抗菌肽awrk6在制备治疗败血症药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗菌肽AWRK6在制备治疗败血症药物中的应用。抗菌肽AWRK6，分子量为2130.5，二级结构，其结构主要为α-螺旋，等电点为9.60，不稳定系数为-6.74，该肽在体内外以剂量依赖的方式中和内毒素，能显著抑制内毒素所诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的释放以及小鼠全血中IL-8的释放。动物实验表明，AWRK6能有效地保护肝脏免遭致死量LPS的攻击，能显著提高内毒素血症动物的生存率，具有很好的治疗效果。安全性评价表明，AWRK6对小鼠腹腔巨噬细胞无毒，高剂量的AWRK6对小鼠也无明显毒副作用。AWRK6具有开发为新一代治疗由内毒素引起的败血性休克的新生代抗感染药物。
【专利说明】抗菌肽AWRK6在制备治疗败血症药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于小肽药物应用领域，具体地涉及一种抗菌肽AWRK6在制备治疗败血性 休克药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 抗生素，被广泛用于治疗由细菌引起的感染，现今已经产生了很多副作用，如导 致了多重耐药菌的出现，更严重的是，抗生素抑杀细菌使细菌死亡的同时释放出大量内毒 素（LPS)，释放的内毒素可引起多种慢性呼吸道疾病，包括慢性阻塞性肺疾病，哮喘，过敏性 肺泡炎，也可产生内毒素休克，严重时导致死亡，仅在美国每年就有接近20万人死于败血 症，由革兰氏阴性菌感染所引发的败血症目前已成为世界医学领域的一大难题。
[0003] 内毒素多由细菌分裂、死亡或是抗生素治疗感染时释放出来，可作用于多种宿主 细胞如嗜中性类细胞、肥大细胞和内皮细胞，是败血症的主要致病因子。具体的作用机制为 内毒素与宿主血清蛋白（LPS结合蛋白）相互作用后激活单核细胞表面的LPS受体CD14， LPS-LBP-⑶14复合物通过与TLR4相互作用后开启细胞内相关信号通路，激活一系列转录 因子，包括ERK-l、C-Jun、NF-κB、CREB，诱导早期促炎因子（如TNF-α、IL-8、IL-lβ和 N0)释放，进而释放第二波促炎因子，如血小板激活因子、白三烯，这些炎症因子的过量表达 会引起组织损伤、凝血障碍、多器官功能障碍综合症（MODS)等，严重时导致败血症或急性 呼吸窘迫综合征，甚至危及病人的生命。因此，寻求新兴的能够阻断LPS对机体免疫系统刺 激的治剂已经成为医学界必要而迫切的任务。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于治疗由内毒素引起的败血性休克的新生代抗感 染治剂。
[0005] AWRK6 (SWVGKHGKKFGLKKHKKH)为东北林蛙抗菌肽，由18个氨基酸构成，分子量为 2130. 5,利用HNN法预测其为二级结构，其结构主要为a -螺旋，等电点为9. 60,不稳定系数 为-6. 74,是具有较好生物稳定性的阳离子抗菌肽。
[0006] 本发明提供的抗菌肽AWRK6可按本领域多肽的常规固相技术合成，小肽序列 为SWVGKHGKKFGLKKHKKH，并采用高效液相色谱和质谱技术，鉴定小肽序列和纯度（大于 98 % )，冷冻干燥得到白色粉末状抗菌肽AWRK6。）
[0007] 本发明，通过一系列的体内外实验对AWRK6抗内毒素活性进行评估，并进一步对 其安全性进行评价，为其开发为新一代治疗由内毒素引起的败血性休克的新生代抗感染治 剂提供理论基础和实验依据。
