一种牙齿盖髓剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及组织再生材料研发领域，公开了一种牙齿盖髓剂及其制备方法，所述牙齿盖髓剂为rhBMP2-PLGA缓释微球；其制备方法，包括以下步骤：将先rhBMP2溶液加入到PLGA二氯甲烷溶液中，冰浴条件下超声乳化形成均匀的初乳，并用高速匀质机在10000r/min条件下进行搅拌；抽取搅拌后的初乳匀速注于PVA溶液中，均匀分散形成复乳；磁力搅拌，使二氯甲烷挥发完全后离心，收集沉淀物；去离子水反复洗涤后冷冻干燥,得rhBMP2-PLGA缓释微球，4℃保存。本发明的rhBMP2-PLGA缓释微球具有缓释长效作用，保护基因重组人骨形成蛋白2的相关因子的活性，形成新的牙本质，以达到保护活髓的目的。
【专利说明】一种牙齿盖髓剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及及组织再生材料研发领域，特别涉及一种牙齿盖髓剂及其制备方法。【背景技术】
[0002]牙髓疾病治疗中活髓保存治疗是最符合生物学观点的方法，在其治疗中盖髓剂的作用至关重要。在目前所用的众多盖髓材料中，骨形态发生蛋白(Bone MorphogeneticProtein, BMP)是一直普遍关注的材料之一。有报道认为BMP用做盖髓治疗，短时期内便可形成大量修复性牙本质封闭露髓孔，有利于牙髓的恢复。但是，当BMP单独在体内应用时，很快就会被稀释或是被蛋白酶破坏，对牙髓细胞的作用时间短，不能有效的发挥其应有的生物性能；而且不能为牙本质形成提供支架，使其在临床应用中受到很大的限制。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种牙齿盖髓剂及其制备方法，以rhBMP2_PLGA缓释微球材料作为牙齿盖髓剂，可以解决BMP在应用时的不足，既能起到缓释作用；又可以保护基因重组人骨形成蛋白 2 (recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2))的相关因子的活性，达到保护活髓的目的。
[0004]为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
[0005]一种牙齿盖髓 剂，其特征在于，所述牙齿盖髓剂为rhBMP2_PLGA缓释微球。
[0006]上述牙齿盖髓剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:将先rhBMP2溶液加入到PLGA 二氯甲烷溶液中，冰浴条件下超声乳化形成均匀的初乳，并用高速匀质机在lOOOOr/min条件下进行搅拌；抽取搅拌后的初乳匀速注于PVA溶液中，均匀分散形成复乳；磁力搅拌，使二氯甲烷挥发完全后离心，收集沉淀物；去离子水反复洗涤后冷冻干燥，得作为牙齿盖髓剂的rhBMP2-PLGA缓释微球，4°C保存。
[0007]上述技术方案中，优选地，rhBMP2溶液的质量-体积浓度为0.1% (mg/ml), PLGA二氯甲烷溶液的质量-体积浓度为2.5% (mg/ml), PVA溶液的质量-体积浓度为1% (mg/ml)，其中rhBMP2溶液、PLGA 二氯甲烷溶液、PVA溶液的体积比为1:10:100。
[0008]本发明以rhBMP2_PLGA缓释微球作为牙齿盖髓剂，基因重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2))为主体，以聚乳酸-轻基乙酸共聚物〔poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)为支架,解决了 rhBMP-2 在体内被快速稀释和被蛋白酶破坏的技术问题，具有缓释长效作用，保护基因重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2))的相关因子的活性，形成新的牙本质，以达到保护活髓的目的。
