野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。本发明中野马追黄酮中含有棕矢车菊素和泽兰叶黄素。将野马追黄酮部位制备成动物用药，对小鼠体内给药，测定诱导性急性肺损伤小鼠的肺湿/干重比，肺泡灌洗液(BALF)中一氧化氮(NO)和蛋白质含量；检测肺组织匀浆中髓过氧化酶(MPO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性；肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)含量；血清中补体C3和C3c含量；观测小鼠肺组织病理改变。结果表明，野马追黄酮部位具有抗急性肺损伤作用。
【专利说明】野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 急性肺损伤（acute lung in jury, ALI)是以弥漫性肺细胞损伤为基础，肺血 管损伤所致的肺水肿和肺组织炎性细胞浸润为其病理特征，临床主要表现为严重的低 氧血症、弥漫性肺浸润和肺水肿；部分患者最终将会形成急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS)，造成机体不可逆的急性呼吸功能衰竭和多器 官功能障碍，病死率高达30% -40% ;ALI发病机制错综复杂，ALI发病危险因素可以是 来自肺的直接损伤，也可以是肺外因素通过全身性炎性反应对肺产生的间接损伤。（参 JAL ：Baffert F, Le T, Thurston G, et al. Angiopoietin-ldecreases plasma leakage by reducing number and size of endothelial gaps in venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 290 (1) :H107-H118 ；Ware L B, Matthay M A. Medical progress-The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med,2000,342 (18):1334-1349 ； Matthay M A, Zimmerman G A, Esmon C, et al. Future research directions in acute lung injury: summary of a National Heart, Lung,and Blood Institute working group. Am J Respir Crit Care Med, 2003, 167 (7) : 1027-1035.)
[0003] 目前，国内外公认治疗ALI的方案：（1)去除病因；（2)在积极治疗原发病的基础 上，尽早机械通气（Mechanical ventilation，MV)来纠正缺氧和改善组织供氧；MV是ALI 经典治疗方式之一，能够纠正难治性缺氧，防治肺泡萎陷，对抗肺水肿，改善气体交换，减少 自主呼吸作功，防止呼吸肌疲劳；但仅能维持机体生理呼吸，尚不能完全解决ALI全部问 题；（3)药物治疗；临床上广泛使用肾上腺糖皮质激素、糖皮质激素、环磷酰胺、甲胺蝶呤等 治疗急性肺损伤，能减少毛细血管渗出和抑制肺纤维化的形成，使肺功能得到快速的改善； 但糖皮质激素等免疫抑制剂对急性肺损伤选择性差，长期应用会产生多种并发症和副作用 (参见：杨永涛，汪正清.补体抑制剂研究进展.中国新药杂志，2008, 17 (24) : 2093 ;徐晗， 章蕴毅，张建文，等.天然产物中的抗补体活性成分.中国天然药物，2007, 5 (5): 322.)。 因此，寻找选择性高、毒副作用小的治疗急性肺损伤药物具有重要的临床意义。
[0004] 野马追是菊科植物尖佩兰Eupatorium lindleyanum DC.的全草，江苏道地药材。 味苦、性平，归肝、脾经，具有化痰止咳、清热解毒、利尿消肿、降压的功能，用于感冒、咳嗽多 痰、头疼、扁桃体炎、菌痢和高血压（参见：国家中医药管理局，中华本草，上海：上海科技出 版社，1999:7,6876)。
