一种Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药及其胶束制剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药，由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(Pluronics)与紫杉醇通过酯键键合而成。该前药在水中可自组装形成以紫杉醇为疏水内核，Pluronics为亲水外壳的胶束，不仅提高了紫杉醇药物在制剂中的含量，解决了紫杉烷类药物在水中的溶解度低的问题，而且最终制剂不含增溶剂和有机溶剂，增加了用药的安全性。也可以在Pluronics端羟基上连接主动靶向因子使之具主动靶向功能。本发明克服了现有紫杉醇注射剂水溶性差和过敏反应严重等缺点。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药及其胶束制剂，以及它们 的制备方法，属于医药化工【技术领域】。 -种PIuronics-紫杉醇两亲性大分子前药及其胶束制剂
【背景技术】
[0002] 紫杉醇（Paclitaxel，PTX)最早是从太平洋红豆杉的树皮中提取的一种四环二萜 类化合物，是抗癌的首选药物之一，化学结构见图1。紫杉醇抗肿瘤的机制为：在细胞有丝 分裂期增加微管二聚体的数量和聚合速度，促进微管的聚合，同时抑制胞质微管的解聚，从 而抑制细胞有丝分裂，使癌细胞停止在G2期和Μ期，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。目前， 紫杉醇是临床上治疗卵巢癌和乳腺癌的首选药物，治疗指数高。此外，它对肺癌、脑癌、非小 细胞肺癌、直肠癌等亦有良好的疗效。
[0003] 紫杉醇抗癌疗效良好，但是一些不良反应限制了其临床应用，包括水溶性差、半衰 期短和体内非特异性分布等。目前上市的紫杉醇制剂有两种：紫杉醇注射液（泰素?)和紫 杉醇白蛋白纳米粒(Abraxane?)注射剂。泰素?是以聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇（体积比为 1:1)作为溶剂，溶解紫杉醇制备而得注射液，用于静脉滴注给药。但是此载体系统会引发 一系列的不良反应，如过敏反应，中性粒细胞减少症，骨髓抑制等，给药前需要进行脱敏处 理等，过程繁琐。紫杉醇白蛋白纳米粒注射剂已经上市，虽然此纳米给药系统具有众多的优 势，然而Abr ax￡me_x_价格昂贵，增加了患者的经济负担。因此，开发新的低毒给药载体系统 成为研究的趋势。目前研究者对紫杉醇载体系统的研究主要基于以下两方面：紫杉醇给药 系统载体选择和主动靶向性研究，以增加药物的主动靶向性，使药物在肿瘤部位达到最大 蓄积，增加肿瘤的杀伤效力，同时降低对周围正常细胞的杀伤毒性。
[0004] 近年来，聚合物键合药的研究与开发引起了广泛关注。所谓"聚合物键合药"也称 为聚合物前药，是指将药物分子共价连接到高分子聚合物上，其在体内生理条件下，药物分 子从高分子聚合物上解离出来，发挥疗效。难溶性药物如紫杉醇和多西他赛与两亲性高分 子聚合物键合后，仍保持两亲性，在水性介质中能自组装为纳米胶束，药物被保护于胶束内 核。由于药物共价结合于聚合物上，避免了因动力学上的不稳定造成的药物突释，从而提高 药物的生物利用度，同时降低药物的毒副作用。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，为克服现有技术的不足，本发明提供了一种Pluronics与紫 杉醇共价连接制备而成的两亲性大分子前药，该前药由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯 (PE0-b-PP0-b-PE0,商品名为Pluronics，购自BASF公司）三嵌段共聚物与紫杉醇通过酯键 键合而成，其也能够在Pluronics端轻基上连接主动祀向因子使之具主动祀向功能。该前 药在水中可自组装形成以紫杉醇为疏水内核，Pluronics为亲水外壳的胶束，不仅提高了紫 杉醇药物在制剂中的含量，解决了紫杉烷类药物在水中的溶解度低的问题，而且最终制剂 不含增溶剂和有机溶剂，增加了用药的安全性。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药，是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯 (PE0-b-PP0-b-PE0,商品名为Pluronics，购自BASF公司）三嵌段共聚物与紫杉醇通过酯键 键合而成。其也能够在Pluronics端轻基上连接主动祀向因子使之具主动祀向功能。
