185] 实施例3用嵌合抗原#体表汰T细朐缓和ALL ：
[0186] 在此呈现的结果证明，在急性淋巴细胞白血病中（ALL)，CAR T细胞具有临床活 性。简要地，用转导了抗⑶19抗体和T-细胞信号传递分子的IO6至10 7个/kg的T细胞 (CTL019CAR T细胞；也称为CART19)治疗患有复发并且难治的前体-B细胞ALL的两个幼 体患者。在全部两个患者中，CTL019T细胞扩张了多于1000倍，并且送至骨髓。此外，CAR T细胞能够跨越血脑屏障，并且如在脑脊液中测量，以高水平持续至少6个月。注意到八个 严重的不良事件。全部两个患者都发展了细胞因子释放综合征（CRS)和B细胞发育不全。 在一个儿童中，CRS是严重的，并且在逆转该综合征中，用依那西普和塔西单抗的细胞因子 阻断是有效的，并且仍未阻止CAR T细胞扩张和抗白血病功效。在全部两个患者中都观察 到完全缓和，并且在治疗后9个月时，在一个患者中病情不间断。在治疗后约2个月，另一 个患者复发，其中母细胞不再表达CD19。
[0187] 在此呈现的结果证明，CAR修饰的T细胞能够在体内杀死甚至侵犯性的难治性急 性白血病细胞。不再表达靶的肿瘤细胞的出现表明，在一些患有ALL的患者中，除了⑶19， 需要靶向其他分子。
[0188] 如已经报道（Porter(波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂 志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine(科学转化 医学）3:95ra73)，在患有CLL的3个患者中，CTL019(CART19)细胞的体内表达和强大的抗 白血病作用。CTL019是包括⑶137 (4-1BB)信号传导域的CAR，并且使用慢病毒载体技术对 其进行表达（Milone (米龙）等人，1009, Mol Ther (分子治疗）17:1453-64)。在此呈现的 结果证明，在2个患有难治并且复发的ALL的幼体患者中，CTL019的用途。全部两个患者都 具有白血病的缓和，伴随送至骨髓和CNS的体内CTL019的强大表达。抗白血病作用是强力 的，因为患者患有化疗难治的疾病，阻碍了异源供体干细胞移植，并且另一个患者在异源脐 带血移植后复发，并且对blinatumomab (-种药物）（嵌合的双特异性抗-⑶3和抗-⑶19) 治疗有抗性。
[0189] 现在描述在这些实验中采用的材料和方法。
[0190] 材料和方法
[0191] CART19
[0192] 先前已经报道了 CTL019(CART19)生产（Porter (波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011 ,Science Translational Medicine(科学转化医学）3:95ra73)。如先前报道，在患者样本中 检测并且量化CTL019(Porter(波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂 志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine(科学转 化医学）3:95ra73)。
[0193] 样品柚取和加工
[0194] 在淡紫色顶部vacutainer管（K2EDTA)或红色顶部（无添加剂）vacutainer 管（Becton Dickinson公司）中收集样品（周围血液、骨髓）。在加工前，本质上如所述 (Olson(奥尔森）等人，2011，J Transl Med(转化医学杂志）9:26)，在抽取的2小时内 将淡紫色顶部管递送至实验室，或在保温容器中，在室温下发货过夜。根据建立的实验室 S0P，在30分钟内加工样品。如所述（Kalos (卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine (科学转化医学）3:95ra73)，对周围血液和骨髓单核细胞进行纯化、加工，并且储 存在液氮中。在抽取2小时内（包括凝固时间）加工红色顶部管；通过离心分离血清，分装 为单次使用的100 U L的等分部分，并且储存在-80°C。在抽吸30分钟内将CSF递送至实验 室，并且通过CSF流体的离心收集CSF中的细胞，并且对这些细胞进行加工，用于DNA和流 式细胞术。
[0195] Q-PCR 分析
