技术领域本发明涉及龙虎人丹的晕动模型的构建方法，具体涉及龙虎人丹在晕动模型及正常大鼠体内药代动力学研究。
背景技术：
晕动(motionsickness,MS)是指当人或动物所处环境的直线或角加速度改变时出现的一系列植物神经功能紊乱症状，表现为眩晕、恶心、呕吐、冷汗、苍白等。传统中药，特别是中药复方在晕动的防治方面具有独特的思维和实践优势。关于龙虎人丹在晕动模型动物下的药代动力学方面的研究还没有相关报道，其吸收进入体内的成分不清楚，不利于确定其产生药效的物质基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供龙虎人丹的晕动模型的构建方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本研究中采用晕动模型大鼠进行龙虎人丹的药动学研究，为龙虎人丹的药效物质的确定提供帮助；并同时设正常对照组，观察病理状态龙虎人丹的药动学规律的变化。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：龙虎人丹的晕动模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)动物的准备：清洁级的大鼠；步骤(1)中，所述大鼠选用Wistar大鼠250±20g，饲养室温度为23±2℃，湿度为60±5％，12h明暗循环，动物适应环境3天后，于实验前禁食12h，自由饮水。步骤(2)晕动模型的建立：动物适应性饲养3d后，无束缚地放入动物晕船模拟器中进行模拟晕船刺激，即顺时针方向以加速度16°/s2，从速度为0加速至120°/s，然后立即以48°/s2减速至0，停一秒后，马上逆时针方向再以加速度16°/s2从速度为0加速至120°/s，然后以48°/s2减速至0，如此反复每天持续刺激动物120min。以粪便颗粒数和行为变化为判断造模成功标准；步骤(3)给药与样品采集；取晕动模型大鼠18只，随机分组为晕动高、中、低三个剂量组，每组6只；并设正常高剂量对照组6只，禁食12h；步骤(3)中，低剂量组灌胃给药龙虎人丹0.115g/kg；中剂量组灌胃给药龙虎人丹0.23g/kg；高剂量组灌胃给药龙虎人丹0.92g/kg。步骤(3)中，灌胃给药后4小时提供食物，整个过程禁食不禁水。于给药前和给药后2min，5min，15min，30min，1h，2h，4h，12h，24h，48h眼底静脉丛取血，4℃6,000×g离心10min得到血浆后，分取上层血浆100μl，置于-80℃冰箱中保存，待测。步骤(4)样品测定：血浆按上述建立的LC-MS/MS及HS-SPDE-GC-MS/MS方法进行测定，同时进行质量控制，每个分析批生物样品测定时建立随行标准曲线，并进行三浓度质控样品分析，质控样品CV<15％作为当日数据是否接受的标准；步骤(5)药代动力学分析与统计分析：通过每测定批次的随行标准曲线来计算相应批次中有效成分的血浆药物浓度，所得浓度-时间数据。步骤(5)中，所述数据使用WinNonlin软件Build6.1.0.173，PharsightCorporation，MO，USA，采用非房室模型计算Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-∞、t1/2、CL/F、Vd/F、MRT0-∞药代动力学参数。本发明的有益效果：本研究采用建立的龙虎人丹中8种非挥发性成分液相色谱-质谱分析LC-MS/MS及4种挥发性成分气象色谱-质谱分析HS-SPDE-GC-MS/MS生物样品分析方法，研究了龙虎人丹在正常及晕动大鼠体内的药动学研究规律。本发明结果可为理解龙虎人丹的抗晕动的药效物质的提供帮助。附图说明图1正常大鼠口服高剂量(0.92g/kg)(●)和晕动症大鼠口服高剂量(■)、中剂量(▲)和低剂量(×)(0.92,0.115,0.23g/kg)龙虎人丹后儿茶素、表儿茶素、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、胡椒碱和甘草次酸的血药浓度-时间曲线图。图2正常大鼠口服高剂量(0.92g/kg)(●)、晕动症大鼠口服高剂量(■)、中剂量(▲)和低剂量(×)(0.92,0.23,0.115g/kg)龙虎人丹片后樟脑、薄荷脑、异龙脑和龙脑的血药浓度-时间曲线图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。实施例11.材料与方法1.1.动物清洁级Wistar大鼠(250±20g)由上海中医药大学实验动物中心提供。