[0008] 所述聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（Pluronics)的化学结构如下：
[0009] 其中，η为1?100的整数，m为15?100的整数。
[0010] 所述主动靶向因子，是指能与人体内的特定正常或病变组织、器官、细胞或细胞内 特定部位产生特异性结合、以氨基酸为基本单位的物质，包括但不限于NGR、RGD等多肽类、 叶酸等蛋白质类以及VEGFR2等抗体蛋白质类物质。
[0011] 所述Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)将Pluronics的端羟基转换为端羧基或将紫杉醇的2'或7位羟基转换为羧 基：
[0013] 在催化剂存在下，在有机溶剂中，将Pluronics或紫杉醇与酸酐在室温下进行酯 化反应，获得含有端羧基的Pluronics或羧基修饰的紫杉醇。
[0014] 所述催化剂，包括但不限于吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶、N-羟基硫代琥珀酰亚 胺（NHS)等，单独或混合使用，其用量是Pluronics或紫杉醇的羟基摩尔数的0.5?2倍。
[0015] 所述有机溶剂，包括但不限于1，4-二氧六环、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、二甲基 亚砜或二甲基甲酰胺等溶剂，单独或混合使用。
[0016] 所述酸酐，包括但不限于丁二酸酐、马来酸酐或二羟基乙酸酐，其用量是 Pluronics的0· 5?1. 5倍，是紫杉醇摩尔数的1?2倍。
[0017] (2)Pluronics的端羧基与紫杉醇的2'或7位轻基发生酯化反应，或Pluronics的 端羟基与紫杉醇的羧基发生酯化反应，形成高分子紫杉醇前药：
[0018] 在有机溶剂中，在缩合剂和催化剂存在下，将Pluronics的端羧基与紫杉醇的2' 或7位轻基进行酯化反应，或Pluronics的端轻基与紫杉醇的羧基进行酯化反应，获得高分 子紫杉醇前药。
[0019] 所述有机溶剂，包括但不限于1，4-二氧六环、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、二甲基 亚砜或二甲基甲酰胺等溶剂，单独或混合使用。
[0020] 所述缩合剂，包括但不限于二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳 酰二亚胺或N，Ν'-二异丙基碳二亚胺等，单独或混合使用，其用量是Pluronics或紫杉醇的 羧基摩尔数的1?2倍。
[0021] 所述催化剂，包括但不限于吡啶、三乙胺或4-二甲氨基吡啶等，单独或混合使用， 其用量是Pluronics或紫杉醇的羧基摩尔数的0. 5?2倍。
[0022] 所述紫杉醇的用量是Pluronics聚合物摩尔数的0. 5?1. 5倍。
[0023] 所述羧基化的紫杉醇用量是Pluronics聚合物摩尔数的0. 5?1. 5倍。
[0024] 进一步地，所述步骤（1)中，反应完成后，首先用饱和NaHC03洗去未反应的酸酐， 〇. 1M的盐酸洗去催化剂；然后加入无水硫酸镁干燥过夜（8?12h)，干燥后的产物经硅胶柱 层析技术进行分离和纯化，得到白色的固体结晶物质即为羧基修饰的紫杉醇药物。
[0025] -种Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药胶束制剂，是由以下方法制备得到的： 采用物理方法处理Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药，即自组装形成Pluronics-紫杉 醇两亲性大分子前药胶束制剂。
[0026] 所述物理方法包括但不限于透析法、薄膜分散法、乳化溶剂-挥发法或纳米沉淀 法等方法。