[0009]此外，PLGA生物相容性较好、可生物降解、无毒性；而且其本身及其降解产物均对多肽类、蛋白等无明显的不良反应，安全可靠，并得到美国FDA的批准用于临床。
【专利附图】
【附图说明】[0010]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明。
[0011]图1为rhBMP2-PLGA缓释微球扫描电镜照片图。
[0012]图2为rhBMP2_PLGA缓释微球粒径分布图。
[0013]图3为rhBMP2_PLGA缓释微球的体外释放折线图。
[0014]图4为空白对照组实验结果图，图中无硬组织形成。
[0015]图5为rhBMP2组实验结果图，图中有牙本质钙化桥，但相对较少。
[0016]图6为rhBMP2_PLGA缓释微球组实验结果图，图中有牙本质生成，形成完整的钙化桥。
[0017]图7为胶原组实验结果图，图中可以观察到完整的牙本质桥形成；
[0018]图8为抗生素组实验结果图，图中有钙化的硬组织生成，但无完整的牙本质钙化桥。
[0019]图9为抗生素和rhBMP2_PLGA缓释微球混合组实验结果图，图中可以观察到有完整的牙本质钙化桥。
[0020]图10为胶原和rhBMP2_PLGA缓释微球混合组实验结果图，图中可以观察到有完整的牙本质钙化桥生成，且髓腔内无钙化。
[0021]图11为各组动物实验牙本质桥厚度的柱状图。`【具体实施方式】
[0022]本发明中，PLGA、PVA购买于SIGMA公司；rhBMP2购于上海瑞邦生物材料有限公司；rhBMP2ELISA检测试剂盒购于武汉博士德公司。采用(水包油、油包水)W/0/W复乳溶剂挥发法制备rhBMP2-PLGA缓释微球。
[0023]1、实验方法
[0024](I)实验制备:
[0025]将200ul含0.1% (mg/ml)质量-体积浓度的rhBMP2溶液(内水相，设为Wl)加入到2ml含有2.5% (mg/ml)质量-体积浓度的PLGA 二氯甲烷溶液(油相，设为O)中，冰浴条件下超声乳化形成均匀的初乳(W1/0)，立即用高速匀质机在10000r/min条件下进行搅拌；用针筒抽取搅拌后的初乳缓慢匀速注于到20ml含1% (mg/ml)质量-体积浓度的PVA溶液(外水相，设为W2)中，均匀分散2min形成Wl / O / W2的复乳；磁力搅拌3~4h，使得二氯甲烷挥发完全后，15000r/min离心5min，收集沉淀物；去离子水反复洗5次，冷冻干燥48h，得rhBMP2-PLGA缓释微球，4°C保存。
[0026](2)形态观察:
[0027]取适量rhBMP2_PLGA缓释微球均匀分散在贴有双面胶的金属板上，喷金后以扫面电镜(SEM)观察其表面形态。
[0028]( 3 )微球粒径和分布测定:
[0029]取适量rhBMP2_PLGA缓释微球分散于超纯水中，超声振荡分散均匀后，在激光粒度分析仪(马尔文Nano ZS-90)中测定其分布和粒径。
[0030](4)测定包封率和载药量:
[0031]精密称取rhBMP2-PLGA 缓释微球 20mg，加入 2mL0.lmol/L NaOH(含 0.5%SDS)溶液中，于37°C恒温水浴振荡孵育24h，使微球完全溶解；用0.lmol/LHCl中和至pH值为7.0后，12000r/min离心5min，取上清液，用ELISA测定载药微球中rhBMP2的含量，具体操作按照试剂盒上的说明进行。并分别按下列公式计算包封率和载药量:
[0032]微球包封率(％)=(微球中的含药量/投药量)X 100%
[0033]微球载药量(％)=(微球中的含药量/微球质量)X 100%
