技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及当归补血汤在制备促进骨髓细胞黏附能力的药物方面的应用。
背景技术：
当归补血汤，出自金元四大家之一李杲的《内外伤辨惑论》卷中，方剂组成为黄芪一两，当归两钱，具有补气生血之功效，主治劳倦内伤，气血虚弱，阳浮于外，肌肤燥热，面红目赤，烦渴引饮，脉洪大而虚，以及妇人经行、产后血虚发热头痛，或疮疡渍后久不愈合者。该方的应用已有800多年的应用历史，临床疗效显著，特别是对放化疗引起的骨髓抑制又很好的缓解作用。
陈玉春等在《当归补血汤补血作用机理的探讨》中提出，当归补血汤能显著促进正常小鼠SCM和LCM中及血虚小鼠SCM中CSFs的产生。当归促进，而黄芪显著抑制正常小鼠SCM中CSFs生成。结果揭示当归补血汤的补血活血作用与其刺激CSFs分泌有关，且系当归的作用所致。金若敏等提出当归补血汤能显著增加血虚模型小鼠的红细胞、白细胞数；侯火明等在《当归补血汤治疗贫血机制研究进展》中提出，当归补血汤能刺激骨髓造血祖细胞，从而有可能增强粒系、单核巨噬细胞的生长、成熟与释放，而达到生血补血的作用；已有文献报道，当归补血汤能够升高外周血中红细胞和骨髓组织中BFU-E和CFU-E祖细胞的数量。
骨髓是机体的主要造血器官，骨髓中的造血干细胞通常处于休眠状态，并通过不对称有丝分裂(即一个造血干细胞产生的两个子代细胞中，一个分化为造血祖细胞，并进一步分化为成熟的血细胞；另一个则仍然保持造血干细胞的特征)来保持体内造血干细胞数量的恒定，以维持机体的终身造血功能。
造血干细胞在骨髓中的分布不是随机分布的，而是根据其成熟阶段的不同而存在于不同的微环境中。这种微环境是有不同的骨髓基质细胞、充填在细胞之间的细胞外基质和进入骨髓的血管和神经组成。造血微环境的不同成分可通过多种机制对造血进行正性和负性调控，主要作用方式可分为三种，细胞与细胞间的接触、细胞外基质与细胞相互作用和细胞因子对细胞的作用。
骨髓基质细胞是一种复杂的细胞群体，包含有成纤维细胞、网状细胞、内皮细胞、脂肪细胞和破骨细胞等。骨髓基质细胞与造血干细胞之间的直接接触可以起到固定造血干细胞和直接传递造血信号的作用。在造血细胞表面已发现20多种黏附受体，包括钙黏素、整合素、选择素和免疫球蛋白家族成员等，它们的配体主要是细胞外基质成分和基质细胞表面黏附分子。黏附受体与相应配体的相互作用能激活细胞内多种信号转导通路，产生特异的细胞效应。造血系统内的细胞黏附作用调节造血过程中的多种生物学行为，包括造血干祖细胞在造血组织内的归巢、居住和迁移，成熟血细胞从造血器官释放如外周血，造血干祖细胞的生存、生长和命运。
已有文献报道，主要有破骨细胞组成的造血微环境，能够保持干细胞处在慢速分裂状态并抑制其分化，其调节作用主要是通过细胞与细胞之间的直接接触、生长因子和细胞因子来协调完成；主要有内皮细胞、网状细胞等组成的造血微环境，能够促进造血干细胞的分裂，内皮细胞表面高表达黏附分子：E选择素和VCAM-1。内皮细胞表面的黏附分子P、E选择素和VCAM-1能够通过与造血干细胞表面的PSG-1配体接触来促进造血干细胞的归巢。造血干细胞可通过选择性的表达细胞表面分子来调节与造血微环境作用的强弱，造血微环境中的基质细胞可通过表达细胞黏附分子、基质蛋白和生长因子等来调节造血干细胞的生长状态，有研究表明甲状旁腺素可通过增加破骨细胞表面CXCL-12的表达来促使造血干细胞保留造血壁龛中。造血干细胞膜表面的络氨酸激酶受体Tie2通过与破骨细胞表面的Ang-1接触来控制造血干细胞处在休眠期。B祖细胞的分化受到基质细胞表面VCAM-1和祖细胞表面α1β2整合素相互接触的影响。综上所述。造血干细胞与骨髓基质细胞之间可通过直接接触来传递造血调控的正负信号，来保持体内造血干细胞数目的恒定和成熟血细胞的持续产生。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是填补古方当归补血汤的应用技术不足，提供当归补血汤在制备促进骨髓细胞黏附能力的药物方面的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供当归补血汤在制备增强骨髓细胞聚集能力药物方面的应用。