饲养室温度为23±2℃，湿度为60±5％，12h明暗循环，动物适应环境3天后，于实验前禁食12h，自由饮水。1.2.晕动模型的建立动物适应性饲养3d后，无束缚地放入动物晕船模拟器中进行模拟晕船刺激，即顺时针方向以加速度16°/s2，从速度为0加速至120°/s，然后立即以48°/s2减速至0，停一秒后，马上逆时针方向再以加速度16°/s2从速度为0加速至120°/s，然后以48°/s2减速至0，如此反复每天持续刺激动物120min。以粪便颗粒数和行为变化为判断造模成功标准。1.3.给药与样品采集取晕动模型大鼠18只，随机分组为晕动高、中、低三个剂量组，每组6只；并设正常高剂量对照组6只，禁食12h。低剂量组灌胃给药龙虎人丹0.115g/kg；中剂量组灌胃给药龙虎人丹0.23g/kg；高剂量组灌胃给药龙虎人丹0.92g/kg。灌胃给药后4小时提供食物，整个过程禁食不禁水。于给药前和给药后2min，5min，15min，30min，1h，2h，4h，12h，24h，48h眼底静脉丛取血，4℃6,000×g离心10min得到血浆后，分取上层血浆100μl，置于-80℃冰箱中保存，待测。1.4.样品测定血浆按上述建立的LC-MS/MS及HS-SPDE-GC-MS/MS方法进行测定。同时进行质量控制，每个分析批生物样品测定时建立随行标准曲线，并进行三浓度质控样品分析，质控样品CV<15％作为当日数据是否接受的标准。1.5.药代动力学分析与统计分析通过每测定批次的随行标准曲线来计算相应批次中有效成分的血浆药物浓度，所得浓度-时间数据使用WinNonlin软件(Build6.1.0.173，PharsightCorporation，MO，USA)，采用非房室模型计算Cmax、Tmax、AUC0-t、AUC0-∞、t1/2、CL/F、Vd/F、MRT0-∞等药代动力学参数。2.结果2.1LC-MS/MS部分晕动模型大鼠和正常大鼠灌服龙虎人丹后血浆浓度-时间曲线见图1，各成分的药动学参数见表1—8。MS(L)、MS(M)、MS(H)分别为晕动低剂量组，晕动中剂量组和晕动高剂量组。结果表明，儿茶素、表儿茶素、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、胡椒碱和甘草次酸等成分吸收进入血中，其中甘草次酸的体内暴露水平最高。甘草次酸和胡椒碱在模型3个剂量组和正常组、甘草素和异甘草素在模型高及中剂量组和正常组、而儿茶素、表儿茶素、甘草苷、异甘草苷仅在模型高剂量组和正常组可以绘制出C-T曲线。儿茶素、表儿茶素、甘草苷、异甘草苷吸收快，在1h内达峰，消除快，t1/21-3h左右；甘草素、异甘草素吸收也快，在10min左右达峰，但在3h左右出现第2峰，具有双峰现象，消除略慢，t1/24-6h左右；胡椒碱吸收快，1h内达峰，消除略慢，t1/25h左右；甘草次酸达峰较迟，可能与其需肠菌转化而来有关，消除在所有成分中最慢，t1/26-10h左右。结果也表明，在晕动状态下，异甘草苷在体内的暴露量降低。图1正常大鼠口服高剂量(0.92g/kg)(●)和晕动症大鼠口服高剂量(■)、中剂量(▲)和低剂量(×)(0.92,0.115,0.23g/kg)龙虎人丹后儿茶素、表儿茶素、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、胡椒碱和甘草次酸的血药浓度-时间曲线图。表1正常大鼠和晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(19.65mg/kg)后儿茶素的药动学参数(n＝6.Mean±SD)表2正常大鼠和晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(7.30mg/kg)后表儿茶素的药动学参数(n＝6.Mean±SD)表3正常大鼠和晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(2.07mg/kg)后甘草苷的药动学参数(n＝6.Mean±SD)表4正常大鼠和晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(0.59mg/kg)后异甘草苷的药动学参数(n＝6.Mean±SD)*P<0.05vsControlgroup表5正常大鼠单次灌胃龙虎人丹(0.23mg/kg)及晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(0.23、