[0034]( 5 )计算释放量:
[0035]准确量取rhBMP2-PLGA缓释微球IOmg溶于5ml pH7.4的PBS缓冲液(20mmol)为释放介质，37°C下振荡，分别于l、3、7、14、28d时分别取出上清液200ul并补充新鲜等量的释放介质。上清液通过rhBMP2ELISA测定rhBMP2的浓度，并计算释放量。
[0036](6)动物实验:
[0037]选用2只健康成年比格犬(购于西安市迪乐普生物资源开发有限公司)，SPF级(安全健康级别)，体重分别为10.8kg、ll.2kg，年龄12-14个月，均为雄性，牙列完整且牙体牙周组织健康，全身无疾病，实验前适应性饲养I~2周，待性情稳定后用于实验。
[0038]每只犬选取上下两侧前白齿、 门齿，共42颗牙齿，将42颗牙按随机数字表法随机分成7组:rhBMP2组，rhBMP2-PLGA缓释微球，胶原，牙科抗生素，牙科抗生素+rhBMP2-PLGA缓释微球，胶原+ rhBMP2-PLGA缓释微球，空白对照组；每组6颗牙。实验后均饲养3个月后处死动物。
[0039]盖髓手术前12h开始禁食。术前30分钟用速眠新注射液按0.lml/Kg的剂量行术前肌肉注射麻醉，术中根据麻醉情况适当追加注射质量-体积浓度为3%的戊巴比妥钠，以维持麻醉效果。麻醉后将实验犬仰卧固定于手术台上，用摩尔浓度为3%过氧化氢液冲洗口腔，并用质量-体积浓度为1%碘酊和体积浓度为75%的酒精对口腔及实验牙进行消毒。在实验牙的咬合面用高速涡轮手机小球钻露髓直径1mm，用IOml质量-体积浓度为2.5%的次氯酸钠轻柔冲洗，再用2ml质量-体积浓度为1796EDTA (中文名称:乙二胺四乙酸)冲洗，冲洗完毕后止血、干燥，将盖髓剂置于露髓处，放入大小基本相同的明胶海绵，玻璃离子充填。具体操作步骤如下:
[0040]空白对照组:直接放置明胶海绵，玻璃离子充填，并涂布凡士林隔湿。
[0041]rhBMP2组:将rhBMP2浸于明胶海绵后直接置于牙髓断面，玻璃离子充填，并涂布凡士林隔湿。
[0042]rhBMP2-PLGA缓释微球组:将rhBMP2_PLGA缓释微球直接置于牙髓断面，放置明胶海绵，玻璃离子充填，并涂布凡士林隔湿。
[0043]胶原组:用明胶海绵蘸取适量的胶原置于牙髓断面，玻璃离子充填，并涂布凡士林隔湿。
[0044]抗生素组:将两种制剂混合均匀，并用明胶海绵浸取适量置于牙髓断面上，玻璃离子充填，并涂布凡士林隔湿。
[0045]抗生素和rhBMP2_PLGA缓释微球混合组:将浸有适量抗生素的明胶海绵蘸取适量的rhBMP2-PLGA缓释微球的白色粉末(冷冻干燥后)，置于牙髓断面上，玻璃离子充填，并涂布凡士林隔湿。
[0046]胶原和rhBMP2_PLGA缓释微球混合组:将浸有适量胶原的明胶海绵蘸取适量的rhBMP2-PLGA缓释微球白色粉末，置于牙髓断面上，玻璃离子充填，并涂布凡士林隔湿。
[0047]本实验例中，抗生素为甲硝哒唑，环丙沙星，二甲胺四环素，米诺环素的等质量份混合物；并且整个手术过程均由同一人完成，术后前三天动物进软食，抗生素注射三天。术后定期观察实验犬的口腔内充填物的情况和全身精神状况。术后对实验牙拍摄X线片。术后三个月后将动物处死取材，用MiCT0CT扫描观察硬组织形成。
[0048]2、实验结果
[0049](I)优化工艺下制备的rhBMP2_PLGA缓释微球冻干后呈白色粉末状，无塌陷现象；rhBMP2-PLGA缓释微球形态圆整均匀，表面光滑，无粘连如图1。
[0050](2)rhBMP2-PLGA缓释微球粒径分布呈正态分布，如图2所示，其分布范围集中，大部分微球粒径分布在3um~4um之间。
[0051](3) rhBMP2-PLGA缓释微球的包封率72.5%±4.17%，微球的载药率为