提供当归补血汤在制备增加骨髓基质细胞贴壁能力药物方面的应用。
为进一步保证新应用的技术效果，本发明提供了原材料的不同产地对应用效果的影响作用。优选地，所述当归补血汤上述应用中，本发明独辟蹊径，为保证当归补血汤上述应用效果的稳定性，进一步精确研究了不同产地黄芪和当归的配伍在所述应用方面的不同效果。结果表明，以来自于中国内蒙古产的黄芪和中国云南产当归的配伍或来自于中国甘肃产的黄芪和中国甘肃产的当归的配伍所得当归补血汤，在制备增强骨髓细胞聚集能力药物方面的应用效果较佳，尤以甘肃产黄芪和甘肃产当归的配伍所得当归补血汤在制备增强骨髓细胞聚集能力药物方面的应用效果最为显著。
本发明的有益效果如下：
本发明突破现有技术关于当归补血汤具有对骨髓基质细胞的增殖作用的技术偏见，提供了当归补血汤在增强骨髓细胞聚集能力和/或增加骨髓基质细胞贴壁能力方面的新应用，为进一步保证新应用的技术效果，本发明提供了原材料的不同产地对应用效果的影响作用。本发明关于当归补血汤增强骨髓细胞聚集能力的研究成果有助于更好地解释当归补血汤发挥药效的作用机制，并从整体调节和多靶点角度更科学的指导临床用药，以更精准的进行个体化治疗；有助于了解骨髓基质细胞体外的生活特性，以满足以骨髓基质细胞作为饲养层细胞体外长期培养和扩增造血干细胞的需要，并进一步为造血干细胞回输治疗的应用提供保障。
附图说明
图1不同处理组小鼠骨髓细胞聚集情况。A、统计图；B、正常组；C、模型组；D、低剂量组；E、中剂量组；F、高剂量组；G、EPO组。
图2不同浓度当归补血汤对骨髓基质细胞的作用。
图3当归补血汤促骨髓基质细胞增殖能力。
图4当归补血汤对细胞周期的影响。
其中A贴壁细胞；B悬浮细胞；C对照组贴壁细胞；D中药组贴壁细胞；E对照组悬浮细胞；F中药组悬浮细胞。
图5不同批次当归补血汤指纹图谱。
图6当归补血汤共有图谱。
图7不同产地当归补血汤促进骨髓基质细胞贴壁能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原料为常规市购或商业途径获得的原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1
试验材料：当归和黄芪购自广州致信中药饮片有限公司；IMDM(Hyclone)；胎牛血清(BI)；Hoechst33342(sigma)。
试验方法：
1、骨髓抑制小鼠模型制备及给药
把30只小鼠按体重采用“均衡随机”法分为正常组、骨髓抑制模型组、当归补血汤低剂量组、当归补血汤中剂量组、当归补血汤高剂量组和EPO组，每组5只。除正常组外其它组小鼠连续腹腔注射阿霉素3天，给药剂量为4mg·kg-1·d-1，正常组给予同等体积的生理盐水。注射阿霉素3天后，当归补血汤低、中、高剂量组分别连续腹腔注射当归补血汤5天，给药剂量分别为5g·kg-1·d-1、15g·kg-1·d-1和25g·kg-1·d-1，正常组和模型组给予同等体积的生理盐水。
2、骨髓单个核细胞悬液制备
(1)小鼠处死后用75％乙醇浸泡3-5min，后放置于超净台内消毒盘上。
(2)用眼科镊小心捏起小鼠髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节出剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将他们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。
(3)小心剥离肌肉，分别剪下股骨和胫骨，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。
(4)用1mL注射器吸取1mLPBS(含5％胎牛血清)，对准骨髓腔把骨髓细胞冲出，直至骨髓腔变白(大约3-4次)，后用1ml注射器反复吹打骨髓悬液3次，滤网过滤制备骨髓单细胞悬液。
(5)室温300g，5min，弃上清，用1mLIMDM(10％FBS，50/50u/ml青霉素/链霉素)重悬。
3、骨髓细胞黏附检测
(1)调骨髓细胞密度至1×108个/mL，取100μL细胞悬液加到5mLPBS溶液.