[0027] 进一步地，向制得的胶束制剂中加入0· 5?20% (单位：mg/mL)的冻干保护剂，过 滤除菌，冷冻干燥除去水分，得到Pluronics-紫杉醇大分子前药冻干胶束制剂。
[0028] 所述冻干保护剂包括但不限于乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、葡聚 糖、白蛋白、山梨醇、果糖、右旋糖酐、氨基酸、氨基酸盐、磷酸盐或聚乙二醇等，单独或混合 使用。
[0029] 血管系统和基底膜是药物在体内运输的首要屏障。正常组织中的微血管内皮间 隙致密、结构完整，大分子和脂质颗粒不易透过血管壁。肿瘤组织的血管不同于正常组织， 表现为血管迅速增长，外膜细胞缺乏，基底膜变形，淋巴管道回流系统缺损，大量血管渗透 性调节剂生成，导致肿瘤血管对大分子物质的渗透性增加以及大分子物质滞留在肿瘤组织 的蓄积增加，这种肿瘤组织对大分子物质具有的选择性、高通透性和滞留性称为EPR效应 (enhanced permeability and retention effect)。本发明制备的 Pluronics-紫杉醇胶 束粒径为80?120nm，并且其具有亲水性外壳，可以延长药物在血液循环系统的循环时间， 因此可通过EPR效应被动靶向于肿瘤组织。此外，在将Pluronics的端羟基转换为端羧 基，或Pluronics的端羧基与紫杉醇的羟基发生酯化反应时，控制酸酐或紫杉醇的用量是 Pluronics聚合物摩尔数的0. 5?1. 5倍，使得Pluronics保留部分端轻基，用于连接主动 靶向因子，有望达到主动靶向递送药物的目的。
[0030] 本发明的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药及其胶束制剂，与现有的紫杉醇 药物制剂相比，优势如下：
[0031] (1)最终产品不含有机溶剂和增溶剂，由生物相容性好的Pluronics作为药物载 体，安全性好。
[0032] (2)化学连接法负载药物，载药量高。药物和载体通过共价键连接，药物的释放须 经过体内相关酶的作用，避免了因动力学上的不稳定造成的药物突释现象，提高了药物的 生物利用度，减小了药物的毒副作用。
[0033] (3)制备的胶束制剂粒径均勻，大小在80?120nm，可以通过EPR效应选择性的浓 集于肿瘤组织，因而可以增加紫杉醇的治疗指数。通过对其表面进行靶向因子的修饰，有望 获得肿瘤组织主动靶向的胶束制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1 :紫杉醇的化学结构式，图中，"2'"、"7"表示可酯化羟基的位置。
[0035] 图2 :Pluronics_紫杉醇两亲性大分子前药的合成路线示意图（以实施例1为 例）。
[0036] 图3 :Pluronics-紫杉醇结合物、紫杉醇和Pluronics聚合物的H-NMR谱图对照， 其中，（a)紫杉醇；(b)Pluronics聚合物；（c)Pluronics-紫杉醇。
[0037] 图4 :Plur〇nicS-紫杉醇胶束的外观图，其中，（a)紫杉醇原料药；(b) Pluronics-紫杉醇胶束；（c) Pluronics空白胶束。
[0038] 图5 :Pluronics_紫杉醇在水性介质中通过自组装形成的胶束的透射电镜照片。
[0039] 图6 :Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药胶束的粒径分布图。
[0040] 图7 :Pluronics-紫杉醇胶束的细胞毒性图（A549和B16细胞）。
[0041] 图8 :FITC荧光标记的Pluronics-紫杉醇和FA-Pluronics-紫杉醇胶束的细胞摄 取图（A549和B16细胞），其中，（a)B16细胞；(b)A549细胞。
[0042] 图9 :小鼠相对体重随时间变化曲线图。
【具体实施方式】
[0043] 下面实施例对本发明作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实 施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
[0044] 实施例1制备Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药及其胶束制剂（合成路线如 图2所示）
