健脾养正消症方在化疗后免疫功能方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种健脾养正消症方在制备用于降低化疗后免疫功能损伤的药物中的应用。该应用是健脾养正消症方的一种新用途，健脾养正消症方可提高脾脏指数、胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能、NK细胞活性和T细胞增殖能力，降低T-reg细胞比例，因此健脾养正消症方有良好的减轻化疗引起的免疫损伤的作用。尤其是在对环磷酰胺化疗后免疫功能损伤方面有很明显的降低。
【专利说明】健脾养正消症方在化疗后免疫功能方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种复方组合药物的新应用，具体涉及一种健脾养正消症方在化疗后免疫功能损伤方面的应用。
【背景技术】
[0002]胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，是第四高发的恶性肿瘤，死亡率则高居第二位，对人类的生命和健康造成极大的威胁。2002年，全球胃癌发病人数为93万，而死亡则超过70万。我国是胃癌的高发区，发病约占全球的2/5。每年发病约40万，死亡约30万，发病人数占全球胃癌发病人数的41 %，其防治形势处于严峻状态。在我国，约40%的胃癌患者在就诊时即为晚期，另外60%左右的胃癌在接受根治手术后必将出现复发转移。据研究数据显示:晚期胃癌一年生存率为8%，中位生存期为7~9个月。对这部分病人而言，如何通过合理的治疗延长其生存期，改善生存质量，是当前肿瘤学研究的重点和难点，也是我国对重大疾病防治工作的重点领域。
[0003]目前健脾养正消症方对化疗后正虚邪实的患者有良好的治疗作用。我们以通过体内外实验证明该方有抑制多种消化道细胞增殖，诱导胃癌细胞早期凋亡、调节胃癌细胞周期的作用。但健脾养正消症方对化疗后免疫功能的影响未曾研究。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于提供一种健脾养正消症方在制备用于降低化疗后免疫功能损伤的药物中的应用。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:一种健脾养正消症方在制备用于降低化疗后免疫功能损伤的药物中的应用。
[0006]本发明进一步改进，所述健脾养正消症方在制备用于降低环磷酰胺(CTX)诱导的化疗后免疫功能损伤的药物中的应用。
[0007]本发明中，所述健脾养正消症方包括如下原料药:党参15g，炒白术10g，茯苓10g，生薏仁20g,当归IOg,淮山药15g,木香IOg,白苟IOg,陈皮6g,菝葜30g,石见穿30g,炎甘草3g。
[0008]有益效果:本发明健脾养正消症方在制备用于降低化疗后免疫功能损伤的药物中的应用是该药方的新应用，健脾养正消症方可提高脾脏指数、胸腺指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能、NK细胞活性和T细胞增殖能力，降低T-reg细胞比例，因此健脾养正消症方有良好的减轻化疗引起的免疫损伤的作用。尤其是在对环磷酰胺化疗后免疫功能损伤方面有很明显的降低。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为本发明健脾养正消症方对CTX化疗后小鼠体重的影响。【具体实施方式】
[0010]本发明健脾养正消症方在制备用于降低化疗后免疫功能损伤的药物中的应用。其中，健脾养正消症方包括如下原料药:党参15g，炒白术10g，茯苓10g，生薏仁20g，当归IOg,淮山药15g,木香IOg,白苟IOg,陈皮6g,菝葜30g,石见穿30g,炎甘草3g。
[0011]由于CTX是对骨髓损伤最严重的化疗药物。而免疫细胞多从骨髓中分化而来，所以也可以说CTX是对免疫功能损伤最严重的化疗药。
[0012]下面结合实验例来对本发明的有益效果作进一步的详细说明。
[0013]实验例:
[0014]I材料与仪器
[0015]1.1动物及饲养环境:
[0016]BALB/c小鼠(上海斯莱克动物中心，合格证号:SCXK (沪)2007-0005)。21只，雌雄各半，10-12周龄，体重18-20g，每组7只；SPF环境饲养，室内定期紫外照射，鼠笼、垫料、饮水均严格消毒。
[0017]1.2药品购买及制备:
[0018]健脾养正消症方:该方包括如下原料药:党参15g，炒白术10g，茯苓10g，生薏仁20g,当归IOg,淮山药15g,木香IOg,白苟IOg,陈皮6g,菝葜30g,石见穿30g,炎甘草3g。 [0019]首先往原料药加原料药总重量10倍量双蒸水浸泡30min，煮沸后小火再煮30min，倒出液体后，再加原料药总重量5倍的双蒸水，再煮30min，将两次的液体合并，水浴浓缩至
2.5g.mL—WC冰箱保存。
[0020]环磷酰胺(CTX):江苏恒瑞医药股份有限公司，批号:12042425。
[0021]1.3试剂及仪器:
[0022]RPM1-1640完全培养基(凯基公司)，酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司产品)，CO2培养箱(上海福玛实验设备有限公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，倒置显微镜(南京江南水新光学有限公司)。