[0196] 在淡紫色顶部 BD vacutainer 管（K2EDTA) (Becton Dickinson 公司）中收集全血 和骨髓样品。如所述（Kalos (卡洛斯）等人，2011 ,Science Translational Medicine (科 学转化医学）3:95ra73)，从全血直接分离基因组DNA，针对周围血液和骨髓样品，每个时间 点使用200ng基因组DNA，并且针对CSF样品，每个时间点使用18-21. 7ng基因组DNA，使用 ABI Taqman技术和经验证测定，大量进行关于基因组DNA样品的Q-PCR分析，以检测整合的 ⑶19CAR转基因序列。为了确定每单位DNA的拷贝数，产生8个点的标准曲线，由插入IOOng 的非转导的对照基因组DNA的5至IO6个拷贝的CTL019慢病毒质粒组成。对于所有可量化 的值，用小于〇.95%的％ CV-式三份评价每个数据点（样品、标准曲线），在3/3个重复中， 具有正的 Ct 值。如所述（Kalos (卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine (科 学转化医学）3:95ra73)，使用来自周围血液和骨髓的20ng输入基因组DNA (对于CSF样品 是2-4. 3ng)，以及特异性针对⑶KNlA基因上有的非转录基因组序列的引物/探针组合，进 行平行扩增反应，以控制研宄的DNA的质量。这些扩增反应产生了校正因子（CF)，以校正计 算的DNA输入对比实际的DNA输入。根据以下公式计算每微克DNA的转基因的拷贝数：从 每输入DNA(ng)的CTL019标准曲线计算的拷贝数X CF X 1000ng。由通过Q-PCR，量化输 注的细胞产物的标记的能力，确定这一测定的准确度。对于CH0P-100,这些盲确定分别产生 了 11. 1%和11. 6%的Q-PCR值和流动标记值，以及分别是20. 0%和14. 4%，是CH0P-101 输注产物的标记。
[0197] 可溶件闵子分析
[0198] 在红色（无添加剂）BD vacutainer管（Becton Dickinson公司）中收集全血，使 用建立的实验室SOP加工以获得血清，分装用于单次使用，并且储存在-80°C。使用Luminex 珠粒测定技术，和从Life technologies公司（Invitrogen公司）购买的试剂盒，进行可 溶性细胞因子的因子的量化。按制造商实验方案，使用3倍稀释系列产生9点标准曲线， 用该标准曲线进行测定。一式两份评价2个外部标准点，并且5个内部标准按照单倍；以 1:2稀释，一式两份评价所有样品；针对两份测量的计算的％ CV小于15%。用百分比表示 FlexMAP-3D上获得的数据，并且使用XPonent 4. 0软件和5-参数逻辑回归分析进行分析。 由80%-120% (观察值/期望值）范围确定标准曲线量化范围。报告的值包括在标准曲 线范围内的那些和通过逻辑回归分析计算的那些。
[0199] 抗体试剂
[0200] 以下抗体用于这些研宄：MDA-CAR(Jena(耶拿）和Cooper (库珀），2013, L?针 对CD19的抗独特型抗体。PlosONE(公共科学图书馆期刊）2013 ;印刷中），针对共轭至 Alexa647的⑶19CAR的鼠抗体。针对多参数免疫分型的抗体：T细胞检测组：抗-⑶3-FITC、 抗-CD8-PE、抗-CD14-PE-Cy7、抗-CD16-PE-Cy7、抗-CD19-PE-Cy7、抗-CD16-PE-Cy7。 B 细胞检测组：抗-CD20-FITC、抗-CD45-PE、抗-CD45-APC、抗-CD19-PE-Cy7、抗-CD19-PE、 抗-CD34-PCP-e710 和抗 CD34-APC，都购买自 e-Biosciences 公司。
[0201] 多参数流式细朐术
[0202] 在菲可帕克加工后，直接通过流式细胞术评价细胞，除了在冷冻保存的样品的溶 解后立即评价的CH0P-101基线样品。如在本文中所述，使用每个病症约0.2-0. 5x IO6个 总细胞（取决于样品中的细胞产率），并且针对CSF样品，使用痕量的在CSF流体的离心后 收集的细胞，并且使用荧光扣除对照（FMO)染色，进行针对周围血液和骨髓样品的多参数 免疫分型。使用制造商推荐的抗体和试剂浓度，在冰上，在IOOuL PBS中染色细胞30分 钟，洗涤，并且再悬浮在0.5%多聚甲醛中，并且使用装备有蓝色（488)和红色（633nm)激 光的Accuri C6流式细胞分析仪进行获取。以FCS文件格式输出Accuri文件，并且使用 FlowJo软件（版本9. 5. 3, Treestar)进行分析。使用单抗体染色和BD补偿珠粒（Becton Dickinson公司）建立补偿值，并且通过软件进行计算。对T细胞的门控策略如下：活细胞 (FSC/SSC)>dump 通道（CD14+CD16+CD19-PECy7)对比 CD3+>CD3+。对 B 细胞的门控策略如 下：活细胞（FSC/SSC)>SSC低事件〉CD19+。在单独的图中描述了针对CH0P-100和CH0P-101 样品的更多门控细节。
[0203] 分子MRD分析