[0008] AWRK6具备良好的中和LPS的结构特征。结果表明，AWRK6在体内外均表现出了良 好的中和内毒素活性，并能以剂量依赖的方式显著抑制由内毒素所诱导的炎症因子TNF-a 和IL-8的释放。此外，动物实验表明，AWRK6能有效地保护肝脏免遭致死量LPS的攻击，能 显著提高内毒素血症动物的生存率，起到很好的治疗效果，AWRK6对小鼠腹腔巨噬细胞无 毒，高剂量的AWRK6对小鼠也未表现出任何毒副作用。
[0009] 通过本发明，表明了抗菌肽AWRK6可在制备治疗败血性休克药物中的应用。特别 是用于制备治疗由内毒素引起的败血性休克药物中的应用。抗菌肽AWRK6的有效剂量为 2-10mg/kg/ 天。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1 :AWRK6体外中和内毒素活性；
[0011] 图中，**表示与只加 LPS组相比表现出极显著差异（p〈0. 01)，PMB:多粘菌素 B。
[0012] 图2 :AWRK6抑制LPS所诱导的全血中IL-8的释放；
[0013] 图中，*表示与只加 LPS组相比差异显著（p〈0. 05)，**表示与只加 LPS组相比差 异极显著（P〈〇. 01)，PMB :多粘菌素 B。
[0014] 图3 :AWRK6抑制LPS所诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF- α的释放；
[0015] 图中，**表示与只加 LPS组相比差异极显著（ρ〈0. 01)，ΡΜΒ :多粘菌素 Β。
[0016] 图4 :AWRK6对小鼠腹腔巨噬细胞毒性分析。
[0017] 图5 :不同浓度AWRK6治疗后内毒素血症小鼠生存曲线图
[0018] 图中，*表示与内毒素血症组相比生存差异显著（p〈0. 05)，**表示与内毒素血症 组相比生存差异极显著（Ρ〈〇· 01)，cum survival (1.0)表示存活率为100%。
[0019] 图6 :AWRK6和PMB治疗组小鼠生存曲线图；
[0020] 图中，*表示与内毒素血症组相比生存差异显著（p〈0. 05)，**表示与内毒素血症 组相比生存差异极显著（P〈〇. 01)。
[0021] 图7 :AWRK6治疗内毒素血症小鼠时间依赖性结果。
[0022] 图8 :AWRK6中和内毒素血症小鼠血清中内毒素的结果图；
[0023] 图中，**表示与内毒素血症小鼠组相比差异极显著（p〈0. 01)。
[0024] 图9 :AWRK6抑制内毒素血症小鼠血清中LPS所诱导的IL-8的产生；
[0025] 图中，**表示与内毒素血症小鼠组相比差异极显著（p〈0. 01)。
[0026] 图10 :AWRK6抑制内毒素血症小鼠血清中LPS所诱导的TNF- α的产生；
[0027] 图中，**表示与内毒素血症小鼠组相比差异极显著（ρ〈0. 01)。
[0028] 图11 :AWRK6保护肝脏免遭致死量LPS的损伤的组织学结果；
[0029] 图中，A.阴性对照；B. LPS攻击小鼠24小时肝脏；C. AWRK6治疗组小鼠24小时肝 脏；D. PMB治疗组小鼠24小时肝脏；E. AWRK6治疗96小时肝脏；F. PMB治疗组小鼠96小时 肝脏。
[0030] 图12 :高剂量的AWRK6(50mg/kg)处理小鼠后的生存曲线图。
【具体实施方式】
[0031] 一、AWRK6体外中和LPS活性检测
[0032] 方法：通过EliSa实验进行检测，具体步骤为：10ul浓度梯度AWRK6(终浓度5，10， 20ug/ml)在96孔板中与10ul LPS(终浓度0. 2ng/ml)在37°C孵育30min，多粘菌素 B(PMB) 作为阳性对照，残余的LPS含量通过Elisa检测。
[0033] 抗菌肽AWRK6体外中和内毒素（LPS)活性检测结果如图1所示。从图1可见，AWRK6 和阳性对照组PMB在体外都以剂量依赖的方式显著降低内毒素含量，与阴性对照相比差异 极显著（p〈〇.〇l)。说明抗菌肽AWRK6具有体外中和内毒素活性。