和0.06mg/kg)后甘草素的药动学参数(n＝6.Mean±SD)表6正常大鼠和晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(0.07mg/kg)后异甘草素的药动学参数(n＝6.Mean±SD)表7正常大鼠单次灌胃龙虎人丹(0.61mg/kg)及晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(0.61、0.15和0.08mg/kg)后胡椒碱的药动学参数(n＝6.Mean±SD)表8正常大鼠单次灌胃龙虎人丹(20.99mg/kg)及晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹片(20.99、5.29和2.62mg/kg)后甘草次酸的药动学参数(n＝6.Mean±SD)2.2GC-MS/MS部分晕动模型大鼠和正常大鼠灌服龙虎人丹后血浆浓度-时间曲线见图2，各成分的药动学参数见表9—12。MS(L)、MS(M)、MS(H)分别为晕动低剂量组，晕动中剂量组和晕动高剂量组。结果表明，在晕动模型3个剂量组和正常组大鼠，薄荷脑、异龙脑、龙脑等挥发性成分吸收进入血中，后两者可以产生代谢物樟脑。在正常大鼠和晕动大鼠体内，薄荷脑、异龙脑、龙脑吸收快，达峰时间短；异龙脑及龙脑能迅速代谢成樟脑，樟脑在4个成分中浓度最高。薄荷脑、异龙脑、龙脑等成分半衰期较长，在9-17h左右。在晕动状态下，樟脑在体内的暴露量增加，薄荷脑、龙脑及异龙脑的达峰时间缩短。图2正常大鼠口服高剂量(0.92g/kg)(●)、晕动症大鼠口服高剂量(■)、中剂量(▲)和低剂量(×)(0.92,0.23,0.115g/kg)龙虎人丹片后樟脑、薄荷脑、异龙脑和龙脑的血药浓度-时间曲线图表9正常大鼠和晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹后樟脑的药动学参数(n＝6.Mean±SD)-:无法计算*P<0.05vsControlgroup表10正常大鼠单次灌胃龙虎人丹(20.89mg/kg)及晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(20.89、5.22和2.61mg/kg)后薄荷脑的药动学参数(n＝6.Mean±SD)**P<0.01vsControlgroup表11正常大鼠单次灌胃龙虎人丹(5.25mg/kg)及晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(5.25、1.31和0.66mg/kg)后异龙脑的药动学参数(n＝6.Mean±SD)**P<0.01vsControlgroup表12正常大鼠单次灌胃龙虎人丹(8.94mg/kg)及晕动症大鼠单次灌胃龙虎人丹(8.94,2.23和1.12mg/kg)后龙脑的药代学参数**P<0.01vsControlgroup3.讨论本研究采用建立的龙虎人丹中8种非挥发性成分LC-MS/MS及4种挥发性成分HS-SPDE-GC-MS/MS生物样品分析方法，研究了龙虎人丹在正常及晕动大鼠体内的药动学研究规律。在晕动模型大鼠体内儿茶素、表儿茶素、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、胡椒碱和甘草次酸等非挥发性成分和薄荷脑、异龙脑、龙脑及代谢物樟脑等挥发性成分吸收进入血中。儿茶素、表儿茶素、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、胡椒碱、薄荷脑、异龙脑、龙脑吸收快，有利于迅速发挥药效，甘草次酸和薄荷脑、异龙脑、龙脑等成分半衰期较长，有利于疗效的维持。结果提示这些成分将会在体内作用于多个靶点，共同产生综合的抗晕动效应。本实验结果表明，在正常大鼠、晕动大鼠体内，甘草次酸在血浆中浓度最高，而甘草次酸在龙虎人丹中含量极少，但甘草酸进入体内后,在肠道微生物水解酶的作用下大量生成甘草次酸，使得甘草次酸的体内暴露水平在8种非挥发性成分中最高。甘草素及异甘草素产生双峰现象，可能均与肝肠循环有关。在晕动状态下，龙虎人丹中薄荷脑、龙脑及异龙脑达峰时间缩短，异甘草苷在体内的暴露量降低，樟脑在体内的暴露量增加。提示在晕动患者体内，薄荷脑、龙脑、异龙脑和异甘草苷的药代动力学发生了变化。本研究结果可为理解龙虎人丹的抗晕动的药效物质的提供帮助。以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。