[0005] 江舟、杨辉等研究表明野马追提取液对油酸型急性肺损伤大鼠具有保护作用，能 明显降低油酸型急性肺损伤大鼠的渗出细胞数、蛋白含量、肺系数及肺含水量和肺血管通 透性（参见：江舟，杨辉，何海霞，等.野马追对大鼠急性肺损伤保护作用研究，中国药 房，2007, 18(27) :2094 ;杨辉，周远大，何海霞.野马追对急性油酸性肺损伤大鼠肺血管 通透性的影响.中国药业，2010, 19(9): 5.)。但上述研究均是采用制药公司直接提供的野 马追提取液，野马追对急性肺损伤保护作用的活性成分不明确，作用机制不清楚。棕矢车菊 素和泽兰叶黄素均为黄酮类化合物，从野马追分离得到（参见吴双庆，孙群，褚纯隽，张健， 野马追化学成分，中国中药杂志，2012, 37 (7) :937)，棕矢车菊素和泽兰叶黄素对人结肠癌 HCT8细胞与人肺癌A549细胞具有抑制作用（参见：黄梦初，廖志新，陈道峰，沙生风毛菊的 化学成分及其细胞毒活性，中草药，2007, 38 (10) : 1463)。但棕矢车菊素、泽兰叶黄素是否具 有抗急性肺损伤作用，未见报道，本发明发现从野马追中制备的黄酮部位（棕矢车菊素与 泽兰叶黄素的组成）具有抗急性肺损伤的活性。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种野马追黄酮部位（EUP-FLA)在制备抗急性肺损伤药物中 的应用。
[0007] 本发明的技术方案是：本发明将野马追黄酮部位制备成动物用药，然后对小鼠体 内给药，测定急性肺损伤小鼠的肺湿/干重比，肺泡灌洗液（BALF)中一氧化氮（N0)和蛋白 质含量；检测肺组织匀浆中髓过氧化酶（ΜΡ0)和超氧化物歧化酶（S0D)活性；肺泡灌洗液 中肿瘤坏死因子-a (TNF- α )、白介素-6 (IL-6)和白介素-1 β (IL-1 β )含量；血清中补体 C3和C3c含量；观测小鼠肺组织病理改变。小鼠急性肺损伤实验结果表明，野马追黄酮部位 可以减轻小鼠肺部水肿症状，降低肺泡灌洗液中一氧化氮（N0)和蛋白质的含量，显著地增 强了小鼠肺组织内超氧化物歧化酶（S0D)的活性，抑制髓过氧化酶（ΜΡ0)的活性，降低了肿 瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL_6)和白介素_1β (IL-Ιβ)的含量，减少血清中补 体C3和补体片段C3c的含量并改善补体片段C3c在肺组织的沉积，对小鼠的肺组织、肺细 胞、毛细血管均具有保护作用。实验结果确定，野马追中黄酮部位具有抗急性肺损伤作用。
[0008] 本发明中野马追黄酮部位制备方法为：取野马追干燥全草，切段2?3cm，加8? 15倍体积的体积分数为60 %?95%乙醇水溶液，回流提取1?3小时，重复1?3次， 40°C?60°C减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物；将该提取物溶于水中，制备成浓度为 0. 5?lg/ml的溶液，经弱极性大孔吸附树脂吸附，先以水洗脱除去大分子化合物，然后用 体积分数为90%?95%乙醇水溶液洗脱，40°C?60°C减压回收溶剂，得大孔树脂部位；所 得大孔树脂部位经0DS反相硅胶色谱柱吸附，先以体积分数为50 %甲醇水溶液洗脱，然后 用70%?75%甲醇水溶液洗脱，40°C?60°C减压回收溶剂后，再经30?60目聚酰胺色谱 柱吸附，先以体积分数为70%?75%乙醇水溶液洗脱，后用95%?100%乙醇洗脱，40°C? 60°C减压回收溶剂，得野马追黄酮部位。
[0009] 进一步，优选的，所述弱极性大孔吸附树脂为AB-8、D101、HPD-100、HPD-200A、 HPD-200B、HPD-300、HPD-700、HPD-722 大孔吸附树脂中的一种。
[0010] 更进一步，优选的，所述0DS反相硅胶色谱柱为DAISOGEL 0DS反相硅胶填料粒径 50?70um、Cosmsil 0DS反相娃胶填料粒径50?70um、YMC0DS_A反相娃胶填料粒径50? 70um中的一种。
[0011] 更进一步，优选的，所述水与大孔吸附树脂体积比为8?15:1 ;所述90%?95% 乙醇水溶液与大孔吸附树脂体积比为8?15:1 ;所述反相硅胶色谱柱柱体积与所得大孔树 脂部位质量比为20?30:1 ;所述50%甲醇水溶液和70 %?75%甲醇水溶液与反相硅胶色 谱柱的体积比均为5?8:1 ;所述聚酰胺色谱柱柱体积与吸附样品的质量比20?30:1 ;所 述70%?75%乙醇水溶液和95%?100%乙醇与聚酰胺色谱柱的体积比均为4?10:1。