[0034] 二、LPS诱导的全血中IL-8水平检测
[0035] 方法：通过心脏穿刺将血液收集到肝素化采血管中，使25ul LPS (终浓度5ng/ml) 在96孔板中与25ulAWRK6 (终浓度5,10, 20ug/ml)在37°C中预孵育30min，将200ul血液 加入96孔板中，血液与LPS混合物在37°C中孵育24h，1200rmp8min，取10ul上层血浆通过 Elisa分析炎症因子IL-8水平。
[0036] 抗菌肽AWRK6抑制LPS所诱导的全血中IL-8的释放结果如图2所示。从图2可 见，当细胞用AWRK6 (或PMB)和LPS共同孵育，与只用LPS刺激组相比，IL-8分泌量显著降 低，且IL-8的降低与药物剂量呈正相关，与PMB相比，在一定浓度下AWRK6对LPS所诱导的 IL-8释放表现出更强的抑制活性。
[0037] 三、LPS诱导的腹腔巨噬细胞TNF-α水平检测
[0038] 方法：小鼠摘眼球放血，75%酒精浸泡3min，腹腔注入4mll640培养基（含 双抗），轻柔腹部2min，吸出腹腔液于10ml离心管中，再洗两次腹腔，收集到的腹腔液 1200rmpl0min，弃上清，用1640培养基（含双抗）重悬，1200rmpl0min，弃上清，加1640培 养基（含10%胎牛血清+双抗），悬浮，计数，以2X 105细胞/孔于96孔板培养过夜，弃上 清，PBS洗一次，加入160ul新鲜1640完全培养基，加入浓度梯度AWRK6 (终浓度5,10, 20ug/ ml)和LPS(终浓度5ng/ml)在37°C中作用6h，相应浓度的PMB作为阳性对照，取10ul上 清Elisa检测TNF-a含量。
[0039] 抗菌肽AWRK6抑制LPS所诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF- a的释放的结果如图3 所示，从图3可见，当细胞用AWRK6(或PMB)和LPS共同孵育，与只用LPS刺激相比，TNF-a 分泌量显著降低，且TNF-a的降低与药物剂量呈正相关，与PMB相比，在相同浓度下AWRK6 对LPS所诱导的TNF- a释放表现出更强的抑制活性。
[0040] 四、细胞毒性分析
[0041] 方法：通过细胞增殖试剂盒_8 (CCK-8)检测AWRK6对正常小鼠腹腔巨噬细胞是否 有毒副作用，小鼠腹腔巨噬细胞以2X 104个/孔铺进96孔板，培养3小时后，加药物刺激 (终浓度5, 10, 20ug/ml)，有细胞无药物组作为对照，无细胞无药物组作为空白对照，作用4 小时后，每孔加10ulCCK-8,再孵育3小时后，酶标仪450nm检测吸光度。细胞活率=[(A-A 空白）/ (A 对照-A 空白）]X 100 (η = 4)。
[0042] 抗菌肽AWRK6对小鼠腹腔巨噬细胞毒性分析结果如图4所示，从图4可见，在中和 内毒素实验中所使用到的AWRK6和ΡΜΒ浓度，经检测对小鼠腹腔巨噬细胞均无毒性，因为细 胞活率均高于90%。更重要的是，AWRK6不仅对小鼠腹腔巨噬细胞无毒，而且在一定程度上 促进了细胞的增殖，因为细胞活率均超过100%，且以剂量依赖的方式增加。
[0043] 以上四个实验结果表明，AWRK6在体外以剂量依赖的方式中和内毒素，能显著抑制 内毒素所诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-a的释放以及小鼠全血中IL-8的释放，且AWRK6 对小鼠腹腔巨噬细胞并无毒副作用。
[0044] 五、抗菌肽AWRK6体内抗败血症活性评估
[0045] (1)齐?量依赖性分析