[0045] (1)在50mL的茄形瓶中，称取300mg紫杉醇溶于10mL无水二氯甲烷，依次加入丁 二酸酐（48mg)、4_二甲氨基吡啶（DMAP，30mg)，氮气保护下，室温搅拌24h。将二氯甲烷蒸 干除去，加入10mL乙酸乙酯，充分溶解，再加入10mL稀盐酸（质量浓度10. 5% )进行酸洗， 搅拌10min，萃取收集有机相，反复酸洗2次。含有产物的乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥过 夜（12h)，旋转蒸发浓缩，采用干法上样的方法，硅胶柱分离纯化产物，得到羧基修饰的紫杉 醇。
[0046] (2)在50mL的爺形瓶中，将羧基修饰的紫杉醇（100mg)溶于10mL无水二氯甲 烷，冰浴条件下，依次加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC) (34mg)、 DMAP(10.9mg)和Pluronic P123(500mg)，室温反应48h。透析48h，除去二氯甲烷，冷冻干 燥得到P123-PTX两亲性大分子前药固体。
[0047] (3)将叶酸（0· 03g)溶于10mL无水二甲基亚砜（DMS0)，依次加入N-羟基硫代 琥珀酰亚胺（NHS) (0. 32g)、1_乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC) (0. 53g)和 三乙胺（〇.2mL)，搅拌4h。称取P123-PTX(0.4g)，加入到烧瓶中，室温反应48h。将反应液 转移至MWC0 = 3500Da的透析袋中，在蒸馏水中透析48h，待DMS0除尽后，冷冻干燥得到 FA-P123-PTX产物固体。
[0048] (4)分别将100mg P123-PTX和FA-P123-PTX两亲性大分子前药冻干固体溶于2mL 四氢呋喃（THF)中，逐滴滴入剧烈搅拌的蒸馏水中，将所得混合溶液装入已处理的透析袋 (截留分子量为3500Da)中，置于500mL蒸馏水中，透析48h，每4h换一次水，除去THF，制备 得到P123-PTX和FA-P123-PTX胶束溶液。
[0049] 为了验证Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药的正确合成及其胶束制剂的形 成、靶向性、细胞毒性、制剂毒性。以实施例1为例，图2为Pluronics-紫杉醇两亲性大分 子前药的合成路线示意图；图3为Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药（步骤（3)所制备 的到的P123-PTX)的rfNMR结构验证图（与Pluronic P123原料（见图3b)比较，P123-PTX 结合物?-ΝΙ?谱（见图3c)中出现一系列新的吸收峰，其中较为特征的是紫杉醇苯环上的 多重峰（δ 7. 0-8. 0)和δ 8. 1 (d，2H)的峰较为特征，正好与紫杉醇的1H-NMR谱（见图3a) 相对应，可知紫杉醇成功连接到Pluronic P123上）。
[0050] 图4为Pluronics-紫杉醇胶束（步骤（4)所制备的到的P123-PTX胶束溶液）的 外观图，图中，a为紫杉醇原料药，是白色的混悬液；b是不载药的P123胶束溶液，由于粒径 只有20?30nm，状态为澄清透明；c为Pluronics-紫杉醇溶液，呈现澄清透明状态，显现蓝 色乳光。
[0051] 图5为Pluronics-紫杉醇胶束（步骤（4)所制备的到的P123-PTX胶束溶液）的 电镜形态图，图中显示，Pluronics-紫杉醇胶束为圆球状或类球状，大小比较均匀，分散良 好。
[0052] 图6为Pluronics-紫杉醇胶束（步骤（4)所制备的到的P123-PTX胶束溶液）的 粒径分布图，图中显示，粒径为（102. 63±7. 36)nm。
[0053] 图7为Pluronics-紫杉醇胶束（步骤（4)所制备的到的P123-PTX胶束溶液）的 细胞毒性图（A549和B16细胞为受试细胞），图中显示，随着紫杉醇的浓度增高，A549与B16 细胞的细胞抑制率均增加。实验方法：采用MTT法研究紫杉醇胶束的体外细胞毒性。将对 数生长期的A549和B16细胞系分别接种到96孔培养板中，密度大约4X 103个/孔，培养 24h后，不同浓度的P123-PTX胶束溶液。继续培养72h后，每孔加 MTT溶液后，采用酶标仪 测定每孔的吸收度值（A)。计算细胞生长抑制率和半数抑制率（IC50)。