[0012] 经高效液相色谱分析得出，本发明野马追黄酮部位含有棕矢车菊素和泽兰叶黄素 成分。
[0013] 本发明的优点是为抗急性肺损伤提供了一种新的药物来源。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
[0015] 图1为实施例1中样品1和2野马追黄酮部位高效液相色谱图的对比图
[0016] 其中1 (a)，1 (b)分别对应为样品1、样品2的色谱图；
[0017] 图2为实施例1对照品泽兰叶黄素的高效液相色谱图；
[0018] 图3为实施例1对照品棕矢车菊素的高效液相色谱图；
[0019] 图4为实施例2各实验组肺湿干重比W/D ratio的对比；
[0020] 图5为实施例2各实验组肺泡灌洗液中一氧化氮（N0)含量对比；
[0021] 图6为实施例2各实验组肺泡灌洗液中总蛋白含量的对比；
[0022] 图7为实施例2各实验组肺泡灌洗液中炎症因子TNF- α水平的对比；
[0023] 图8为实施例2各实验组肺泡灌洗液中炎症因子IL-6水平的对比；
[0024] 图9为实施例2各实验组肺泡灌洗液中炎症因子IL-1 β水平的对比；
[0025] 图10为实施例2各实验组肺组织中ΜΡ0的活性对比；
[0026] 图11为实施例2各实验组肺组织中S0D的活性对比；
[0027] 图12为实施例2各实验组血清中C3含量对比；
[0028] 图13为实施例2各实验组血清中C3c含量对比；
[0029] 其中图4-13中，对应的Control为空白组，EUP-FLA为对照组，LPS为模型组， LPS+EUP-FLA组为不同剂量的药物组，LPS+DXM为阳性组；
[0030] 图14为实施例2各实验组肺组织H&E染色后的切面图（X400)的对比图；
[0031] 图15为实施例2各实验组肺组织C3c沉积免疫组化的切面图（X400)的对比图；
[0032] 图16为实施例3各实验组肺湿干重比W/D ratio的对比；
[0033] 图17为实施例3各实验组肺泡灌洗液中总蛋白含量的对比；
[0034] 图18为实施例3各实验组肺泡灌洗液中炎症因子TNF- α水平的对比；
[0035] 图19为实施例3各实验组血清中补体C3含量的对比；
[0036] 图20为实施例3各实验组血清中补体片段C3c含量的对比；
[0037] 其中图16-20中，对应的Control为空白组，LPS为模型组，EtOH为野马追乙醇提 取物组，FLA为野马追黄酮部位组，LPS+DXM为阳性组；
【具体实施方式】
[0038] 实施例1 :
[0039] 野马追黄酮部位（EUP-FLA)的制备及活性成分的检测
[0040] (1)野马追黄酮部位（EUP-FLA)的制备
[0041] 样品1 :称取300g野马追干燥全草，切段2?3cm，加10倍体积的体积分数为80% 乙醇水溶液，回流提取2小时，重复2次，40°C减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物45g，将该 乙醇提取物溶于约90ml水中，经D101大孔吸附树脂500ml吸附，先以5000ml水洗脱除去 大分子化合物，后用5000ml体积分数为95%乙醇水溶液洗脱，减压回收溶剂，得17g大孔 树脂部位；所得大孔树脂部位经350mlYMC0DS-A反相硅胶填料粒径60um反相硅胶色谱柱吸 附，先以1750ml体积分数为50%甲醇水溶液洗脱，然后1750ml70%甲醇水溶液洗脱，40°C 减压回收溶剂，得6g提取物，该提取物再经150ml30?60目聚酰胺色谱柱吸附，先以600ml 体积分数为70%乙醇水溶液洗脱，后用600ml95%乙醇洗脱，40°C减压回收溶剂，得野马追 黄酮部位（EUP-FLA)O. 8g。
