一种抗肝癌和肺癌的中药组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，由质量比1:10～20:1～10的重楼总皂苷提取物、姜黄提取物和山药提取物组成。经体外MTT法活性实验证明，本发明的中药组合物对LA795肺癌细胞株和HepG2肝癌细胞株均具有抑制生长作用，IC50分别可达20mg/mL(生药量)以下。体内实验证明，本发明的中药组合物对小鼠T739肺癌转移小鼠，HepA肝癌和H22肝癌均具有显著抑制生长作用，肿瘤抑制率分别可达到53%、55%和57%。本发明的组合物抑瘤效果与组成组合物的组份给药相比具有协同增效作用。
【专利说明】一种抗肝癌和肺癌的中药组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗肝癌和肺癌的中药组合物及其制备方法，属于中药【技术领域】【背景技术】[0002]中药重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七叶一枝花 Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖,具有清热解毒，消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症，是中成药云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片等的主要组成药物。现代药理研究表明重楼具有细胞毒活性、抑菌抗炎、镇痛、止血、镇静、抗早孕、杀精、对呼吸系统以及心血管系统作用等，在临床应用于治疗肺系疾病、功能性子宫出血、淋巴结结核溃疡、神经性皮炎和外科炎症以及治疗肿瘤等疗效显著。目前有重楼入药的上市中成药复方有金复康口服液、软坚口服液、楼莲胶囊、肝复乐片等。近年来，重楼及其抗肿瘤有效成分重楼总皂苷的文献报道日益增多。中国中药杂志，2008，33 (16) =2057-2060公开了滇重楼皂苷对10种肿瘤细胞株的细胞毒谱及构效关系研究；黄贤校等在中草药杂志2009，40 (3) =483-489发表了重楼属药用植物皂苷类化学成分及其生源途径的研究进展；陈志红等考察了重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及对细胞周期的影响；朱丽丽等对重楼皂苷抑制SGC-7901细胞增殖及诱导凋亡进行了研究；林云华研究发现重楼和奥沙利钼在体外、体内实验中可能具有一定抗血管生成的作用，两者联合应用可能具有协同增效作用。贾科等发现重楼总皂苷可显著抑制MGC-803细胞的生长并呈时间-剂量依赖关系，可阻滞细胞于S期，诱导细胞凋亡率的升高；可显著抑制EphA2、Survivin蛋白的表达，同时上调Caspase_3蛋白的表达,进而得出结论其作用机制可能与下调EphA2和Survivin的表达以及促进Caspase_3的表达有关。中国专利200610052223.8公开了重楼总皂苷的制备方法，200810052092.2也公开了以重楼总皂苷为有效成分的药物制剂及其制备方法。
[0003]姜黄始载于《唐本草》,为姜科植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根莖,其性味辛、苦、温，归脾、肝经，具有破血行气，通经止痛之功效，可用于胸胁刺痛，胸痹心痛，痛经经闭，癥瘕，风湿肩臂疼痛，跌扑肿痛等病症的治疗。姜黄含有多种化学成分，主要成分为姜黄素类化合物:姜黄素、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、二氢姜黄素等；倍半萜类化合物:姜黄新酮、姜黄酮醇A、B等；挥发油(4.2%):姜黄酮、姜黄烯、莪术醇等。姜黄素等有效成分的药理作用广泛，其抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗抑郁、抗肿瘤等作用已被普遍认可，其中抗肿瘤作用自1985年首次提出后，已有大量的实验研究证实，作用机制主要包括诱导肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成，阻滞细胞周期进程和逆转肿瘤细胞多药耐药等。黄东生等研究发现，姜黄素能够增强Caspase-8的表达，从而启动外源性凋亡途径，诱导人肺癌细胞凋亡。方悦等报道姜黄素具有抗食道癌、胃癌、肝癌、结肠癌等消化系统肿瘤的作用。中国专利CN1931353A公开了姜黄素提取及其药物组合物制备方法。