[0054] 图8为FITC荧光标记的非靶向Pluronics-紫杉醇胶束（步骤（4)所制备的到 的P123-PTX胶束溶液）和叶酸靶向Pluronics-紫杉醇胶束（步骤（4)所制备的到的 FA-P123-PTX胶束溶液）在A549和B16细胞中的摄取，图中显示，在0至4小时内，随着孵育 时间延长，细胞对胶束的摄取增加，阳性率增大。在叶酸受体阳性的B16细胞中，叶酸修饰 可明显促进细胞对胶束的内吞。在3个时间点，与非靶向-FITC标记胶束相比，靶向-FITC 标记胶束其细胞内荧光阳性率均具有差异（P < 0.05)。在叶酸受体阴性的A549细胞中， 由于细胞表面表达的叶酸受体较少，细胞对两种胶束的摄取不依赖叶酸受体介导的内吞途 径，因此两种胶束在此细胞中的摄取率无显著性差异（P>〇. 05)。说明非靶向-FITC标记胶 束比靶向-FITC标记胶束在相同的孵育时间内对叶酸受体阳性细胞具有更好的细胞靶向 效率。
[0055] 图9为尾静脉注射Pluronics-紫杉醇胶束（步骤（4)所制备的到的P123-PTX胶 束溶液）（生理盐水和泰素 81作为对照）后，小鼠相对体重随时间变化曲线，图中显示，小鼠 相对体重变化曲线显示，与生理盐水给药组相比，Pluronics-紫杉醇胶束组的小鼠体重有 所降低，但泰素 81组小鼠体重降低比Pluronics-紫杉醇胶束组明显（P〈0. 01)。由于体重变 化可用于判断制剂的毒副作用，因此Pluronics-紫杉醇胶束的毒性作用远小于市售注射 液泰素'具有用于临床给药的价值。实验方法：采用18_22g的雌性昆明种小白鼠，随机分为 6组，每组8只，分别为生理盐水组（Normal saline，N.S.)、紫杉醇注射液泰素8组（TaxoP, 20mg PTX/kg)和P123-PTX组（P123-PTX micelles, 20mg PTX/kg)采用尾静脉注射给药，每 周给药一次，连续给药3周。给药后，每隔一天记录小鼠体重。
[0056] 实施例2
[0057] (1)在50mL的爺形瓶中，将2g Pluronic P123和34mg 丁二酸酐溶于15mL无水二 甲基甲酰胺中，然后依次加入〇. 〇72mL三乙胺（TEA)和0. 08g DMAP，室温反应24h。将反应 液装入已处理的透析袋（截留分子量为3500Da)中，置于500mL蒸馏水中，透析48h，每4h 换一次水，除去二甲基甲酰胺，冷冻干燥得到带端羧基的Pluronic P123固体产物。
[0058] (2)在50mL的爺形瓶中，将0· 5g带端羧基的Pluronic P123溶于无水二甲基亚 砜，待聚合物溶解后，在冰浴条件下，加入0. 〇36g二环己基碳二亚胺（DCC)、0. 023g DMAP和 〇. 〇71g紫杉醇，室温反应48h，滤掉反应过程中生成的沉淀，滤液装入已处理的透析袋（截 留分子量为3500Da)中，置于500mL蒸馏水中，透析72h，每4h换一次水，除去二甲基亚砜， 冷冻干燥得到P123-PTX两亲性大分子前药固体。
[0059] (3)称取150mg P123-PTX两亲性大分子前药，加入2mL乙腈，超声，充分溶解，在 37°C水浴，减压旋转蒸发，除尽乙腈，形成一层均匀薄膜，室温真空干燥过夜，除去残留有机 溶剂。37°C水浴加热lOmin，加入5mL同温度的生理盐水，室温搅拌水化2h，过0. 22 μ m微 孔滤膜，得到澄清的P123-PTX两亲性大分子前药胶束溶液。加入0. 2g甘露糖作为冻干保 护剂，分装于无菌西林瓶中，每支2mL，冷冻干燥，得到P123-PTX两亲性大分子前药胶束冻 干制剂，该冻干制剂加入2mL生理盐水经振摇，可于lmin内完全复溶，所得胶束溶液澄清透 明。
[0060] 实施例3
[0061] (1)在50mL的爺形瓶中，称取lOOmg紫杉醇溶于5mL无水THF，依次加入马来酸酐 (17mg)、DMAP (10mg)，氮气保护下，室温搅拌36h。将THF蒸干除去，加入15mL乙酸乙酯，充 分溶解，再加入20mL稀盐酸溶液进行酸洗，搅拌30min，萃取收集有机相，反复酸洗2次。含 有产物的乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥过夜，旋转蒸发浓缩，采用干法上样的方法，硅胶柱 分离纯化产物，得到羧基修饰的紫杉醇。