[0042] 样品2 :称取1000g野马追干燥全草，切段2?3cm，加15倍体积的体积分数为 80 %乙醇水溶液，回流提取2小时，重复2次，60°C减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物 158g，溶于约150ml水中，经1800ml AB-8大孔吸附树脂吸附，先以20000ml水洗脱除去大 分子化合物，后用20000ml体积分数95%乙醇水溶液洗脱，60°C减压回收溶剂，得61g大孔 树脂部位；所得大孔树脂部位经1500ml Cosmsil 0DS反相娃胶填料粒径70um反相娃胶色谱 柱吸附，以10000ml体积分数为50%甲醇水溶液洗脱，然后10000ml70%甲醇水溶液洗脱， 60°C减压回收溶剂，得20g提取物，该提取物再经600ml30?60目聚酰胺色谱柱吸附，先以 4000ml70%乙醇水溶液洗脱，后用4000mll00%乙醇洗脱，60°C减压回收溶剂，得野马追黄 酮部位（EUP-FLA)2.8g。
[0043] (2)野马追黄酮部位（EUP-FLA)活性成分检测
[0044] 本实施例采用高效液相色谱分析法测定其成分。高效液相色谱仪 (Agilentl260Infinity，美国安捷伦公司），其高效液相色谱条件为：流动相A为乙腈（含 〇. 1%甲酸）；流动相B为水（含0. 1%甲酸）；流动相条件：见表1;色谱柱：YMC-PACK 0DS-A^4. 6mmX250mm，5 μ m);柱温：28 °C ;检测波长：365nm ;进样量：20 μ 1 ;流速： lml · mirT1。
[0045] 表1HPLC色谱分析条件
[0046]
【权利要求】
1. 一种野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述野马追黄酮部位是指含棕矢车菊素 和泽兰叶黄素的野马追黄酮部位。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述野马追黄酮部位的制备方法为：取野 马追干燥全草，切段2?3cm，加8?15倍体积的体积分数为60 %?95%乙醇水溶液，回 流提取1?3小时，重复1?3次，40°C?60°C减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物；将该 提取物溶于水中，制备成浓度为〇. 5?lg/ml的溶液，经弱极性大孔吸附树脂吸附，先以水 洗脱除去大分子化合物，然后用体积分数为90%?95%乙醇水溶液洗脱，40°C?60°C减压 回收溶剂得大孔树脂部位；所得大孔树脂部位经ODS反相硅胶色谱柱吸附，先以体积分数 为50%甲醇水溶液洗脱，然后用70%?75 %甲醇水溶液洗脱，40°C?60°C减压回收溶剂 后，再经30?60目聚酰胺色谱柱吸附，先以体积分数为70 %?75 %乙醇水溶液洗脱，后用 95%?100%乙醇洗脱，40°C?60°C减压回收溶剂，得野马追黄酮部位。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述弱极性大孔吸附树脂为AB-8、D101、 HPD-100、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-700、HPD-722 大孔吸附树脂中的一种。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述ODS反相硅胶色谱柱为DAISOGEL ODS 反相娃胶填料粒径50?70um、Cosmsil ODS反相娃胶填料粒径50?70um、YMCODS-A反相 娃胶填料粒径50?70um中的一种。
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水与弱极性大孔吸附树脂体积比为 8?15:1 ;所述90 %?95%乙醇水溶液与大孔吸附树脂体积比为8?15:1 ;所述0DS反 相硅胶色谱柱柱体积与所得大孔树脂部位质量比为20?30:1 ;所述50%甲醇水溶液和 70%?75%甲醇水溶液与0DS反相硅胶色谱柱的体积比均为5?8:1 ;所述聚酰胺色谱柱 柱体积与吸附样品的质量比为20?30:1 ;所述70%?75%乙醇水溶液及95%?100%乙 醇与聚酰胺色谱柱体积比均为4?10:1。
【文档编号】A61K36/28GK104042658SQ201410222843
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】张健, 褚纯隽, 任慧玲, 严彪, 李贺然, 陈韶华, 陈晶磊 申请人:苏州大学