[0046] 为了检测AWRK6能否在体内清除内毒素，构建小鼠内毒素血症模型。昆明小鼠，平 均体重20 ± 2g，购自沈阳医学院实验动物中心并在20 ± 2°C条件下饲养，小鼠自由摄食、饮 水。实验前先让小鼠适应5天环境。每组10只小鼠，给小鼠注射0. 5ml的LPS (50mg/Kg)， 在无治疗的情况下，小鼠在48小时内死亡率为100%，实验组同时注射0.5ml的浓度抗菌 肽AWRK6 (10mg/Kg，5mg/Kg，2. 5mg/Kg)，每8小时记录下小鼠的存活状况，共持续168小时。
[0047] 结果如图5所示，从图5可见，LPS攻击小鼠在无治疗情况下48小时内全部死亡， 相比之下，AWRK6治疗后存活率显著增加，经2. 5,5,10mg/kg AWRK6治疗七天后内毒素血症 小鼠存活率分别为20 %，50 %，90 %。这些数据表明AWRK6在体内可以有效保护小鼠免遭致 死量LPS攻击。
[0048] 从剂量依赖性结果可知，10mg/Kg AWRK6治疗效果最佳，治愈率达90%，且小鼠的 基本生存活动完全恢复，进食及运动均恢复正常，故选用该浓度进行之后的实验。
[0049] (2) AWRK6治疗内毒素血症活性与PMB相比较
[0050] 给小鼠注射0· 5ml致死量的的LPS(50mg/Kg)，同时注射0· 5ml的PMB(2. 6mg/Kg)， 每8小时记录下小鼠的存活状况，共持续168小时，并对该试验结果与AWRK6进行比较。
[0051] 结果如图6所示，从图6可见，内毒素血症小鼠接受相应浓度AWRK6和PMB治疗七 天后，存活率分别为90%和60%，与LPS组相比均表现出显著性差异。
[0052] (3)时间依赖性分析
[0053] 每组10只小鼠，分别在注射致死量LPS(50mg/Kg) 1小时前、同时及1小时后注射 抗菌肽AWRK6 (10mg/Kg)，每8小时观察各组小鼠的存活状态，共持续168小时。
[0054] 结果如图7所示，从图7可见，不同注射时间的各组间小鼠存活率并无显著差异， 即治疗效果与给药时间并无显著差异。
[0055] ⑷AWRK6对内毒素血症动物血液中内毒素清除作用分析
[0056] 每组10只小鼠，实验组腹腔注射0. 5ml LPS(50mg/kg)，治疗组分别同时注射 AWRK (10mg/kg)和PMB (2. 6mg/kg)，只注射生理盐水组作为空白对照。注射LPS60min后小鼠 摘眼球取血，3000 X g4°C lOmin收集血清，收集的血清样本于-20°C中保存直至通过Elisa 检测血液中LPS含量。
[0057] 结果如图8所示，从图8可见，AWRK6和PMB均能显著降低内毒素血症小鼠血清中 内毒素含量，且在相同浓度下，AWRK6表现出更强的中和内毒素活性。
[0058] (5) AWRK6对LPS所诱导的小鼠血液中TNF- α和IL-8释放量的影响
[0059] 每组10只小鼠，实验组腹腔注射0· 5ml LPS(20mg/kg)，治疗组分别同时注射 AWRK(10mg/kg)和PMB(2.6mg/kg)，只注射生理盐水组作为空白对照。由于注射LPS大 约一小时后血液中TNF-α和IL-8含量达到峰值，因而收集注射LPS90min的小鼠血， 3000 X g4°C lOmin收集血清，收集的血清样本于-20°C中保存直至通过Elisa检测血液中 TNF-α 和 IL-8。
[0060] 结果如图9和图10所示，从图9和图10可见，AWRK6可以有效抑制IL-8和TNF-a 释放，与对空白照组差异极显著，且与阳性对照PMB相比，在相同浓度下AWRK6在降低IL-8 和TNF-a含量上表现出更强的活性。
[0061] (6)组织学分析