[0023]2实验方法
[0024]2.1分组及给药
[0025]随机分成空白对照组、CTX组、中药联合组(健脾养正消症方+CTX组)。实验第Id起，空白组及CTX组灌胃NS，中药联合组灌胃健脾养正消症方，50g ^kgil/日，连续10天。灌胃第3d，CTX组和中药联合组，一次性腹腔注射CTX200mg.kg_\空白组腹腔注射等量的NS。第11天，眼眶取血，处死小鼠。
[0026]2.2脾脏、胸腺指数
[0027]小鼠处死后，无菌取下脾脏、胸腺，称重并计算脏器指数。
[0028]脏器指数=脏器重量(g) /动物体重(kg)
[0029]2.3腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定
[0030]实验第8天，消毒小鼠腹部，腹腔注射质量浓度为4.5%可溶性淀粉(淀粉以生理盐水配置，高压灭菌)，2mL/只小鼠。第11天，处死小鼠后，剪开小鼠皮肤，暴露腹膜。用注射器沿腹中线注入4摄氏度的冷PBS液(磷酸缓冲液)10mL，轻揉腹部5min，回抽腹腔液体。如此重复冲洗腹腔2次。合并收集的腹腔灌洗液，4°C，250g，10min离心，弃上清。用冷RPM1-1640培养液洗两次，调节细胞浓度至2 X 106/mL, 100 μ I/孔加入96孔培养板中，每个样本设3个复孔。37°C，5% CO2培养箱中培养2h，37摄氏度的温PBS液洗并吸出未贴壁细胞，得到巨噬细胞单层。每孔加质量浓度为0.03%中性红溶液100 μ 1，置CO2培养箱培养lh，37摄氏度的温PBS液冲洗未被吞噬的中性红3次。每孔加细胞裂解液(凯基公司，货号:KGP601) 100y 1，4°C冰箱过夜，酶标仪测量570nm处OD值。
[0031]2.4NK细胞活性测定
[0032]2.4.1脾巴细胞悬液制备:小鼠处死后，无菌摘取脾脏，剔除脂肪组织。冷PBS液4摄氏度滴注下，200目钢网研磨过滤，1500rmp离心，5分钟。加入红细胞裂解液(凯基公司，货号:KGP11100)。
[0033]重悬3分钟，溶解红细胞，PBS中止，洗涤2次，得到脾巴细胞悬液。
[0034]2.4.2用含质量浓度10%小牛血清的RPM1-1640培养液将脾巴细胞悬液调至
IX IOVmL作为效应细胞。取传代培养的L929小鼠成纤维细胞(凯基公司，货号:KG087)用质量浓度为0.25%胰酶并调整L929细胞浓度为2 X 105/mL作为靶细胞，在96孔板上每孔加入靶细胞悬液100μ 1，37°C，5% CO2培养90min，使其贴壁成单层细胞，然后实验孔每孔加100 μ I效应细胞悬液，每组4个复孔。靶细胞对照孔加含质量浓度10%小牛血清的RPM1-1640培养液100 μ I。将96孔板放在37°C，5% CO2孵育20h，去上清，用生理盐水轻轻注满各孔，反复3次，以除去效应细胞和被杀伤脱落的靶细胞，在滤纸上吸干孔内水分，每孔加入质量浓度为0.1 %的中性红染液100 μ 1，孵育30min，弃去染液，生理盐水洗3遍，每孔加100 μ I细胞裂解液，使含中性红的靶细胞溶解，摇匀，酶标仪450nm测OD值，用以下公式计算杀伤率:
[0035]杀伤率(％ )=(靶细胞OD值-实验组OD值)/靶细胞OD值X 100% [0036]2.5T淋巴细胞增殖能力的测定
[0037]常规制作脾细胞悬液，调脾细胞悬液浓度至5 X 106/L，100 μ I/孔加入96孔培养板，再分别加入ConA (刀豆球蛋白Α) 100 μ I/孔，使ConA终浓度为5 μ g.mL' 37°C、体积浓度为5% CO2培养箱放置56h后取出，每孔吸出10 μ 1，加0.5g.L—1的MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)10 μ 1，置培养箱内4h。取出培养板，弃上清，每孔加DMSO (二甲基亚砜)100μ1，震荡30秒，静置20min，酶标仪测570nm的吸光度(OD)值。以样本OD值代表T淋巴细胞增殖能力。
[0038]3.统计学处理
[0039]采用SPSS13.0统计软件，所有数据行方差分析，组间比较采用ANOVA检验，以P〈0.05为有统计学差异。
[0040]4.实验结果
[0041]4.1 一般情况的观察
[0042]环磷酰胺组小鼠化疗后第2天出现体重减轻，进食活动下降，明显腹泻。而联用健脾养正消症方(中药联合组)，体重减轻较少，进食活动无明显影响，无明显腹泻。见表1，图1。
[0043]表1健脾养正消症方对CTX化疗后小鼠体重的影响
[0044]
【权利要求】
1.一种健脾养正消症方在制备用于降低化疗后免疫功能损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述健脾养正消症方在制备用于降低环磷酰胺诱导的化疗后免疫功能损伤的药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述健脾养正消症方包括如下原料药:党参15g,炒白术IOg,获茶IOg,生薏仁20g,当归IOg,淮山药15g,木香IOg,白苟IOg,陈皮6g,菝葜30g,石见穿30g,炙 甘草3g。
【文档编号】A61P37/04GK103877435SQ201410055831
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】吴坚, 刘沈林, 邹玺, 张星星 申请人:江苏省中医院