[0204] 由Adaptive Biotechnologies公司（西雅图，华盛顿州）和使用基于Illumina HiSeq/MiSeq平台的免疫SEQ测定的BCR IGH⑶R3区的高通量下一代测序进行分子MRD分 析（Larimore (拉里莫尔）等人，2012，J Immunol (免疫学杂志）189:3221-30)。对于这些 分析，701-6, OOOng (约111，000-950, 000基因组当量）的分离自获得自患者的全血或骨髓 样品的基因组DNA经受组合的多重PCR和测序，随后是算法分析，以量化样品中单独的IGH CDR3序列。进行每个样品中TCRB CDR3区的平行扩增和测序（Robins (罗宾斯）等人，2009， Blood (血液）114:4099-107)以评定DNA样品的质量。对于每个患者，使用EMBL-EBI多重序 列比对工具对测定自不同时间点的样品的IGH⑶R3核苷酸序列进行比对（Goujon(古戎） 等人，2010，Nucleic Acids Res (核酸研宄）38:W695-9;Sievers (西弗斯）等人，2011，M〇1 Syst Biol (分子系统生物学）7:539)。跨越在以下时间点样品中测定的IGH CDR3序列在 生物信息学上追踪来自最早时间点样品的优势克隆，以鉴定具有95%或更大逐对序列一致 性的序列的存在。对于每个时间点，报告了对类似于优势克隆的那些序列的总测序读数。
[0205] 现在描述实验的结果。
[0206] 病例报告
[0207] CH0P-100是处于她的ALL的第二次复发中的7岁女孩。她在2年前确诊，并且 达到了最小残留疾病（MRD)的阴性缓和，在确诊后17个月复发。她在再诱导化疗后重 新进入缓和，但是在4个月后复发，此后她并不响应furtheclofaribine(-种药物）/ 依托泊苷/环磷酰胺。她在基线的核型为48，XX，del(9) (p21.3)，+ll，del(14) (q2 ? q24)，+16/46, XX [4]。通过在强化疗之前的血液成分分离获得外周血单核细胞（PBMC)，预期 可能存在不足的循环T细胞可供用于此类强治疗后的细胞制造。如以前所述（Porter (波 特）等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人， 2011，Science Translational Medicine (科学转化医学）3:95ra73)，按经 3 个连续天给予 的3. 8x IO8个细胞/kg(1.2x IO7个CTL019细胞/kg)的总剂量，这一患者输注有已经进行 抗⑶3/⑶28扩张并且慢病毒转导以表达抗⑶19CAR的CTL019细胞。在她的CTL019输注 前，她并没有接受淋巴细胞消耗性化疗，其中在CTL019输注前6轴，给予了最近的细胞毒性 治疗。注意到没有立即的输注毒性，但是她因为在第4天前进展为高烧的低级别发烧而住 院，并且在第5天，患者转移至儿科I⑶(CH0P-100,图4A)。这随后是迅速进展至显著的呼 吸和心血管危害，需要机械通气和血压支持。
[0208] 第二个ALL个患者是10岁女孩（CH0P-101)，她在确诊后28个月和CTL019输注 前10个月，已经经历了 4/6配对的非亲缘性脐带移植后的第二次复发。她在她的移植后， 已经经历了移植物抗宿主疾病（GVHD)，用治疗解决了这一疾病；她在她的复发时，摆脱了 免疫抑制。尽管进行了多次细胞毒性的和生物的治疗，她并没有随后重新进入缓和。她 的基线核型为 46XX，del(l) (pl3)，t(2 ;9) (q ? 21 ;q ? 21)，t(3 ;17) (p24 ;q23)，del(6) (ql6q21)，del(9)(ql3q22)，der (16)t (I ; ? ; 16) (pl3 ; ? pl3. 3)[9]，//46, Xy[1]。在 PBMC 收集前，用两个周期的blinatumomab(-种药物）对她进行治疗（Bargou(巴戈）等人， 2008, Science (科学）321:974-7)，没有反应。在PBMC收集时，她的周围血液细胞的68 %是 供体来源的。在前一周给予依托泊苷/环磷酰胺化疗用于淋巴细胞消耗后，制造 CTL019T细 胞并且按单次剂量中IO7个细胞/kg(1.4x IO6个CTL019细胞/kg)的总剂量进行输注。在 CTL019输注前一天，它的骨髓被取代为一群⑶19+/⑶34+ALL细胞，通过标准临床流式细胞 术（图7)，这些细胞具有CD19的可变表达。她没有立即的输注毒性，但是在D+6天发烧，并 且住院。她没有经历心肺毒性，并且并没有接受糖皮质激素类或抗细胞因子治疗。CH0P-101 经历了未知原因的发烧，怀疑是由于细胞因子释放（图4B)，肌痛，以及自发解决的两天的 精神错乱（3级）。在输注CTL019细胞后，她没有GVHD的证据。虽然已经从患者收集这些 细胞，但是它们仍很大程度上是供体（脐带血）来源的。
[0209] 全部两个#试者中的缓和的诱导