[0062] 每组3只小鼠，实验组腹腔注射0. 5ml LPS (50mg/kg)，治疗组分别同时注射 AWRK(10mg/kg)和PMB(2.6mg/kg)，只注射生理盐水组作为空白对照。存活的小鼠分别在 24,96小时眼球放血，取肝脏，pH7. 4的PBS清洗后放到10%中性福尔马林中室温下固定24 小时以上。组织样本用浓度梯度的酒精脱水（75% ,85% ,95%，100% andlOO% )，二甲苯 透明，然后包埋入固体石蜡中，5um切片，42°C水浴展片，切片用苏木精、伊红染色后观察并 拍照。
[0063] 结果如图11所示，从图11可见，只注射生理盐水的小鼠肝脏并未发生任何病变 (图11A)，然而，致死量LPS攻击小鼠24小时肝脏表现出了急性损伤，如，中性类细胞浸润， 细胞密度降低，细胞间隙增大（图11B)。与只接受LPS攻击组小鼠相比，AWRK6治疗组小鼠 在治疗24小时之后，肝脏损伤明显降低（图11C)，表现为中性类细胞浸染数量相对较少，细 胞密度相对较高，细胞间隙相对较小，PMB治疗效果与之相似（图11D)。AWRK6治疗96小 时后，损伤更小，几乎恢复正常（图11E)，PMB治疗96小时后治疗效果略差于AWRK6,但也 基本恢复正常（图11F)。这些结果表明，AWRK6可以有效保护肝脏免遭LPS攻击。
[0064] (7)动物毒性分析
[0065] 为了检测高剂量AWRK6是否对小鼠有毒害作用，我们使用了 50mg/kg AWRK6,这是 本文试验中所使用的最高剂量的五倍剂量。小鼠腹腔注射该剂量AWRK6,每8小时记录小鼠 存活率，试验共进行七天。
[0066] 结果如图12所示，从图12可见，所有的小鼠在腹腔注射50mg/kg的AWRK6,7天后 10只小鼠全部存活，且存活状态与未经处理小组并无差异，这表明高剂量AWRK6对哺乳类 动物无明显毒性。
[0067] 以上实验结果充分表明，AWRK6能显著降低内毒素血症小鼠血清中内毒素、IL-8 和TNF-α含量，这一结果与前期的体外试验结果相一致。更重要的是，AWRK6能有效地保 护肝脏免遭致死量LPS的攻击，能有效的保护小鼠免于LPS所诱发的急性死亡。这些结果 均表明AWRK6在治疗败血症方面展现出很好的潜能，且与阳性对照PMB相比，AWRK6无论在 中和内毒素，降低炎症因子释放还是保护内毒素血症小鼠免遭死亡方面，在一定浓度下，都 表现出更强的活性。此外，AWRK6对哺乳类腹腔巨噬细胞无毒副作用，且高剂量的AWRK6对 哺乳动物也无毒害作用，这对AWRK6治疗由于内毒素引起的败血症方面展现出了很好的应 用潜能。
【权利要求】
1. 抗菌肽AWRK6在制备治疗败血症药物中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：抗菌肽AWRK6在制备治疗内毒素引起的败 血性休克药物中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：抗菌肽AWRK6中和内毒素。
4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：抗菌肽AWRK6抑制由内毒素所诱导的炎症 因子的释放。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的炎症因子是TNF-α和IL-8。
6. 如权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：抗菌肽AWRK6的有效剂量为2-10mg/ kg/ 天。
7. 如权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述的抗菌肽AWRK6的序列是 SffVGKHGKKFGLKKHKKH〇
【文档编号】A61P31/04GK104147589SQ201410345566
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】王秋雨, 王欢, 金莉莉, 王铮 申请人:辽宁大学