[0062] (2)在50mL的茄形瓶中，将羧基修饰的紫杉醇（0· 2g)溶于10mL无水1，4_二 氧六环，冰浴条件下，依次加入N，N' -二异丙基碳二亚胺（DIC) (0.056g)、DMAP(0.031g) 和Pluronic F68 (2. 065g)，室温反应48h。透析72h，除去1，4-二氧六环，冷冻干燥得到 F68-PTX两亲性大分子前药固体。
[0063] (3)将200mg F68-PTX两亲性大分子前药冻干固体溶于3mL THF中，逐滴滴入剧 烈搅拌的蒸馏水中，将所得混合溶液装入已处理的透析袋（截留分子量为3500Da)中，置于 500mL蒸馏水中，透析48h，每4h换一次水，除去THF，制备得到F68-PTX两亲性大分子前药 胶束溶液。
[0064] 实施例4
[0065] (1)在50mL的爺形瓶中，将lg Pluronic F127和10mg 丁二酸酐溶于15mL无水 1,4-二氧六环中，然后依次加入0. 033mL TEA和0. 029g DMAP，室温反应12h。将反应液装 入已处理的透析袋（截留分子量为3500Da)中，置于500mL蒸馈水中，透析48h，每4h换一 次水，除去1，4-二氧六环，冷冻干燥得到羧基修饰的Pluronic F127固体产物。
[0066] (2)在50mL的茄形瓶中，将0· 5g羧基修饰的Pluronic F127溶于10mL无水二甲 基甲酰胺，待聚合物溶解后，冷却到0°c，然后加入0. 023g EDC、0. 014g DMAP和0. 035g紫杉 醇，室温反应36h。反应液装入已处理的透析袋（截留分子量为3500Da)中，置于500mL蒸 馏水中，透析72h，每4h换一次水，除去二甲基甲酰胺，冷冻干燥得到Pluronic F127固体。
[0067] (3)称取300mg F127-PTX结合物溶于3mL丙酮中，逐滴滴入10mL蒸馏水中，室温 搅拌，直至完全除去丙酮，过〇. 22 μ m微孔滤膜，得到澄清的127-PTX两亲性大分子前药结 合物胶束溶液。
[0068] 实施例5
[0069] (1)在50mL的茄形瓶中，称取200mg紫杉醇溶于8mL无水二氯甲烷，依次加入丁二 酸酐（37mg)、4-二甲氨基吡啶（DMAP，45mg)，氮气保护下，室温搅拌36h。将二氯甲烷蒸干 除去，加入20mL乙酸乙酯，充分溶解，再加入10mL稀盐酸溶液进行酸洗，搅拌30min，萃取收 集有机相，反复酸洗2次。含有产物的乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥过夜，旋转蒸发浓缩， 采用干法上样的方法，硅胶柱分离纯化产物，得到羧基修饰的紫杉醇。
[0070] (2)在50mL的茄形瓶中，将羧基修饰的紫杉醇（0.2g)溶于10mL无水二氯甲烷， 冰浴条件下，依次加入 EDC (0· 084g)、DMAP (0· 054g)和 Pluronic P105 (1. 193g)，室温反应 48h。透析96h，除去二氯甲烷，冷冻干燥得到P105-PTX两亲性大分子前药固体。
[0071] (3)在50mL的茄形瓶中，将0.5g P105-PTX两亲性大分子前药和0.036g叶酸共溶 于5mL无水二甲基亚砜，冰浴条件下，加入依次加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS) (0. 32g)、 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC) (0. 53g)和三乙胺（0. 2mL)，避光，室温反 应48h。避光透析72h，除去二甲基亚砜，冷冻干燥得到叶酸-P105-PTX固体。
[0072] (4)将0. 5g叶酸-P105-PTX结合物冻干固体溶于5mL二甲基亚砜中，逐滴滴入剧 烈搅拌的蒸馏水中，将所得混合溶液装入已处理的透析袋（截留分子量为3500Da)中，置于 500mL蒸馏水中，透析96h，每4h换一次水，除去二甲基亚砜，制备得到叶酸-P105-PTX结合 物胶束溶液，制备过程要避光。
【权利要求】
1. 一种Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药，其特征在于：是由聚氧乙烯-聚氧丙 烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物与紫杉醇通过酯键键合而成。