(2)300g离心5min，弃上清，细胞沉淀用1mLPBS重悬
(3)加10μL浓度为1mg/mL的Hoechst33342活体荧光燃料
(4)37℃避光，空气振荡器上，80rpm振荡90min。
(5)流式细胞仪检测细胞之间的粘聚集状况，激发波长采用405nm，检测波长为450nm。
实验结果见附图1所示，由附图1可见，当归补血汤中剂量和高剂量组聚集细胞的数目与模型组相比明显升高，具有显著差异(P＜0.05)。此结果提示我们当归补血汤能够增加骨髓细胞之间的聚集能力，从而增加骨髓细胞之间的直接通讯，从而调控造血干细胞和祖细胞的增殖和分化。
实施例2
试验材料：当归和黄芪购自广州致信中药饮片有限公司；IMDM(Hyclone)；胎牛血清(BI)；牛血清白蛋白(Prospec)；双抗(BI)；MTT(Sigma)；PI(Invitrogen)。
试验方法：
1、骨髓单个核细胞悬液制备(同实施例1方法)。
2、当归补血汤最佳作用浓度
取步骤所得骨髓单细胞悬液1，用含10％胎牛血清的IMDM培养基调细胞密度为1×106个/mL，接种于96孔板中，每孔50μL，后加入不同浓度的当归补血汤50μL，使终浓度分别为500、1000、2000、4000和8000μg/mL，每组重复3个复孔，在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养，每隔3天半数换液，每培养3天于倒置显微镜下观察细胞形态，培养7天后MTT法检测细胞数目。
3、当归补血汤促骨髓基质细胞增殖能力
取步骤1所得骨髓单细胞悬液，用含10％胎牛血清的IMDM培养基调细胞密度为1×106个/mL，接种于96孔板中，每孔50μL，后加入不同浓度的当归补血汤50μL，使终浓度分别为0、1000μg/mL，每组重复3个复孔，在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养，每隔3天半数换液，每培养3天于倒置显微镜下观察细胞形态，培养7天后每隔1天利用MTT法连续检测细胞数目。
4、骨髓细胞细胞周期检测
取步骤1所得骨髓单细胞悬液，用含10％胎牛血清的IMDM培养基调细胞密度为1×106个/mL，接种于6孔板中，每孔1mL，后加入不同浓度的当归补血汤1mL，使终浓度分别为0、1000μg/ml，每组重复3个复孔，在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养，每隔3天半数换液，每培养3天于倒置显微镜下观察细胞形态，培养7天后利用流式细胞仪分别检测贴壁细胞和悬浮细胞细胞周期。
5、MTT法检测细胞数目
骨髓基质细胞培养7天后，按10∶1(v/v)的比例每孔加入MTT(5mg/mL)，细胞培养箱孵育4h，直接加入改进的SDS溶液对甲臜进行溶解，24h后用酶标仪测570nmOD值。
6、细胞周期检测
(1)取骨髓单个核细胞，300g，5min，弃上清，2mLPBS重悬。
(2)加入3mL预冷的70％的乙醇(边加边振荡)，混匀后4℃固定过夜。
(3)取上述固定细胞，300g，5min，弃上清。
(4)5mLPBS重悬细胞，300g，5min，弃上清。
(5)500μL的PI染液重悬细胞。室温避光染色30min，流式检测。
试验结果如下：