[0004]山药(Rhizama Dioscoreae)为薯菌科植物薯菌的干燥块莖，属多年生缠绕草本植物。又名薯蓣。山药是我国传统保健食品之一，其性味甘、平。归脾、肺、肾经。具有健脾胃，益肺肾，补虚羸等功效。山药是卫生部公布的药食两用的植物之一，其所含化学成分有脂肪酸、蛋白质和氨基酸、酯类、多糖类和多种微量元素。现代药理研究表明山药具有抗氧化，降血糖、血脂，保护肾缺血再灌注损伤，保护肝损伤，调节免疫作用。近年研究发现山药多糖具有抗肿瘤、抗突变作用。赵国华等在药学学报2003，38 (1):37-41中报道用小鼠移植性实体瘤研究了山药多糖RDPS-1的体内抗肿瘤作用，结果表明，50mg/kg的RDPS-1对Lewis肺癌有显著地抑制作用，而对B16黑色素瘤没有明显作用，150mg/kg的RDPS-1对B16黑色素瘤和Lewis肺癌都有显著的抑制效果。山药是传统补益类中药，含有多种对人体有益的营养成分，对机体免疫功能调节存在广泛影响，有健脾养胃、补肺益肾、止泻利湿的功效，是养生健身，药食兼用的佳品。山药多糖虽有抗肿瘤作用，但其单独使用效果微弱，无法达到理想效果。
[0005]至今关于抗肝癌和抗肺癌的中药报道很多，将任意三种具有抗肝癌、肺癌效果的中药随意进行配比很难达到预想的疗效叠加效果。而本专利涉及的三种药物配伍后在抗肝癌、肺癌和提高生活质量，改善免疫功能方面的作用提高并非易得。如今，肝癌和肺癌均已
成为我国发病率前三的癌症，因此，抗肝癌和肺癌组合物疗效的提高，无疑会使更多患者受.、
【发明内容】
[0006]本发明的目 的在于提供一种抗肝癌和肺癌的中药组合物。
[0007]本发明的技术方案概述如下:
[0008]一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，是由质量比1:10~20:1~10的重楼总皂苷提取物、姜黄提取物和山药提取物组成。
[0009]重楼总皂苷提取物、姜黄提取物和山药提取物的质量比优选为1:15:5。
[0010]重楼总皂苷提取物用下述方法提取:将过4~5目筛的重楼粉用4~10质量倍的体积比60%~80%的乙醇水溶液浸泡I~3小时，加热回流提取2~3次，每次2~3小时，过滤，合并提取液并浓缩至重楼份质量的1/6~1/3，将浓缩液加入到相当于浓缩液体积50~100倍的体积比为1%~30%乙醇水溶液中，分散均匀，离心，收集上清液，将上清液经过大孔吸附树脂层析柱，干大孔吸附树脂的量按照与上述浓缩液的质量比为4~10:1计算，上柱流速为I~3BV/h，流出液弃去；然后用体积浓度为30%~40%乙醇水溶液洗脱，流速为I~2BV/h，洗脱2~4小时，弃去洗脱液；再以体积浓度为60%~80%乙醇水溶液洗脱，流速为2~5BV/h，洗脱3~5小时，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥后即可得到重楼总皂苷提取物。
[0011]大孔吸附树脂的型号优选为D101、AB-8、ADS-17、ADS-5、ADS-7、NKA-9 或 X-5。
[0012]姜黄提取物用下述方法提取:将姜黄粉碎成Scm3以下的小块，用6~10质量倍的蒸馏水浸泡I~2小时，加热回流提取2~3次，每次2~3小时，过滤，合并提取液，浓缩、干燥得姜黄提取物。
[0013]山药提取物用下述方法提取:将山药饮片，用4~8质量倍的蒸馏水浸泡I~2小时，加热回流提取2~3次，每次2~3小时，过滤，合并提取液，静置18~24小时，过滤，滤液浓缩至干燥，干燥物粉碎，过100~200目筛，即得山药提取物。[0014]本发明的优点:
[0015]经体外MTT法活性实验证明，本发明的中药组合物对LA795肺癌细胞株和H印G2肝癌细胞株均具有抑制生长作用，IC5tl分别可达20mg/mL(生药量)以下。体内实验证明，该中药组合物对小鼠T739肺癌转移小鼠，HepA肝癌和H22肝癌均具有显著抑制生长作用，肿瘤抑制率分别可达到53%、55%和57%。本发明的中药组合物抑瘤效果与组成组合物的组份给药相比具有协同增效作用，实验结果根据Webb氏分数乘积法计算，Webb氏分数乘积公式如下:(fa) h2 = l-[l-(fa)J [l_(fa)2]，(fa)。(fa) 2分别为两药的抑瘤率，(fa)。为计算的理论相加效应。如果合并用药的效应大于理论相加效应，则表示协同。结果显示组合物组的实测抑瘤值大于理论抑瘤值，证明三味药物组合具有协同增效作用。并且在提高小鼠免疫功能器官(脾指数、胸腺指数)方面与单味药给药组相比具有显著性差异(P < 0.05)。更重要的是，姜黄水提物与山药水提物单独抑制LA795肺癌细胞株、HepG2肝癌细胞株生长及抑制小鼠T739肺癌，HepA肝癌和H22肝癌的生长作用非常弱，而其与重楼总皂苷提取物组合后疗效提高、毒副作用明显降低，这一效果并非任意三味具有抗肝癌和肺癌作用的中药进行组合就能达到的效果。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0017]下面的实施 例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
[0018]实施例1
[0019]重楼总皂苷提取物用下述方法提取:
[0020]将过4目筛的重楼粉用8质量倍的体积比60%的乙醇水溶液浸泡1.5小时，加热回流提取2次，每次2小时，过滤，合并提取液并浓缩至重楼份质量的1/5，将浓缩液加入到相当于浓缩液体积80倍的体积比为15%乙醇水溶液中，分散均匀，离心，收集上清液，将上清液经过DlOl型大孔吸附树脂层析柱，干大孔吸附树脂的量按照与上述浓缩液的质量比为7:1计算，上柱流速为2BV/h，流出液弃去；然后用体积浓度为35%乙醇水溶液洗脱，流速为1.5BV/h,洗脱3小时，弃去洗脱液；再以体积浓度为70%乙醇水溶液洗脱，流速为4BV/h，洗脱4小时，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥后即可得到重楼总皂苷提取物。
[0021]实施例2
[0022]重楼总皂苷提取物用下述方法提取:
[0023]将过5目筛的重楼粉用4质量倍的体积比70%的乙醇水溶液浸泡I小时，加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液并浓缩至重楼份质量的1/6，将浓缩液加入到相当于浓缩液体积50倍的体积比为30%乙醇水溶液中，分散均匀，离心，收集上清液，将上清液经过ADS-17型大孔吸附树脂层析柱，干大孔吸附树脂的量按照与上述浓缩液的质量比为4:1计算，上柱流速为lBV/h，流出液弃去；然后用体积浓度为30%乙醇水溶液洗脱，流速为lBV/h，洗脱2小时，弃去洗脱液；再以体积浓度为60%乙醇水溶液洗脱，流速为2BV/h，洗脱3小时，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥后即可得到重楼总皂苷提取物。
[0024]实施例3
[0025]重楼总皂苷提取物用下述方法提取:[0026]将过5目筛的重楼粉用10质量倍的体积比80%的乙醇水溶液浸泡3小时，加热回流提取2次，每次3小时，过滤，合并提取液并浓缩至重楼份质量的1/3，将浓缩液加入到相当于浓缩液体积100倍的体积比为1%乙醇水溶液中，分散均匀，离心，收集上清液，将上清液经过AB-8型大孔吸附树脂层析柱，干大孔吸附树脂的量按照与上述浓缩液的质量比为10:1计算，上柱流速为3BV/h，流出液弃去；然后用体积浓度为40%乙醇水溶液洗脱，流速为2BV/h，洗脱4小时，弃去洗脱液；再以体积浓度为80%乙醇水溶液洗脱，流速为5BV/h，洗脱5小时，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥后即可得到重楼总皂苷提取物。
[0027]实验证明可用ADS-5、D101、ADS-7、NKA_9或X-5型大孔吸附树脂替代本实施例的AB-8型大孔吸附树脂，制备重楼总皂苷提取物。
[0028]实施例4