[0210] 如描绘总WBC、ALC和ANC相对于CTL019输注的时间测量的图所示，在CTL019输 注后2周内，全部两个受试者都具有循环的淋巴细胞和中性粒细胞的增加（图4C)。在图5 中更详细地示出，多数淋巴细胞由表达嵌合抗原受体的T细胞组成（图8)。在全部两个受 试者中，记录了高级非传染性发烧，随后是LDH的提高（图4A)。LDH的提高和高级发烧类 似于在CTL019输注后，CLL患者中先前描述的那些（Porter (波特）等人，2011，N Engl J Med(新英格兰医学杂志）365:725-33 ;Kalos(卡洛斯）等人，2011，Science Translational Medicine (科学转化医学）3:95ra73)。输注后约一个月，在全部两个受试者中都达到了白 血病的MRD阴性（〈0? 01% )形态学缓和（表1)。
[0211] CH0P-100中的临床缓和与截止2013年1月的已经持续至少9个月的深度分子缓 和关联（表1)。IGH基因座的高流量DNA测序揭示，在CH0P-100的血液和骨髓中，在D+23 天，总IGH读数的显著降低。在D+180天测序的多于1百万个细胞当量中，在血液和骨髓中 未检测到恶性克隆。相比之下，在血液和骨髓中容易地检测到T细胞受体序列，表明在所有 时间点测试的DNA的完整性。
[0212] 表I :CH0P-100和101的血液和骨髓中分子缓和的诱导
【权利要求】
1. 治疗患有与肿瘤抗原的提高的表达关联的疾病、失调或病症的患者的方法，该方法 包括给予对其有需要的患者第一线治疗和第二线治疗，其中该第一线治疗包括给予该患者 有效量的遗传修饰以表达CAR的细胞，其中该CAR包括抗原结合域、跨膜结构域和细胞内信 号传导域。
2. 如权利要求1所述的方法，其中在给予该第一线治疗后，监测该患者中的细胞因子 水平，以确定待给予至该患者的第二线治疗的适当类型，并且给予对其有需要的该患者适 当的第二线治疗。
3. 如权利要求2所述的方法，其中细胞因子水平的增加鉴定待给予至对其有需要的该 患者的细胞因子抑制治疗的类型。
4. 如权利要求3所述的方法，其中该细胞因子选自IL-1 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-1 a、 MIP-1 0、MCP-l、TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、 EGF、HGF、FGF- 0、CD40、CD40L、铁蛋白、以及它们的任何组合。
5. 如权利要求3所述的方法，其中该细胞因子抑制治疗选自小干扰RNA(siRNA)、微 RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负性突变体的表达载体、抗体、肽、小分子、细胞因子抑 制药物、以及它们的任何组合。
6. 如权利要求2所述的方法，其中通过检测来自该患者的生物样品中的细胞因子的蛋 白水平来监测这些细胞因子水平。
7. 如权利要求2所述的方法，其中通过检测来自该患者的生物样品中的细胞因子的核 酸水平来监测这些细胞因子水平。
8. 减少或避免与给予遗传修饰以表达CAR的细胞关联的不良作用的方法，其中该CAR 包括抗原结合域、跨膜结构域、以及细胞内信号传导域，该方法包括监测患者中细胞因子的 水平以确定待给予至该患者的细胞因子治疗的适当类型并且给予适当的细胞因子治疗至 该患者。
9. 如权利要求8所述的方法，其中细胞因子水平中的增加鉴定待给予至该患者的细胞 因子抑制治疗的类型。
10. 如权利要求9所述的方法，其中该细胞因子选自IL-1 0、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-IRa、IL-2R、IFN-a、IFN-y、MIP-1 a、 MIP-1 0、MCP-l、TNFa、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR 因子、VEGF、RANTES、EOTAXIN、 EGF、HGF、FGF- 0、CD40、CD40L、铁蛋白、以及它们的任何组合。
11. 如权利要求9所述的方法，其中该细胞因子抑制治疗选自小干扰RNA(siRNA)、微 RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负性突变体的表达载体、细胞内抗体、肽、小分子、细胞 因子抑制药物、以及它们的任何组合。
12. 如权利要求8所述的方法，其中通过检测来自该患者的生物样品中的细胞因子的 蛋白水平来监测这些细胞因子水平。
13. 如权利要求8所述的方法，其中通过检测来自该患者的生物样品中的细胞因子的 核酸水平来监测这些细胞因子水平。
【文档编号】A61K39/00GK104427997SQ201380037301
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2012年7月13日
【发明者】C·H·琼, B·L·莱文, M·D·卡罗斯, S·格鲁普 申请人:宾夕法尼亚大学董事会, 费城儿童医院