不同浓度当归补血汤对骨髓基质细胞的作用见附图2至图7所示，当归补血汤在体外能够增加骨髓基质细胞的细胞数目，在低剂量浓度时促进效果同药物浓度成剂量依赖关系，随着药物浓度的升高细胞数目增加，但随着药物浓度的进一步增加，促进效果成下降趋势，在药物浓度为1000μg/mL时促进效果最为明显，因此选择1000μg/mL作为后续研究的药物浓度。
当归补血汤能够使骨髓基质细胞体外培养时细胞数目增加，其可能是通过促进细胞的分裂增殖来实现的。为了进一步验证上述假设，下面通过检测骨髓基质细胞体外培养时的生长曲线和细胞周期的变化情况来探讨当归补血汤促骨髓基质细胞数目增加的确切机制。
细胞生长曲线能够反应细胞体外生长速度的快慢，生长速度越快斜率越大，OD值越高。通过比较对照组和当归补血汤组细胞生长曲线的不同，可以进一步证实当归补血汤是否能够促进骨髓基质细胞的分裂。
由附图3可见，通过观察骨髓基质细胞体外从第七天到第十二天的生长曲线，发现当归补血汤组骨髓基质细胞的数目在同一培养时间高于对照组。当归补血汤能够在体外促进骨髓基质细胞数目的增加，这与本发明人的分析和前述实验结论是一致的；同时比较对照组和当归补血汤组生长曲线的斜率发现，两组生长曲线的斜率基本相当，当归补血汤组只是在第八天到第九天斜率有所升高，本发明实验结果与现有关于当归补血汤是通过促进骨髓基质细胞的分裂来达到增加其细胞数目的推论是相矛盾的，改变了现有推论带给本领域错误的技术指引。为了进一步验证当归补血汤是否能够促进骨髓基质细胞在体外的分裂，我们进一步通过流式细胞仪来检测骨髓基质细胞细胞周期的变化情况来验证。
当药物能够促进细胞的分裂增殖时，处于S期和G2M期的细胞数目会增多，因此可通过流式细胞仪来检测处于不同分裂期细胞数目的比例，来判断细胞分裂能力。骨髓细胞在体外培养时，一部分细胞会贴壁生长，另一部分细胞在处于悬浮状态，贴壁生长的细胞主要是骨髓基质细胞，主要是调控造血祖细胞的增殖和分化能力，悬浮细胞中包含造血祖细胞，能够分化为成熟的血细胞。为了更好地分析当归补血汤的作用机制，在检测细胞周期时，把贴壁细胞和悬浮细胞分开来测定。
试验结果见附图4，由附图4可见，当归补血汤对贴壁细胞的细胞周期无影响，当归补血汤组和对照组G1期细胞比例和S、G2M期细胞比例无显著差异(见图4A、C、D)，此结果与生长曲线测定结果相一致，说明当归补血汤对骨髓基质细胞的增殖无促进作用，因此骨髓基质细胞的细胞数目增加与细胞增殖无关，考虑到骨髓基质细胞是一种混合细胞，进一步推测骨髓基质细胞数目的增多，是和骨髓基质细胞贴壁能力的增加有关，但具体是那一种黏附因子有待进一步验证；同时发现当归补血汤对悬浮细胞细胞周期有影响，G1期细胞比例给药组明显低于对照组(P＜0.05)，S期和G2M期细胞比例给药组明显高于对照组(P＜0.05)(见图4的B、E、F小图)，此结果说明当归补血汤能够促进体外培养悬浮细胞的细胞增殖。
实施例3不同产地当归补血汤促骨髓基质细胞增殖能力研究试验
试验材料：当归和黄芪购自广州致信中药饮片有限公司；IMDM(Hyclone)；胎牛血清(BI)；牛血清白蛋白(Prospec)；双抗(BI)；MTT(Sigma)；PI(Invitrogen)；甲醇、乙腈、乙酸、乙醇均为HPLC级试剂，购自美国Fisher公司。
试验方法：
1、当归补血汤提取
(1)称取100g黄芪和20g当归饮片，按5∶1的配伍比例混合。
(2)后加8倍体积的去离子水，煮沸回流提取2h，八层纱布过滤。