[0029]姜黄提取物用下述方法提取:将姜黄粉碎成Scm3以下的小块，用8质量倍的蒸馏水浸泡1.5小时，加热回流提取3次，每次3小时，过滤，合并提取液，浓缩、干燥得姜黄提取物。
[0030]实施例5
[0031]姜黄提取物用下述方法提取:将姜黄粉碎成Scm3以下的小块，用6质量倍的蒸馏水浸泡2小时，加 热回流提取2次，每次3小时，过滤，合并提取液，浓缩、干燥得姜黄提取物。
[0032]实施例6
[0033]姜黄提取物用下述方法提取:将姜黄粉碎成Scm3以下的小块，用10质量倍的蒸馏水浸泡I小时，加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液，浓缩、干燥得姜黄提取物。
[0034]实施例7
[0035]山药提取物用下述方法提取:将山药饮片，用6质量倍的蒸馏水浸泡1.5小时，加热回流提取3次，每次3小时，过滤，合并提取液，静置21小时，过滤，滤液浓缩至干燥，干燥物粉碎，过200目筛，即得山药提取物。
[0036]实施例8
[0037]山药提取物用下述方法提取:将山药饮片，用4质量倍的蒸馏水浸泡2小时，加热回流提取2次，每次3小时，过滤，合并提取液，静置18小时，过滤，滤液浓缩至干燥，干燥物粉碎，过200目筛，即得山药提取物。
[0038]实施例9
[0039]山药提取物用下述方法提取:将山药饮片，用8质量倍的蒸馏水浸泡I小时，加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液，静置24小时，过滤，滤液浓缩至干燥，干燥物粉碎，过100目筛，即得山药提取物。
[0040]实施例10
[0041]一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，由质量比1:10:1的重楼总皂苷提取物(实施例1制备)、姜黄提取物(实施例4制备)和山药提取物(实施例7制备)组成。
[0042]实施例11
[0043]一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，由质量比1:15:5的重楼总皂苷提取物(实施例2制备)、姜黄提取物(实施例5制备)和山药提取物(实施例8制备)组成。[0044]实施例12
[0045]一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，由质量比1:20:10的重楼总皂苷提取物(实施例3制备)、姜黄提取物(实施例6制备)和山药提取物(实施例9制备)组成。
[0046]实施例13
[0047]本发明的一种抗肝癌和肺癌的中药组合物的药效试验:
[0048]一.抗肿瘤活性试验方法
[0049]1.体外抗肿瘤活性试验
[0050]1.1细胞株及培养
[0051]BEL-7402肝癌细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100μ g/mL链霉素的RPM1-1640培养基中，于37°C，5%C02培养箱及饱和湿度条件下培养，4天传代一次。
[0052]HepG2肝癌细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的DMEM培养基中，于37°C，5%C02培养箱及饱和湿度条件下培养，4天传代一次。
[0053]小鼠肺腺癌LA795细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的RPM1-1640培养基中，于37°C，5%C02培养箱及饱和湿度条件下培养，4天传代一次。 [0054]人肺腺癌A549细胞株，培养于含10%灭活胎牛血清，100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的DMEM培养基中，于37°C，5%C02培养箱及饱和湿度条件下培养，4天传代一次。
[0055]1.2药物抗肿瘤活性测定