2. 权利要求1所述的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药的制备方法，其特征在于： 包括以下步骤： (1) 将Pluronics的端羟基转换为端羧基或将紫杉醇的2'或7位羟基转换为羧基： 在催化剂存在下，在有机溶剂中，将Pluronics或紫杉醇与酸酐在室温下进行酯化反 应，获得含有端羧基的Pluronics或羧基修饰的紫杉醇； (2) Pluronics的端羧基与紫杉醇的2'或7位轻基发生酯化反应，或Pluronics的端轻 基与紫杉醇的羧基发生酯化反应，形成高分子紫杉醇前药： 在有机溶剂中，在缩合剂和催化剂存在下，将Pluronics的端羧基与紫杉醇的2'或7 位羟基进行酯化反应，或Pluronics的端羟基与紫杉醇的羧基进行酯化反应，获得高分子 紫杉醇前药。
3. 权利要求2所述的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药的制备方法，其特征在 于：所述步骤（1)、（2)中，催化剂选自吡啶、三乙胺、4-二甲氨基吡啶、N-羟基硫代琥珀酰 亚胺中的任一种或任意几种的组合，其用量是Pluronics或紫杉醇的羟基/羧基摩尔数的 0· 5?2倍。
4. 权利要求2所述的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药的制备方法，其特征在于： 所述步骤（1)、⑵中，有机溶剂选自1，4-二氧六环、二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、二甲基亚砜 或二甲基甲酰胺中的任一种或任意几种的组合。
5. 权利要求2所述的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药的制备方法，其特征在于： 所述步骤（1)中，酸酐选自丁二酸酐、马来酸酐或二羟基乙酸酐中的任一种或任意几种的 组合，其用量是Pluronics或紫杉醇的羟基摩尔数的1?2倍。
6. 权利要求2所述的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药的制备方法，其特征在于： 所述步骤（2)中，缩合剂选自二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳酰二亚 胺或N，Ν' -二异丙基碳二亚胺中的任一种或任意几种的组合，其用量是Pluronics或紫杉 醇的羧基摩尔数的1?2倍。
7. -种Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药胶束制剂，其特征在于：是由以下方法制 备得到的：采用物理方法处理权利要求1所述的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药，即 自组装形成Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药胶束制剂。
8. 根据权利要求7所述的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药胶束制剂，其特征在 于：所述物理方法为透析法、薄膜分散法、乳化溶剂-挥发法或纳米沉淀法。
9. 根据权利要求7或8所述的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药胶束制剂，其特征 在于：向制得的胶束制剂中加入〇. 5?20% (单位：mg/mL)的冻干保护剂，过滤除菌，冷冻 干燥除去水分，得到Pluronics-紫杉醇大分子前药冻干胶束制剂。
10. 根据权利要求9所述的Pluronics-紫杉醇两亲性大分子前药胶束制剂，其特征在 于：所述冻干保护剂选自乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、葡聚糖、白蛋白、山梨 醇、果糖、右旋糖酐、氨基酸、氨基酸盐、磷酸盐或聚乙二醇中的任一种或任意几种的组合。
【文档编号】A61K9/107GK104096237SQ201410345710
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】张娜, 李敏, 刘永军, 刘凤喜 申请人:山东大学