(3)残余药渣用相同方法重新提取一次。
(4)过滤后合并两次提取液，用旋转蒸发仪浓缩药液至1g/mL生药的水提液，避光4℃保存备用。
2、不同产地样品提取。
分别取不同产地的黄芪和当归进行不同的组合分别进行提取后进行相关试验。为免赘述，本实施例以甘肃(G)、陕西(S)和云南(Y)产当归，与甘肃(G)和内蒙古(N)产黄芪，两两组合，按照步骤1所述提取方法进行提取。
(一)HPLC样品制备
(1)取上述当归补血汤提取液150μL，加入无水乙醇350μL，充分混匀。
(2)12000g离心10min，吸取上清300μL，加入700μL去离子水，冻干机冻干。
(3)加入300μL溶解液溶解，0.22μm滤膜过滤，取10μLHPLC分析。
(二)色谱条件
色谱柱：AgilentTC-C18(4.6×150mm，5μm)
柱温：35℃
流动相：A：甲醇-水-冰乙酸(5∶95∶0.1，V/V/V)，B：甲醇-水-冰乙酸(95∶5∶0.1，V/V/V)
流速：0.5ml/min
上样量：10μL
梯度洗脱条件参照表1：
表1
线性梯度程序表
(三)骨髓单个核细胞悬液制备(同实施例1方法)
(四)当归补血汤促骨髓基质细胞增殖能力
取制得的骨髓单细胞悬液，用含10％胎牛血清的IMDM培养基调细胞密度为1×106个/mL，接种于96孔板中，每孔50μL，后加入不同产地的当归补血汤50μL，使终浓度分别为1000μg/ml，每组重复3个复孔，在37℃、5％CO2及饱和湿度下培养，每隔3天半数换液，每培养3天于倒置显微镜下观察细胞形态，培养7天后每隔1天利用MTT法连续检测细胞数目。
实验结果：
长期以来，当归补血汤研究领域并未见关于原料的产地方面的相关研究成果。本发明人分析，不同产地黄芪和当归，由于生长环境的不同，造成其组成化学成分的不同，而其化学组成成分决定了其药效的强弱。为了更全面地建立当归补血汤的质控标准，本发明利用高效液相色谱分析了不同产地所得6种当归补血汤的指纹图谱。以下是本发明利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A”软件对6种当归补血汤的指纹图谱进行了分析和举例说明。结果表明，六种当归补血汤指纹图谱的相似性很高，见图5所示，与对照指纹图谱相比相似度均高于0.933，其中甘肃产黄芪和陕西产当归所得当归补血汤与对照指纹图谱的相似度最低为0.933，内蒙古产黄芪和陕西产当归所得当归补血汤与对照指纹图谱的相似度最高为0.996，见表2所示。并进一步建立了6种当归补血汤的共有指纹图谱，可很好地作为当归补血汤的质控标准，见图6所示。
进一步分析了6种当归补血汤共有峰的数目和峰面积，通过保留时间来确定共有峰。结果表明，6种当归补血汤共检测到了38个色谱峰，其中共有峰17个，各共有峰峰面积占总峰面积的百分比变化较大，其中7号共有峰峰面积的变异系数达37.38％，最低的8号峰的变异系数也达到了12.63％，见表3所示。以上分析和试验结果表明，虽然6种当归补血汤指纹图谱的整体性相似度很高，但具体的个别峰仍存在很大的差异。
表26批供试品指纹图谱与对照图谱的相似度
表3供试品共有色谱峰
试验结果见附图7所示，由附图7可见，所有批次当归补血汤都能够促进骨髓基质细胞贴壁能力，其中GG批次促贴壁能力最强，与其它批次相比具有显著差异(P＜0.05)。