[0056]MTT法:将对数生长期细胞用胰酶消化后配制成浓度为3X IO4个/mL的细胞悬液，接种于96孔酶标板，每孔加200 μ L0 24h后换不含血清培养液使细胞同步化生长，每孔200 μ L。第三天向孔中加入受试药，即分别加入重楼总皂苷提取物(实施例1制备)水溶液，姜黄提取物(实施例4制备)水溶液，山药提取物(实施例7制备)水溶液和按实施例10、实施例11、实施例12制备的组合物水溶液；另设对照组:0.1% 二甲基亚砜(DMS0)，每孔加200 μ L0受试药每组分别设0.01,0.1,1,10,100,1000 μ g/mL六个浓度，每个浓度设8个平行孔，于37°C下培养24h后，每孔加无血清无酚红培养液新鲜配制的0.5mg/mL MTT100 μ L，继续培养4h，然后，每孔加IOOyL DMSO溶解MTT甲臜颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，在酶标仪上测定光密度值(0D)，实验重复三次，取平均值。以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，由OD值计算抑制率，公式为:细胞生长抑制率=(对照组OD值一实验组OD值)/对照组OD X 100%，并以药物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，并求得IC5tl (半数抑制率)，IC50 (生药量)=细胞生长抑制率为50%的药物浓度。结果见表1。
[0057]表1体外抗肿瘤活性试验结果
[0058]
【权利要求】
1.一种抗肝癌和肺癌的中药组合物,其特征是由质量比1:10~20:1~10的重楼总皂苷提取物、姜黄提取物和山药提取物组成。
2.根据权利要求1所述的一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，其特征在于所述重楼总皂苷提取物、姜黄提取物和山药提取物的质量比为1: 15:5。
3.根据权利要求1或2所述的一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，其特征在于所述重楼总皂苷提取物用下述方法提取:将过4~5目筛的重楼粉用4~10质量倍的体积比60%~80%的乙醇水溶液浸泡1~3小时，加热回流提取2~3次，每次2~3小时，过滤，合并提取液并浓缩至重楼份质量的1/6~1/3，将浓缩液加入到相当于浓缩液体积50~100倍的体积比为1%~30%乙醇水溶液中，分散均匀，离心，收集上清液，将上清液经过大孔吸附树脂层析柱，干大孔吸附树脂的量按照与上述浓缩液的质量比为4~10:1计算，上柱流速为1~3BV/h，流出液弃去；然后用体积浓度为30%~40%乙醇水溶液洗脱，流速为I~2BV/h，洗脱2~4小时，弃去洗脱液；再以体积浓度为60%~80%乙醇水溶液洗脱，流速为2~5BV/h，洗脱3~5小时，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥后即可得到重楼总皂苷提取物。
4.根据权利要求3所述的一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，其特征在于所述大孔吸附树脂的型号为 D101、AB-8、ADS-17、ADS-5、ADS-7、NKA-9 或 X-5。
5.根据权利要求1或2所述的一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，其特征在于所述姜黄提取物用下述方法提取:将姜黄粉碎成Scm3以下的小块，用6~10质量倍的蒸馏水浸泡I~2小时，加热回流提取2~3次，每次2~3小时，过滤，合并提取液，浓缩、干燥得姜黄提取物。
6.根据权利要求1或2所述的一种抗肝癌和肺癌的中药组合物，其特征在于所述山药提取物用下述方法提取:将山药饮片，用4~8质量倍的蒸馏水浸泡I~2小时，加热回流提取2~3次，每次2~3小时，过滤，合并提取液，静置18~24小时，过滤，滤液浓缩至干燥，干燥物粉碎，过100~200目筛，即得山药提取物。
【文档编号】A61K36/9066GK103933472SQ201410135948
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】高文远, 李红法, 刘振, 满淑丽, 张瑶 申请人:天津大学