0.38%±0.24%。体外释放Id时载有rhBMP2的缓释微球释放量为19.36%±1.83%，表现为突释性释放，这主要是由于缓释微球表面的药物释放所致，随后释放比较缓慢，但累计释放量持续增加，到28d时达到52.76%±3.7%。如图3所示。
[0052](4)动物实验结果:沿着实验牙唇舌向牙体长轴，MicroCT观察并测量出新生牙本质的厚度，并求出各组的平均值。
[0053]空白对照组:如图4所示，没有观察到硬组织形成；
[0054]rhBMP2组:如图5所示，可以观察到有完整的牙本质钙化桥，但相对较少。
[0055]rhBMP2-PLGA缓释微球组:如图6所示，可以观察到有完整的钙化桥生成，髓腔无钙化；
[0056]胶原组:如图7所示，可以观察到完整的牙本质桥形成；
[0057]抗生素组:如图8所示，可以观察到有钙化的硬组织生成，但无完整的牙本质钙化桥；
[0058]抗生素和rhBMP2_PLGA缓释微球混合组:如图9所示，可以观察到有完整的牙本质钙化桥生成，且髓腔内无钙化；
[0059]胶原和rhBMP2_PLGA缓释微球混合组:如图10所示，可以观察到有完整的牙本质钙化桥生成，且髓腔内无钙化。
[0060]如图11所示，rhBMP2组与胶原组、rhBMP2_PLGA缓释微球组、抗生素和rhBMP2-PLGA缓释微球混合组、抗生素和rhBMP2_PLGA缓释微球混合组之间具有有统计学差异(P〈0.05)。
[0061]3、实验结论
[0062]本实验通过使用无载体的rhBMP2与其他组的实验结果进行比较后发现，单纯使用rhBMP2对诱导修复性牙本质的形成也有一定的效果，但其效果远远不及使用了rhBMP2-PLGA缓释微球的其他组，具体原因是牙髓组织中的有机物对rhBMP2的活性有所破坏导致。
[0063]本实验结果表明rhBMP2-PLGArhBMP2-PLGA缓释微球及复合牙科抗生素进行盖髓术后对牙髓细胞的诱导分化作用较其它组强，在相同时间内形成的牙本质桥较厚且完整，具有良好的盖髓效果，为其用于临床提供可行性。
[0064]本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现，或不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。特别需要指出的是，上述所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本`发明保护范围内。
【权利要求】
1.一种牙齿盖髓剂，其特征在于，所述牙齿盖髓剂为rhBMP2-PLGA缓释微球。
2.如权利要求1所述的牙齿盖髓剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:将先rhBMP2溶液加入到PLGA 二氯甲烷溶液中，冰浴条件下超声乳化形成均匀的初乳，并用高速匀质机在10000r/min条件下进行搅拌；抽取搅拌后的初乳匀速注于PVA溶液中,均匀分散形成复乳；磁力搅拌，使二氯甲烷挥发完全后离心，收集沉淀物；去离子水反复洗涤后冷冻干燥，得作为牙齿盖髓剂的rhBMP2-PLGA缓释微球，4°C保存。
3.如权利要求2所述的牙齿盖髓剂的制备方法，其特征在于，rhBMP2溶液的质量-体积浓度为0.1% (mg/ml), PLGA 二氯甲烷溶液的质量-体积浓度为2.5% (mg/ml), PVA溶液的质量-体积浓度为1% (mg/ml )，其中rhBMP2溶液、PLGA 二氯甲烷溶液、PVA溶液的体积比为 I:10:100o
【文档编号】A61K6/02GK103767881SQ201410004894
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】张亚庆, 屈铁军, 柴雪, 王蕾, 何文喜 申请人:中国人民解放军第四军医大学